超高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中敵百蟲的含量

查玉兵，楊春亮*，林 玲，李 濤，程盛華

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所， 廣東 湛江 524001)

超高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中敵百蟲的含量

查玉兵，楊春亮*，林 玲，李 濤，程盛華

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所， 廣東 湛江 524001)

建立敵百蟲在水產(chǎn)品中殘留量的超高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測(cè)定方法。用乙酸乙酯提取樣品中的敵百蟲，提取液經(jīng)酸性氧化鋁柱凈化，經(jīng)超高效液相色譜分離，用串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)，外標(biāo)法定量。在0.02～0.8ng/mL范圍內(nèi)，敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的色譜峰面積與質(zhì)量濃度成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9992；水產(chǎn)品中敵百蟲的添加回收率在89.0%～93.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～5.4%，檢出限為1.0μg/kg。方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，保留時(shí)間為1.5min。

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用；敵百蟲；水產(chǎn)品；殘留

敵百蟲屬有機(jī)磷脂類化合物，是一種低毒的廣譜殺蟲劑。敵百蟲在水產(chǎn)養(yǎng)殖中多用于防治魚體內(nèi)、外的寄生蟲病以及清除水中有害生物[1-3]。過(guò)量使用敵百蟲會(huì)造成殘留藥物污染，對(duì)人畜安全造成一定影響。最近的研究發(fā)現(xiàn)，敵百蟲作為膽堿能抑制劑除了具有急性毒性外，還可引發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)毒性及導(dǎo)致其他慢性毒性癥狀。動(dòng)物試驗(yàn)顯示，敵百蟲可引起腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡，但發(fā)生機(jī)制并不清楚[4]。

敵百蟲殘留分析方法已有許多報(bào)道，主要為氣相色譜法[5-7]和氣質(zhì)聯(lián)用法[8-11]，但由于敵百蟲熱穩(wěn)定性差，在氣相色譜分析過(guò)程中很容易發(fā)生分解，影響敵百蟲的定量分析。很少有用液質(zhì)聯(lián)用法分析敵百蟲殘留量[12-13]，特別是水產(chǎn)品中的敵百蟲殘留分析還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用液質(zhì)聯(lián)用分析水產(chǎn)品中的敵百蟲殘留量，分析步驟簡(jiǎn)單，靈敏度高，可完全滿足歐盟、美國(guó)FDA和日本等發(fā)達(dá)國(guó)家的限量要求。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鰻魚 送檢樣品。

甲醇(色譜純)、乙腈(分析純)、丙酮(分析純)、二氯甲烷(分析純)、甲酸(色譜純)、乙酸乙酯(分析純)；水為二次蒸餾水；酸性氧化鋁固相萃取柱(1000mg/6mL)；敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)品(95.0%)。

敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：稱取10mg的敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解于100mL容量瓶中，配成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用時(shí)根據(jù)需要以流動(dòng)相稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作液。

ACQUITY UPLCTM-TQD MS/MS系統(tǒng) 美國(guó)Waters公司；R205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；E120H超聲波清洗器 德國(guó)ELMA公司；MS3渦旋混合器 德國(guó)IKA公司；Milli-Q純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 提取

稱取2g(精確到0.01g)試樣于50mL具塞塑料離心管中，加乙酸乙酯15mL，再加入1g無(wú)水硫酸鈉，在混勻器上充分混勻2min，5000r/min離心5min，將上層乙酸乙酯溶液移至50mL濃縮瓶中，殘?jiān)右宜嵋阴?5mL，重復(fù)上述操作，合并兩次提取液，在40℃水浴減壓濃縮至約5mL，待凈化。

1.2.2 凈化

將酸性氧化鋁柱用5mL酸化乙酸乙酯活化，棄去流出液。將提取液過(guò)柱，用10mL試管收集，待樣液完全流出后，再向小柱中加入5mL乙酸乙酯淋洗，凈化液于40℃水浴減壓濃縮至干，加入1mL流動(dòng)相溶解，混勻，過(guò)0.2μm濾膜，供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.2.3 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：UPLC ACQUITY BEH (50mm×2.1mm，1.7μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸溶液(35:65，V/V)；流速：0.2mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5μL；離子源：ESI，正離子模式；毛細(xì)管電壓：4.0kV；離子源溫度：105℃；脫溶劑氣溫度350℃；脫溶劑氣流量：600L/hr；錐孔反吹氣流量50L/h；錐孔電壓：40V；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；離子對(duì)：m/z 259.4/109.1(定性離子對(duì))，m/z 259.4/221.1(定量離子對(duì))。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的選擇

農(nóng)藥殘留分析中對(duì)使用的溶劑要求是非常高的，即要求提取回收率高、雜質(zhì)干擾小、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好等。提取溶劑的選擇直接影響到提取效果的好壞，有機(jī)磷農(nóng)藥是親酯性化合物，易溶于有機(jī)溶劑。水產(chǎn)品中的敵百蟲主要用二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈等極性較大的溶劑進(jìn)行提取[14-17]，本實(shí)驗(yàn)選擇并比較丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈作為提取溶劑時(shí)的提取效率。結(jié)果表明：用乙酸乙酯和乙腈作為提取溶劑均能獲得較高的添加回收率。乙腈的提取效率高，雜質(zhì)干擾小，但是考慮到乙腈的毒性較大，對(duì)環(huán)境不友好，所以最終確定乙酸乙酯作為水產(chǎn)品中敵百蟲殘留分析的提取溶劑。

2.2 凈化條件的選擇

考慮到用乙酸乙酯提取水產(chǎn)品中殘留的敵百蟲時(shí)會(huì)將水產(chǎn)品中的脂肪一并提取出來(lái)。所以提取后必須選擇一種合適的凈化方法將提取液中的脂肪除去。經(jīng)過(guò)比較，最終確定酸性氧化鋁固相萃取小柱(1000mg/6mL)能夠很好地除去樣品中的脂肪。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量，可以消除基質(zhì)中其他組分對(duì)目標(biāo)分析物的干擾[18]。用流動(dòng)相準(zhǔn)確配制5、10、50、100、200ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在儀器測(cè)定條件下進(jìn)行分析，以被測(cè)組分峰面積(Y)對(duì)其質(zhì)量濃度(X)作工作曲線。結(jié)果表明，在0.02～0.8ng/mL范圍內(nèi)，敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的色譜峰面積與質(zhì)量濃度成良好的線性關(guān)系，其線性方程為Y =2230X＋2790(r=0.9992)。該測(cè)定條件下敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時(shí)間約為1.5min，以3倍信噪比計(jì)，最低檢出限為1.0μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)溶液離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子流圖Fig.1 Selected ion chromatogram of trichlorphon standard

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)

以不含敵百蟲的水產(chǎn)品樣品為本底，分別添加系列濃度的待測(cè)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液(添加水平分別為4、20、100μg/kg，進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定5次，添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，平均添加回收率為89.0%～93.8%，RSD為2.1%～5.4%。

表1 水產(chǎn)品中敵百蟲添加回收率和精密度(n=5)Table1 Recoveries and precisions of trichlorphon from fortified blank aquatic samples (n=5)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立的UPLC-MS/MS方法適用于魚、蝦、貝類等水產(chǎn)品中敵百蟲的殘留分析，具有簡(jiǎn)便快捷、靈敏度高等特點(diǎn)，添加回收率以及精密度均滿足殘留分析的要求[19-20]。

[1] 劉永, 楊長(zhǎng)志, 康慶賀, 等. 熱裂解氣相色譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中敵百蟲殘留量[J]. 分析實(shí)驗(yàn)室, 2008, 27(2): 119-122.

[2] 金天明, 孫曉輝. 敵百蟲對(duì)鯉魚的毒性與pH 值的關(guān)系初探[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2002, 17(5): 420- 422.

[3] 周炯林, 徐培渝. 有機(jī)磷農(nóng)藥遺傳毒性研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué): 衛(wèi)生學(xué)分冊(cè), 2007, 34(6): 339-344.

[4] LIU Chengyun, CHANG Ping an, WU Yijun. Trichlorfon induces apoptosis in SH-SY5Y neuroblastoma cells via the endoplasmic reticulum[J]. Chem-Biol Interact, 2009, 181(1): 37-44.

[5] 席紹峰. 荔枝中敵百蟲的氣相色譜分析[J]. 輕工標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量, 2002(5): 50.

[6] 楊昀, 劉玉林. 氣相色譜法同時(shí)測(cè)定敵百蟲和毒死蜱的含量[J]. 云南化工, 2004, 31(5): 41-42.

[7] 朱青青, 謝文, 丁慧瑛. 蜂蜜中多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的氣相色譜測(cè)定[J]. 理化檢驗(yàn): 化學(xué)分冊(cè), 2005, 41(7): 482-483.

[8] 于惹娟, 蔡友瓊, 李慶, 等. 氣相色譜-質(zhì)譜法研究敵百蟲在氣相色譜分析過(guò)程中產(chǎn)生的分解產(chǎn)物[J]. 色譜, 2006, 24(1): 23-25.

[9] FILLION J, SAUVE F, SELWYN J. Multiresidue method for the determination of residues of 251 pesticides in fruit and vegetables by gas chromatography/ mass spectrometry and liquid chromatography with fluorescence detection[J]. Journal of AOAC International, 2000, 83(3):698-713.

[10] 胡小鐘, 儲(chǔ)曉剛, 余建新, 等. 氣相色譜-質(zhì)譜法快速篩選測(cè)定濃縮蘋果汁中105種農(nóng)藥殘留量[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2003, 22(6): 26-28.

[11] 呂進(jìn)鋒. GC/MS外標(biāo)法檢測(cè)蔬菜中農(nóng)藥多殘留的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2006(8): 937-939.

[12] 劉琪, 孫雷, 張?bào)P. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肝中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的研究[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2010, 29(7): 747-750.

[13] 黃捷, 白桂昌, 呂軼峰. 快速高分離液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中敵百蟲殘留[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2010, 20(7): 1666-1669.

[14] GB /T5009. 161—2003 動(dòng)物性食品中有機(jī)磷農(nóng)藥多組分殘留量的測(cè)定[S].

[15] 張瑩, 黃志強(qiáng), 李擁軍. 氣相色譜法測(cè)定茶葉中多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量[J]. 色譜, 2001, 19(3): 273-275.

[16] 鄭軍紅, 龐國(guó)芳, 范春林, 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中128種藥物殘留[J]. 色譜, 2009, 27(3): 254-263.

[17] 劉瑩雯, 丁時(shí)超, 杜文, 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定煙草中有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留量[J]. 色譜, 2006, 24(2): 174-176.

[18] 張喬. 農(nóng)藥污染物殘留分析方法匯編[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社,1990: 131-133.

[19] POUCKE C V, PETEGH EM C V. Development and validation o f a multianalyte method for the detection of anabolic steroids in bovine urine with liquid chromatography- tandem mass spectrom etry[J]. J Chromatogr: B, 2002, 772(2): 211-217.

[20] CAI J, HENION J. Quantitative multi residue determination of agonists in bovine urine using on-line immunoaffinity extraction coupled column packed capillary liquid chromatography- tandem mass spectrom etry[J].J Chromatogr: B, 1997, 691(2): 357-370.

Determination of Trichlorphon Residues in Aquatic Products Using UPLC-MS/MS

ZHA Yu-bing，YANG Chun-liang*，LIN Ling，LI Tao，CHENG Sheng-hua
(1. Agricultural Products Processing Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Zhanjiang 524001, China)

A UPLC-MS/MS method was developed to determine trichlorphon residues in aquatic products. Trichlorphon residues in samples were extracted into ethyl acetate, defatted on an acidic alumina solid phase extraction column, separated by UPLC, measured by MS/MS in positive ion multiple reaction monitoring mode, and quantified by external standard method.Over the range of 0.02 to 0.8 ng/mL, an excellent linear relationship (r = 0.9992) between trichlorphon concentration and peak area was observed for the standard working solution of trichlorphon. The average spike recoveries for trichlorphon in blank samples ranged from 89.0 % to 93.8 %, with a RSD between 2.1% and 5.4%. The detection limit for trichlorphon was 1μg/kg.This method proved simple, rapid and accurate.

UPLC-MS/MS；trichlorfon；aquatic products；residues

TS207.5

A

1002-6630(2011)08-0278-03

2010-07-01

查玉兵(1977—)，男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥殘留分析。E-mail：zhayubing2008@126.com

*通信作者：楊春亮(1964—)，男，研究員，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩-mail：zjyangcl@yahoo.com.cn