玉米須多糖中蛋白質(zhì)脫除的Sevag與酶法聯(lián)用工藝優(yōu)化

周鴻立，楊曉虹*

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130021；2.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

玉米須多糖中蛋白質(zhì)脫除的Sevag與酶法聯(lián)用工藝優(yōu)化

周鴻立1,2，楊曉虹1,*

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130021；2.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

采用Sevag與酶法聯(lián)用優(yōu)化玉米須多糖脫蛋白的工藝。以脫蛋白率和多糖剩余率及綜合評分為考察指標(biāo)。結(jié)果表明，最佳工藝為酶底比2.5(mg/L)、溫度50℃、振蕩時(shí)間8min、脫蛋白次數(shù)2次。最終多糖純度由21.88%提高為37.77%，脫蛋白率69.97%多糖，剩余率94.51%。此方法可用于玉米須多糖中蛋白質(zhì)的脫除。

玉米須；多糖；Sevag試劑；木瓜蛋白酶；脫蛋白

Sevag方法脫蛋白需要進(jìn)行多次[3-4]，并存在廢液處理問題；酶法除蛋白反應(yīng)溫和，操作相對簡單，但成本高且經(jīng)過沸水加熱會(huì)有蛋白殘余[5-7]。本實(shí)驗(yàn)探討Sevag和酶法聯(lián)用脫玉米須多糖中蛋白工藝，旨在為玉米須資源高效開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米須藥材2009采自吉林省吉林市郊區(qū)，由吉林大學(xué)王廣樹教授鑒定為甜粘1號。木瓜蛋白酶(酶活力6000U/mg，Sigma分裝) 廣西南寧杰沃利生物有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250(進(jìn)口分裝，081208) 中國惠氏生化試劑有限公司；牛血清白蛋白(F20080603) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、氯仿、苯酚、濃硫酸、正丁醇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SHB-ⅢA型循環(huán)水多用真空泵 鄭州長城科技工貿(mào)有限公司；LDZ5-2型臺式離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)有限公司；752型紫外-可見分光光度計(jì) 山東高密彩虹分析儀器有限公司；W2-100S型恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市正基儀器有限公司；ZF-6020真空干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗多糖的制備

玉米須干燥后粉碎，過40目篩。準(zhǔn)確稱取100g，用石油醚脫脂后，放入5000mL圓底燒瓶中，加20倍量的水，浸泡過夜，加蒸餾水約至3000mL，于90℃水浴提取1h，提取液過濾，第2次加水2000mL，提取30min，過濾；合并2次濾液濃縮至總體積的1/5，加無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)70%以上，靜置24h，3500r/min離心5min，回收乙醇，沉淀部分真空干燥得粗多糖，備用。

粗多糖溶液的配制：精密稱取粗多糖0.1g置50mL容量瓶中，配制成多糖溶液，離心、過濾，備用[8]。

1.3.2 分析方法

按常規(guī)苯酚-硫酸法測多糖含量，在490nm波長處以葡萄糖為對照品，60～140μg/mL范圍內(nèi)測吸光度，得回歸方程：A=5.945C－0.0377(n=5)，r=0.9995。用考馬斯亮藍(lán)G-250方法測蛋白質(zhì)含量，在595nm波長處以標(biāo)準(zhǔn)小牛血清蛋白為對照品，0.12～0.25mg/mL范圍內(nèi)測吸光度，得回歸方程：A=5.4954C－0.2806(n=5)，r=0.9997。

多糖剩余率/%=脫蛋白后多糖含量/脫蛋白前多糖含量×100

蛋白去除率/%=(脫蛋白前蛋白含量－脫蛋白后蛋白含量)/脫蛋白前蛋白含量×100

綜合評分=(每次脫蛋白率/每組最高脫蛋白率)×0.5×100＋(每次多糖剩余率/每組最高多糖剩余率)×0.5×100[9-11]

1.3.3 單因素試驗(yàn)

木瓜蛋白酶脫玉米須多糖中蛋白質(zhì)的單因素最佳pH5.0、酶解時(shí)間1h[8]，沸水浴5min滅酶，冷卻至室溫后，5000r/min離心，加入的順序以先加入酶水解蛋白，后用Sevag試劑(氯仿-正丁醇體積比為5:1，樣液與試劑體積比為2:1)除蛋白效果好[7]。前面因素固定后，分別用木瓜蛋白酶與樣液的酶底比(0、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L)、水浴溫度(40、50、60、70℃)、振蕩時(shí)間(0、2、5、8、11min)、脫蛋白次數(shù)(0、1、2、3、4次)4個(gè)因素做單因素試驗(yàn)[11-14]，計(jì)算脫蛋白率、多糖剩余率和綜合評分。

1.3.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素確定的最優(yōu)條件，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素水平(表 1)。

表1 脫蛋白正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶底比對脫蛋白的影響

圖1 酶底比對脫蛋白的影響Fig.1 Effect of enzyme-to-substrate ratio on deproteinization rate and polysaccharide recovery

由圖1可知，當(dāng)樣液與木瓜蛋白酶酶底比為2.0時(shí)，脫蛋白率和多糖剩余率都較高，且綜合評分最高。再增加酶用量，不但蛋白去除效果降低，而且多糖剩余率也減少了。分析原因，一是多糖溶液中蛋白質(zhì)，即木瓜蛋白酶作用底物含量有限，酶和底物的結(jié)合位點(diǎn)全部參與反應(yīng)后，再增加酶的用量不僅對反應(yīng)沒有明顯影響，而且酶加入量過大會(huì)增加成本。二是酶作為外加的蛋白質(zhì)，可以水解多糖中蛋白質(zhì)，同時(shí)，也具有從蛋白質(zhì)的水解物再合成蛋白質(zhì)類物質(zhì)的能力。因此，加入蛋白酶應(yīng)適量，不宜過多，故確定2.0(mg/L)為最佳酶底比。

2.1.2 水浴溫度對脫蛋白的影響

圖2 溫度對脫蛋白的影響Fig.2 Effect of temperature on deproteinization rate and polysaccharide recovery

由圖2可知，酶活力隨溫度的升高而增加，超過50℃后，活力降低。溫度過低，不利于分子熱運(yùn)動(dòng)進(jìn)行，降低效率；溫度過高則會(huì)導(dǎo)致酶失活。雖然木瓜蛋白酶耐溫性較好，但多糖隨著溫度的升高會(huì)分解。因在50℃時(shí)脫蛋白率和多糖剩余率都較高，且綜合評分最高，故確定50℃為最佳脫蛋白溫度。

2.1.3 振蕩時(shí)間對脫蛋白的影響

由圖3可知，在振蕩時(shí)間11min脫蛋白率和多糖剩余率都較高，且綜合評分最高，故確定11min為最佳振蕩時(shí)間。單純Sevag法振蕩時(shí)間大約20min，脫蛋白率不高，有時(shí)多糖損失率卻很高[7,9,12-13]，而酶水解后振蕩時(shí)間的縮短，相對節(jié)約了生產(chǎn)成本。

2.1.4 脫蛋白次數(shù)對脫蛋白的影響

圖4 脫蛋白次數(shù)的影響Fig.4 Effect of number of repeated Sevag treatment on deproteinization rate and polysaccharide recovery

由圖4可知，隨著Sevag試劑脫蛋白次數(shù)增加，脫蛋白率升高但多糖剩余率卻在下降，參考綜合評分，確定最佳脫蛋白次數(shù)為3次。黃潔[7]、李蘋蘋[10]、吳海玥[15]等報(bào)道單純Sevag法需反復(fù)多次，但與酶聯(lián)用后比較可知，Sevag法3次即可達(dá)到理想的除蛋白效果，且多糖損失亦較少(表2)。如果多次處理后，還有一定蛋白，可能含有糖蛋白綴合物[13]。

表2 文獻(xiàn)中兩種方法比較Table 2 Comparisons of deproteinization rates and polysaccharide recoveries of combined enzymatic-Sevag methods reported in literature

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 玉米須多糖中蛋白質(zhì)脫除的Sevag與酶法聯(lián)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Scheme and experimental results of orthogonal array design

表4 綜合評分方差分析表Table 4 Variance analysis for comprehensive weighted evaluation of deproteinization rate and polysaccharide recovery

由表3可得，正交試驗(yàn)的4因素中，引入綜合評分做極差分析，影響關(guān)系大小依次為B＞A＞C＞D，極差最優(yōu)條件為A3B2C2D1，即酶底比2.5(mg/L)，溫度50℃，振蕩時(shí)間8min，脫蛋白次數(shù)2次。如果用脫蛋白率做極差分析，則D因素影響最大，所以工藝研究有必要考察損失率，以節(jié)約成本使實(shí)驗(yàn)條件更接近產(chǎn)業(yè)化。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取正交試驗(yàn)最佳因素組合A3B2C2D1做3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，即酶底比2.5(mg/L)、溫度50℃、振蕩時(shí)間8min、脫蛋白2次，樣液量擴(kuò)大為100mL(原為5mL)，結(jié)果3次脫蛋白率分別為70.43%、69.42%、70.06%，平均值69.97%，RSD 0.73%＜1.5%；多糖剩余率為93.58%、94.20%、95.75%，平均值94.51%，RSD 1.12%＜1.5%，綜合評分97.46；多糖純度由21.88%提高為37.77%。表明實(shí)驗(yàn)所確定的工藝條件為最優(yōu)條件，并穩(wěn)定可行。

Sevag法利用有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)變性成不溶狀態(tài)的原理脫蛋白，隨著脫蛋白次數(shù)的增加，脫蛋白率逐漸增加，多糖損失率也在增加；酶法較Sevag法相比操作條件簡單、溫和，利于保持多糖的活性、避免使用有機(jī)溶劑，但酶底比較高時(shí)，有殘留蛋白[7]；Sevag與酶法聯(lián)用脫蛋白，粗多糖經(jīng)酶處理后，大部分游離蛋白質(zhì)水解，經(jīng)過2次Sevag法脫蛋白處理，即可達(dá)到理想的脫蛋白效果，比單用酶法酶的用量減少了[8]，既節(jié)約了成本又提高了脫蛋白率，所以此法是一種值得推廣的方法[13-15]。

3 結(jié) 論

Sevag與酶法聯(lián)用脫蛋白最佳工藝條件酶為底比2.5(mg/L) 、溫度50℃、振蕩時(shí)間8min、脫蛋白次數(shù)2次，脫蛋白率69.97%，多糖剩余率94.51%，多糖純度由21.88%提高為37.77%。玉米須為資源豐富、價(jià)格低廉、易于采集、有待全面開發(fā)利用的藥用資源，具有廣闊的研究與開發(fā)前景。其多糖具有很多的藥理作用，故對多糖純化研究有很高的應(yīng)用價(jià)值。

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Removal of Proteins from Corn Silk Polysaccharide by A Combined Enzymatic-Sevag Method

ZHOU Hong-li1,2，YANG Xiao-hong1,*
(1. School of Pharmaceutical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, China；2. School of Chemical and Pharmaoeutical Engineering, Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin 132022 ,China)

Enzymatic hydrolysis followed by Sevag treatment was used to develop a combined method for removing proteins in crude corn silk polysaccharide. The enzyme used was papain. Its hydrolysis conditions were optimized by single factor and orthogonal array design methods based on deproteinization rate and the recovery of polysaccharides. The number of repeated Sevag treatment was also investigated. The optimal conditions for deprotenizing crude corn silk polysaccharide were as follows:enzyme-to-substrate ratio of 2.5 (mg/L), temperature of 50 ℃, oscillation time of 8 min and number of repeated Sevag treatment of 2. Under such conditions, the purity of crude corn silk polysaccharide was increased from 21.88% to 37.77%, and the deproteinizaiton rate and polysaccharide recovery were 69.97% and 94.51%, respectively.

corn silk；polysaccharide；Sevag；papain；deproteinization

R284.2

A

1002-6630(2011)08-0129-04玉米須(corn silk，Stigma maydis)是禾本科植物玉蜀黍的花柱和柱頭，味淡、性平，玉米須多糖具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、降糖[1]、利尿[2]、解熱、利膽等作用，且毒性低，具有良好的科研價(jià)值及市場開發(fā)前景。但多糖中常含有一定量的蛋白質(zhì)，會(huì)吸附多糖給分離帶來困難。最重要的是蛋白質(zhì)具有熱源性，如何除去蛋白成為多糖純化的一個(gè)重要問題。由于單純的

2010-08-11

吉林大學(xué)博士后基金項(xiàng)目(801070660432)；吉林省教育廳“十一五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2010第175號)

周鴻立(1967—)，女，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。E-mail：zhl67@126.com

*通信作者：楊曉虹(1954—)，女，教授，博士，主要從事新藥合成研究。E-mail：xiaohongyang88@126.com