基于DNA染料EMA的RT-PCR技術(shù)定量檢測海產(chǎn)品中病原性副溶血弧菌活細胞

祝儒剛，呂淑霞*，劉月萍，張 良

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.遼寧大學輕型產(chǎn)業(yè)學院，遼寧 沈陽 110036；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，遼寧 沈陽 110866)

基于DNA染料EMA的RT-PCR技術(shù)定量檢測海產(chǎn)品中病原性副溶血弧菌活細胞

祝儒剛1,2，呂淑霞1,3,*，劉月萍3，張 良3

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.遼寧大學輕型產(chǎn)業(yè)學院，遼寧 沈陽 110036；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，遼寧 沈陽 110866)

將一種DNA染料疊氮溴化乙錠(ethidium bromide monoazide，EMA)與實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)相結(jié)合，建立一種能選擇性定量檢測牡蠣中trh陽性副溶血弧菌活細胞的新方法。結(jié)果表明：使EMA成功插入死細胞DNA并且光解溶液中游離EMA的最佳曝光時間為20min；不抑制副溶血弧菌活細胞DNA擴增的最大EMA質(zhì)量濃度為2.0μg/mL；完全抑制熱致死細胞DNA擴增的最小EMA質(zhì)量濃度為1.0μg/mL；人工污染牡蠣樣品，不經(jīng)過富集，在2.0×103～2.0×107CFU范圍內(nèi)細胞數(shù)的常用對數(shù)值與Ct值之間呈嚴格的負相關(guān)性，并且純培養(yǎng)與人工污染牡蠣樣品的RT-PCR檢測限均為2×103CFU，即人工污染牡蠣樣品的RT-PCR檢測靈敏度為每克牡蠣樣品400個活細胞；凍融實驗表明，在溫度低于55℃的水浴中對冷凍海產(chǎn)品進行解凍時，凍融過程對副溶血弧菌活細胞幾乎沒有影響。該方法是一種快速、靈敏且能有效鑒別并定量檢測病原活細胞的新方法。

疊氮溴化乙錠(EMA)；實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)；海產(chǎn)品；副溶血弧菌；活細胞

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，它作為人類食源性致病菌能引起腸胃炎和敗血癥。副溶血弧菌廣泛分布于自然界，尤其以海產(chǎn)品攜帶率最高，因此副溶血弧菌是沿海一帶引起食物中毒和急性腹瀉的重要病原菌，近年來，我國尤其是南部沿海地區(qū)均有因食用副溶血弧菌引起食物中毒報道。目前，副溶血弧菌引起食物中毒的發(fā)生規(guī)模以及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢，已成為我國首要的食源性致病菌[1-2]。

目前的研究認為，副溶血弧菌產(chǎn)生的毒素有溶血素和尿素酶。其致病因子主要有耐熱直接溶血毒素(thermostabile direct hemolysin，TDH)、耐熱直接相關(guān)溶血毒素(TDH-related hemolysin，TRH)、不耐熱溶血毒素(thermolabile hemolysin，TLH)，分別由相關(guān)的tdh、trh和tlh基因編碼。TDH和TRH與副溶血弧菌的致病能力關(guān)系密切。臨床分離的副溶血弧菌中超過90%為tdh陽性菌株，而環(huán)境中食物感染的潛在致病菌均為trh陽性副溶血弧菌，而且由該菌引起的食物感染和中毒事件呈上升趨勢[3-5]?？焖贆z測和診斷是及早預(yù)防控制副溶血弧菌食物中毒的發(fā)生的關(guān)鍵。

隨著人們食品安全意識的提高，聚合酶鏈式反應(yīng)(ploymerase chain reaction，PCR)技術(shù)以其特異性強、靈敏度高等優(yōu)勢在食品安全控制和臨床診斷上得到越來越多的運用。實時定量PCR的出現(xiàn)，更是將PCR檢測技術(shù)提高到定量的水平，并且檢測靈敏度得到進一步提高[6-7]。然而，用PCR方法檢測病原性副溶血弧菌污染時，它不能區(qū)分所檢測到的副溶血弧菌是活細胞還是死細胞。因此，利用PCR選擇性擴增副溶血弧菌活細胞DNA面臨巨大挑戰(zhàn)。近年來，人們嘗試各種方法通過PCR技術(shù)僅僅檢測樣品中的活菌，例如mRNA的檢測，以及利用能夠與核酸共價結(jié)合的染料，這種染料能夠選擇性地滲透到死細胞內(nèi)部與細胞內(nèi)的DNA共價結(jié)合。在所有這些方法中，一種DNA插入型染料疊氮溴化乙錠(ethidium bromide monoazide，EMA)，展現(xiàn)出了很大的應(yīng)用潛力。許多研究[8-11]表明，EMA與PCR技術(shù)相結(jié)合，能夠成功地選擇性抑制樣品中死細胞的DNA擴增，以便于更加精確地檢測樣品中活菌細胞的存在。

目前，EMA與RT-PCR檢測技術(shù)相結(jié)合來檢測并定量海產(chǎn)品中病原性副溶血弧菌活細胞仍未見報道。本研究將EMA選擇滲透性和RT-PCR特異性和靈敏性相結(jié)合，從而建立一種快速、靈敏并能夠有效檢測并定量海產(chǎn)品中病原性副溶血弧菌活細胞的新方法。

1 材料與方法

1.1 菌種

實驗用標準菌株，副溶血弧菌ATCC17802，本實驗室保存。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

疊氮溴化乙錠 美國Sigma公司；LightCycler 480 SYBR GreenⅠ(cat. no. 04 707 516 001)、熒光染料試劑盒美國Roche Diagnostics公司；胰胨肉湯(蛋白胨2%，NaCl 4%，0.01%的結(jié)晶紫0.5%，pH9.0)；T1N3(1%蛋白胨，3% NaCl，2%瓊脂)瓊脂。

1.3 儀器與設(shè)備

1.4 副溶血弧菌細胞熱處理

取37℃、150r/min條件下過夜培養(yǎng)的副溶血弧菌菌懸液，10000r/min離心5min。菌體沉淀用0.85%生理鹽水洗兩次，懸浮于0.85%的生理鹽水中。取定量菌懸液梯度稀釋，測定每個梯度的OD600nm并進行平板計數(shù)。3次獨立實驗，每次獨立實驗3次重復(fù)。

調(diào)整菌懸液濃度為4×108CFU/mL，取0.5mL于離心管中，95℃水浴加熱10min，將經(jīng)過熱處理的0.5mL菌懸液冷卻至室溫后全部涂T1N3平板，37℃培養(yǎng)48h檢測是否仍有活菌存在。

1.5 完全抑制死細胞DNA擴增的最小EMA質(zhì)量濃度確定[12-14]

用ddH2O配制0.1mg/mL的EMA溶液，－20℃避光保存。將EMA(0.1mg/mL)分別加入裝有0.5mL熱致死副溶血弧菌菌懸液(4×108CFU/mL)的12支離心管中，使EMA終質(zhì)量濃度分別達到0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2μg/mL。不加EMA 的一管作為陽性對照，0.5mL生理鹽水(不含細菌細胞)做為陰性對照。充分混勻后，將離心管黑暗中室溫放置約5min，讓EMA充分滲透到死細胞內(nèi)部并插入到細胞內(nèi)DNA雙螺旋上。然后將離心管開蓋放置冰上，距離燈管16cm，曝光20min。

1.6 不抑制活細胞DNA擴增的最大EMA質(zhì)量濃度確定[15-16]

取EMA溶液(1mg/mL)分別加入裝有0.5mL活細胞菌懸液(4×108CFU/mL)的10支離心管中，使EMA終質(zhì)量濃度分別達到1、2、4、6、8、10、12、14、16μg/mL。充分混勻后，將離心管黑暗中室溫放置約5min。不加EMA的一管作為陽性對照，0.5mL生理鹽水(不含細菌細胞)做為陰性對照。然后將離心管開蓋放置冰上，距離燈管16cm，曝光20min。

1.7 EMA最佳曝光時間優(yōu)化

分別取0.5mL活細胞菌懸液(4×108CFU/mL)于9個離心管，加入4μL EMA使每管EMA(0.1mg/mL)終質(zhì)量濃度達到1.0μg/mL。充分混勻后，將離心管黑暗中室溫放置5min。然后將離心管開蓋放置冰上，距離燈管16cm，分別曝光0、5、10、15、20、15、30、35、40min。不加EMA的0.5mL活細胞菌懸液(4×108CFU/mL)做為陽性對照，0.5mL生理鹽水(不含細菌細胞)做為陰性對照。

1.8 RT-PCR鑒別死活細胞混合菌懸液中活細胞

完全一樣的9只離心管中分別加入0.25mL固定數(shù)量(2×107CFU)的熱致死細胞菌懸液與0.25mL變化數(shù)量(2×107、2 ×106、2 ×105、2 × 104、2 ×103、2 ×102CFU和20CFU)的活細胞菌懸液(生理鹽水洗滌2次)，混合均勻。另一組同樣9只完全相同的離心管，僅僅含有0.5mL變化數(shù)量(2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102CFU和20CFU)的活細胞菌懸液。第3組實驗，9只相同的離心管中分別加入0.25mL固定數(shù)量(2×107CFU)的活細胞菌懸液與0.25mL變化數(shù)量(2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102CFU和20CFU)的熱致死細胞菌懸液。

每只離心管中加入0.1mg/mL EMA，使其終濃度達到1.0μg/mL。將菌懸液在黑暗中室溫放置5min，然后將離心管開蓋放置冰上，距離燈管16cm曝光20min。

1.9 人工污染實驗

1.9.1 標準曲線制作[17-18]

取過夜培養(yǎng)的副溶血弧菌(ATCC17802)菌懸液，菌體用滅菌生理鹽水洗滌兩次，調(diào)整菌懸液濃度為4×108CFU/mL。稀釋10倍，得到菌濃度范圍4×107～4CFU/mL。

無菌操作，每個濃度取1mL分別接種49mL滅菌胰胨肉湯液體培養(yǎng)基，混勻。另一組實驗，牡蠣樣品來自當?shù)睾．a(chǎn)品零售市場，在無菌均質(zhì)袋內(nèi)，無菌操作剪碎5g樣品于44mL滅菌胰胨肉湯液體培養(yǎng)基，利用高效自動均質(zhì)器均質(zhì)，同樣方法每個濃度取1mL分別接種、混勻。

吸取每個樣品10mL，800r/min離心10min，除去牡蠣細胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管10000r/min離心10min收集菌體。將菌體重懸于0.5mL無菌水中，添加EMA，使其終質(zhì)量濃度達到1.0μg/mL。將菌懸液在黑暗中室溫放置5min，然后將離心管開蓋放置冰上，距離燈管16cm曝光20min。曝光后的混合菌懸液在10000r/min離心5min，收集菌體。倒掉上清液后將菌體重懸在0.5mL的無菌水中，10000r/min再次離心5min，收集菌體，倒掉上清液，再次重懸在50μL無菌水中。

為確保牡蠣樣品不含trh陽性副溶血弧菌，取1g樣品加入50mL胰胨肉湯培養(yǎng)基中，37℃、150r/min過夜培養(yǎng)后，取菌液做RT-PCR鑒定。

1.9.2 RT-PCR鑒別經(jīng)凍融后菌懸液中的活細胞

過夜培養(yǎng)的副溶血弧菌菌懸液，菌體經(jīng)生理鹽水洗滌后調(diào)整其濃度為4×108CFU/mL。無菌操作分別取5g牡蠣組織于6只完全相同的無菌均質(zhì)袋內(nèi)，吸取1mL上述菌液人工污染，－20℃保存7d。冷凍樣品分別在不同溫度水浴中解凍，4℃解凍1h，25℃解凍30min，37、55、75、95℃分別解凍5min。解凍后的牡蠣組織添加無菌水至50mL，高效自動均質(zhì)器均質(zhì)。取10mL均質(zhì)勻漿，如上述方法離心后將收集的菌體重懸在1mL無菌水中，取0.5mL經(jīng)梯度稀釋后涂T1N3平板，每個梯度涂3個平板，37℃培養(yǎng)3d后計數(shù)。剩余0.5mL菌懸液經(jīng)EMA(終質(zhì)量濃度1.0μg/mL)處理后進行RT-PCR擴增。1.10 DNA模板制備[19-20]

用TZ裂解液(2.0% Triton X-100，2.5mg/mL疊氮化鈉，0.1mol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.0)提取模板DNA。

經(jīng)EMA處理曝光后的菌懸液與等體積的2×TZ裂解液混勻，沸水浴10min后冷卻到室溫，10000r/min離心10min去掉菌體碎片沉淀，取上清液直接用作RT-PCR模板。

1.11 引物及RT-PCR擴增

實驗采用實時熒光定量PCR儀。病原性副溶血弧菌致病基因trh檢測引物上游(P1)為：5′-TTGCTTT CAGTTTGCTATTGGCT-3′；下游引物(P2)為：5′-GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC-3′，擴增片段長度為300bp。20μL的擴增體系包括：10μL熒光染料混合液，5μL模板DNA，上下游引物各1μL(1μmol/L)，3μL PCR級無菌水。RT-PCR反應(yīng)體系：94℃預(yù)變性10min，40個循環(huán)，每個循環(huán)94℃ 20s、55℃ 20s、72℃ 30s。每個RT-PCR反應(yīng)重復(fù)3次，得到平均Ct值和標準背離值。

1.12 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗，P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血弧菌熱處理

將菌懸液梯度稀釋，測定各梯度的OD600nm值，并取適量菌液涂平板，每個梯度設(shè)3個重復(fù)，37℃過夜培養(yǎng)，計算每個梯度的菌濃度。得到活菌的菌濃度隨OD600nm變化曲線，結(jié)果如圖1所示?？芍?，當OD600nm為0.7時，菌濃度為4×108CFU/mL。

圖1 副溶血弧菌濃度與OD600nm的標準曲線Fig.1 Concentration dependence of OD600nm values in Vibrio.parahaemoliticus suspension

95℃水浴處理副溶血弧菌菌懸液(OD600nm為0.7，菌濃度4×108CFU/mL)10min，冷卻至室溫后將0.5mL菌液完全涂T1N3平板，37℃培養(yǎng)48h，無菌落生長。因此，濃度為4×108CFU/mL的副溶血弧菌菌懸液在95℃水浴處理10min，可將所有副溶血弧菌細胞全部被殺死，平板計數(shù)為零。

2.2 最佳EMA曝光時間

圖2 激活和完全光解游離EMA的最佳曝光時間優(yōu)化Fig.2 Optimization of light exposure time to activate DNA-bound EMA and to achieve complete photolysis of free EMA

在RT-PCR中，當每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的熒光閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，定義為Ct值，熒光閾值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越少，擴增曲線向右移動，其Ct值越大；相反，起始拷貝數(shù)越多，擴增曲線向左移動，其Ct值越小。如圖2所示，陰性對照(不加模版)的Ct值是30.42±0.60。當活菌細胞濃度為4×108CFU/mL時，隨著曝光時間的延長，各樣品Ct值逐漸減小，在曝光時間為15min時，其Ct值為22.94±0.66。經(jīng)曝光以后，未被光解的游離EMA會與細胞裂解釋放出來的DNA共價結(jié)合，從而抑制RT-PCR擴增，導(dǎo)致Ct值增大。統(tǒng)計分析表明，當曝光時間大于等于15min時，各樣品的Ct值與陽性對照(22.44±0.56)沒有顯著差異(P＜0.05)。因此，為了使游離EMA完全曝光光解，選擇20min為最佳曝光時間。

2.3 不抑制活細胞DNA擴增的最大EMA質(zhì)量濃度

EMA的不同添加量對活菌RT-PCR擴增的抑制作用如圖3所示。隨著EMA質(zhì)量濃度的不斷增大，各樣品Ct值也逐漸增加，表明EMA質(zhì)量濃度足夠大時對活菌的RT-PCR擴增也有一定抑制作用。由圖3分析可知，當EMA質(zhì)量濃度小于等于2μg/mL時，樣品Ct值與陽性對照Ct值(為18.67±0.45，不添加EMA)不具有統(tǒng)計顯著差異性，此時EMA對活細胞RT-PCR擴增幾乎沒有抑制作用(P＞0.05)。然而，當EMA質(zhì)量濃度大于等于4μg/mL時，EMA對活細胞RT-PCR擴增具有顯著抑制作用，此時樣品Ct值與陽性對照具有統(tǒng)計顯著性差異(P＜0.05)。

圖3 不抑制活細胞DNA擴增的最大EMA質(zhì)量濃度優(yōu)化Fig.3 Optimization of maximum EMA amount without inhibitory effect on DNA amplification from viable cells

2.4 完全抑制死細胞DNA擴增的最小EMA濃度

如圖4所示，當EMA質(zhì)量濃度為0.8μg/mL或更高時，所得到的Ct值均大于等于28.30±0.41，此時的Ct值與陰性對照(28.76±0.63)不具有統(tǒng)計顯著差異性，其產(chǎn)物溶解曲線Tm值為75℃(數(shù)據(jù)未提供)，可能為引物二聚體(P＞0.05)。表明，此時死細胞DNA的RT-PCR被完全抑制。相反，當EMA質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6μg/mL時產(chǎn)物的溶解曲線Tm值均為81℃，此時的Ct值與陰性對照具有統(tǒng)計極顯著差異(P＜0.01)。此時，0.8μg/mL的EMA質(zhì)量濃度遠遠小于可以抑制活細胞RTPCR擴增的EMA質(zhì)量濃度2μg/mL，因此，為了能夠使死細胞DNA的RT-PCR徹底被EMA抑制，同時又不會抑制活細胞DNA的RT-PCR擴增，實驗中選擇EMA質(zhì)量濃度1.0μg/mL為完全抑制死細胞DNA RT-PCR擴增時EMA的最適質(zhì)量濃度。

圖4 完全抑制死菌細胞DNA擴增的最小EMA添加量的優(yōu)化Fig.4 Optimization of minimum EMA amount to inhibit DNA amplification completely from heat killed cells

2.5 RT-PCR鑒別死活細胞混合液中的活細胞

圖5 固定量的熱致死細胞與變化量的活細胞混合液中DNA的不同RT-PCR擴增Fig.5 Differential DNA amplification by RT-PCR in the mixtures of a constant number of heat-killed cells and a varying number of viable cells

由圖5可知，當EMA質(zhì)量濃度為1.0μg/mL時，在固定量的熱致死細胞(105CFU)與變化數(shù)量的活細胞(105、104、103、102、10CFU和1CFU)混合液中，熱致死細胞的DNA的RT-PCT擴增被完全抑制。而活細胞DNA的RT-PCR沒有受到影響，隨著細胞數(shù)量的增大，Ct值逐漸減小。對照樣品含105個熱致死細胞，不經(jīng)EMA處理，其Ct值(17.25±0.72)與不經(jīng)EMA處理且含相同活細胞數(shù)樣品的Ct值(17.34±1.01)幾乎相同。

而在固定量的活細胞(105CFU)與變化數(shù)量的熱致死細胞(105、104、103、102、10CFU 和 1CFU)混合液 DNA的RT-PCR擴增中，各樣品的Ct值沒有統(tǒng)計顯著差異性(P＞0.05)。這是由于EMA完全抑制了熱致死細胞DNA的RT-PCR擴增，而對活細胞DNA的RT-PCR擴增沒有影響。其Ct值與相同活細胞濃度下不經(jīng)EMA處理的對照樣品幾乎相同(圖6)。

圖6 固定量的活細胞與變化量的熱致死細胞混合液中DNA的不同RT-PCR擴增Fig.6 Differential DNA amplification by RT-PCR in the mixtures of a constant number of viable cells and a varying number of heat-killed cells

2.6 標準曲線

表1 純培養(yǎng)和人工污染牡蠣樣品的Ct值與菌落數(shù)關(guān)系Table 1 The relationship between CFU and Ct values in pure culture and artificially contaminated oyster samples

添加不同的活細胞數(shù)做人工污染，純培養(yǎng)和人工污染牡蠣樣品各Ct值以及RT-PCR陽性信號率如表1所示。由表可知，隨著人工污染細胞數(shù)的不斷增大(2～2×107CFU)，純培養(yǎng)(30.65±0.56～16.52±0.44)和牡蠣樣品(30.36±0.34～19.12±0.47)的Ct值逐漸減小。并且，相同的細胞數(shù)進行人工污染，牡蠣樣品的Ct值比純培養(yǎng)要高1～3個循環(huán)。根據(jù)RT-PCR的陽性信號率，該方法對于純培養(yǎng)和人工污染牡蠣樣品的RT-PCR檢測限均為2×103個活細胞，人工污染牡蠣樣品檢測限可以達到400個細胞/克牡蠣樣品。由圖7可知，在2×103～2×107個細胞范圍內(nèi)，純培養(yǎng)和人工污染牡蠣樣品的Ct值與細胞數(shù)的對數(shù)均具有很好的線性關(guān)系。

圖7 純培養(yǎng)和人工污染牡蠣樣品中副溶血弧菌細胞數(shù)的對數(shù)與RT-PCR反應(yīng)Ct值線性關(guān)系的標準曲線Fig.7 Standard curves showing the linear relationship between Ct values and Log CFU (3.3～7.3) of V. parahaemolyticus in pure culture and artificially contaminated oyster samples

2.7 RT-PCR研究人工污染凍-融牡蠣樣品中病原性副溶血弧菌細胞存活情況

圖8 RT-PCR檢測經(jīng)凍融后每克牡蠣組織中的病原性副溶血弧菌活細胞數(shù)Fig.8 The numbers of viable cells per gram of oyster tissue as a result of freezing and thawing determined by RT-PCR

1mL副溶血弧菌菌懸液(4×108CFU/mL)人工污染5g牡蠣組織，－20℃冷凍貯存7d后，在4℃水浴1h、25℃水浴30min、37℃和55℃分別水浴5min解凍時，通過平板計數(shù)和EMA RT-PCR測得的活細胞數(shù)的對數(shù)值與對照(不經(jīng)過冷凍，約6.8)沒有顯著性變化(P＞0.05)(圖8)。然而，在70℃水浴5min解凍時，平板計數(shù)和EMA RTPCR常用對數(shù)值分別下降至4.3和4.7。這可能是由于熱對一部分細菌的破壞作用，在不完全損壞細胞膜的情況下導(dǎo)致酶失活或者核糖體的降解。95℃解凍5min時，細菌細胞幾乎被完全殺死，平板計數(shù)和EMA RT-PCR都沒有檢測到活細胞的存在。

3 結(jié) 論

3.1 副溶血弧菌濃度為4×108CFU/mL時，激活和光解菌懸液中EMA的最佳曝光時間為20min，不抑制副溶血弧菌活細胞RT-PCR擴增的最大EMA質(zhì)量濃度是2μg/mL，完全抑制副溶血弧菌死細胞RT-PCR擴增的最小EMA濃度為1.0μg/mL。

3.2 人工污染牡蠣樣品，不經(jīng)過富集培養(yǎng)，接種細胞數(shù)的對數(shù)值與對應(yīng)人工污染樣品RT-PCR的Ct值之間具有嚴格的線性相關(guān)性，純培養(yǎng)與人工污染牡蠣樣品標準曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.9981和0.9952。純培養(yǎng)與人工污染牡蠣樣品的RT-PCR檢測限均為2×103CFU，即人工污染牡蠣樣品的RT-PCR檢測靈敏度為每克牡蠣樣品400個活細胞。

3.3 在溫度低于55℃的水浴中對冷凍海產(chǎn)品進行解凍時，凍融過程對副溶血弧菌活細胞基本沒有影響。

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Quantification of Pathogenic Viable Cells of Vibrio parahaemolyticus in Seafood by Ethidium Bromide Monoazide Staining and Real-time Polymerase Chain Reaction

ZHU Ru-gang1,2，LU Shu-xia1,3,*，LIU Yue-ping3，ZHANG Liang3
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China；2. College of Light Industry, Liaoning University, Shenyang 110036, China；3. College of Biological Science and Techology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

A new method for selectively quantitative detection of trh-positive viable cells of Vibrio parahaemolyticus in oysters was developed using ethidium bromide monoazide (EMA) staining in combination with real-time PCR (RT-PCR, real-time polymerase chain reaction). The results showed the optimum light exposure time to achieve DNA crosslinking by EMA in dead cells and to photolyze the free EMA in solution was 20 min. The use of 2.0μg/mL EMA or less did not inhibit the RT-PCR amplification of DNA derived from viable cells of Vibrio parahaemolyticus. The minimum amount of EMA to completely inhibit the RT-PCR amplification of DNA derived from heat-killed cells was 1.0μg/mL. In artificial contaminated oyster samples without enrichment process, there was a strict negative correlation between the log cell number and the Ct values in the range of 2.0 × 103to 2.0 × 107CFU. The detection limit of the real-time PCR assay was 2 × 103CFU in both pure cultures and artificial contaminated oyster samples, which indicated the sensitivity of RT-PCR was 400 CFU/g in artificial contaminated oyster sample. The freezing/thawing experiments showed thawing in water bath at temperature below 55 ℃had little effect on viable cells of Vibrio parahaemolyticus. Therefore, this method avoided the defection in traditional PCR,which could not distinguish viable bacteria cells from dead ones. It may offer a fast, sensitive method to identify andquantify pathogenic viable cells effectively.

EMA；RT-PCR (real-time polymerase chain reaction)；seafood；Vibrio parahaemolyticus；viable cells

2010-05-26

教育部留學回國人員基金項目(2006331)；遼寧省科技廳項目(20062109)；沈陽市科技局項目(1063312-1-00；090009)

祝儒剛(1980—)，男，講師，博士研究生，研究方向為食品微生物與分子生物學。E-mail：zrg_luck@163.com

*通信作者：呂淑霞(1963—)，女，教授，博士，研究方向為微生物生物化學與分子生物學。E-mail：lushuxia@hotmail.com

TS201.6

A

1002-6630(2011)08-0219-07