南瓜苗總黃酮的提取及清除自由基能力研究

李南薇，劉長海，黃 凱

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225)

南瓜苗總黃酮的提取及清除自由基能力研究

李南薇，劉長海，黃 凱

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225)

目的：提取南瓜苗總黃酮并研究其抗氧化活性。方法：用乙醇提取南瓜苗總黃酮，采用DPPH法、水楊酸法檢測其對DPPH自由基和·OH的清除作用。結(jié)果：最佳提取條件為提取溫度70℃、提取時間4h、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、料液比1:25(g/mL)。在該條件下南瓜苗總黃酮得率最高，達到2.56%。南瓜苗總黃酮清除DPPH自由基和·OH的EC50(半抑制質(zhì)量濃度)分別為0.017mg/mL和0.019mg/mL。結(jié)論：南瓜苗中含有豐富的黃酮，并且其具有較強的清除自由基能力。

南瓜苗；總黃酮；提??；抗氧化活性

黃酮類化合物在自然界中廣泛存在，具有多種多樣的生物活性和藥理作用，對一些常見病和多發(fā)病有重要的治療或預(yù)防作用，被廣泛應(yīng)用于臨床。主要的活性作用有對心血管疾病的治療作用、抗氧化及清除體內(nèi)的自由基、抗癌抗腫瘤、抗炎、抗菌抗病毒、調(diào)節(jié)呼吸系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)[1-6]。同時在食品工業(yè)上，黃酮類化合物作為天然食品添加劑、抗氧化劑、食用色素等；很多以黃酮類化合物作為功能因子的保健食品被開發(fā)[7-8]。

隨著生活水平的不斷提高，人們對蔬菜的需求也發(fā)生了深刻的變化，由以往追求數(shù)量和價廉，轉(zhuǎn)為追求質(zhì)量、營養(yǎng)和保健效果。南瓜苗作為一種新興的蔬菜，不僅味道鮮美、口感好、風(fēng)味獨特，而且營養(yǎng)豐富，富含葉綠素及多種人體必需的氨基酸、礦物質(zhì)和維生素等。常食之，對糖尿病、動脈硬化、消化道潰瘍等多種疾病均有一定的療效[9-10]。然而，國內(nèi)外對南瓜的利用研究主要集中在其果實和種子等藥用成分的提取方面，對南瓜苗的功能性成分和抗氧化活性的研究尚未見報道。本實驗以南瓜苗為原料，對南瓜苗中的黃酮類化合物進行提取并對其抗氧化活性進行研究，以期為南瓜苗功能性成分的研究開發(fā)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜苗 廣州市海珠區(qū)菜市場。

乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氯化鋁、水楊酸、雙氧水均為分析純，DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical) 美國Sigma-Aldrich公司；蘆丁國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S54紫外可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；6202小型高速粉碎機 臺灣欣鎮(zhèn)企業(yè)有限公司；ALC-210.4型電子分析天平 德國Sartorius-Acculab公司；HWS12型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 南瓜苗總黃酮的測定

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定[11]

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.010g，用30%乙醇溶液溶解，定容至100mL，制成0.1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

準(zhǔn)確吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于7支25mL比色管中，分別編號0～6，用30%乙醇溶液補至10mL，加入1mL 5%亞硝酸鈉溶液，振搖，放置5min，加入1mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻后放置6min，加入5mL 1mol/L氫氧化鈉溶液，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15min，以0號管為空白管，于波長510nm處測定各管吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 南瓜苗總黃酮的提取和測定

新鮮南瓜苗清洗、烘干、粉碎后得南瓜苗粉末。取2g南瓜苗粉末置于250mL的燒瓶中，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇在一定條件下回流浸提。將浸提液過濾2～3次，收集濾液并進行減壓濃縮，再用30%乙醇溶液定容至25mL，搖勻，備用。吸取定容后的樣品液5mL，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法測定樣品液的吸光度，并根據(jù)線性回歸方程計算總黃酮得率。

1.3.3 南瓜苗總黃酮提取工藝條件的確定

本實驗根據(jù)預(yù)實驗中乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比(g/mL)、提取溫度和提取時間等單因素對總黃酮得率的影響，按照正交表L9(34)進行正交優(yōu)化試驗，因素水平見表1，以總黃酮得率作為評價指標(biāo)，采用極差分析法確定最佳總黃酮提取工藝條件。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.4 抗氧化活性的測定

1.4.1 清除DPPH自由基的測定[12]

準(zhǔn)確稱取DPPH自由基標(biāo)準(zhǔn)品11mg，用無水乙醇溶解并定容至100mL，配成0.28mmo1/L DPPH儲備液，置于冰箱中備用。用0.1mL無水乙醇與3mL 0.28mmo1/L的DPPH自由基溶液加入同一試管中，搖勻，在黑暗中放置30min，以無水乙醇為空白在波長517nm處測定其吸光度A對照。另取0.1mL不同質(zhì)量濃度的南瓜苗黃酮提取液(0.004、0.008、0.012、0.016、0.020mg/mL)與3mL 0.28mmo1/L DPPH溶液于同一試管中，搖勻，在黑暗中放置30min，以無水乙醇為空白在波長517nm處測定其吸光度(A樣品)。并計算DPPH自由基清除率。

1.4.2 羥自由基清除率測定[13]

在試管中依次加入2mL 6mmol/L FeSO4溶液，2mL不同質(zhì)量濃度的南瓜苗總黃酮提取液(0.004、0.008、0.012、0.016、0.020mg/mL)，2mL 6mmol/L H2O2溶液，搖勻，靜置10min，再加入2mL 6mmol/L水楊酸溶液，搖勻，靜置30min后于波長510nm處測定其吸光度A樣品，用蒸餾水代替水楊酸按上述方法測定吸光度A對照，用蒸餾水代替南瓜苗總黃酮提取液按上述方法測定吸光度A空白。以下式計算羥自由基清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定總黃酮含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=4.842x＋0.002(R2=0.998)。式中，y表示吸光度，x表示蘆丁的質(zhì)量濃度。

2.2 南瓜苗總黃酮最佳提取工藝條件的確定

表2 南瓜苗總黃酮提取工藝正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design scheme and corresponding experimental results

由表2可知，南瓜苗總黃酮的最佳提取工藝條件為A2B1C2D3，統(tǒng)計分析結(jié)果的最佳工藝為A2B2C2D3。補充驗證A2B2C2D3試驗，總黃酮得率達到2.56%，與最佳提取工藝條件組合相比較無顯著差別。最終確定南瓜苗總黃酮的最佳提取工藝為A2B2C2D3。

試驗數(shù)據(jù)的極差分析結(jié)果表明，各因素對總黃酮提取的影響次序C＞D＞A＞B。提取溫度和提取時間是影響南瓜苗總黃酮提取的主要因素，乙醇體積分?jǐn)?shù)次之，料液比最小。即在提取溫度70℃、提取時間4h、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、料液比1:25的工藝條件下，南瓜苗總黃酮的提取效果最好，總黃酮得率為2.56%。

2.3 南瓜苗黃酮抗氧化活性試驗

2.3.1 南瓜苗黃酮對DPPH自由基的清除能力

圖1 南瓜苗黃酮對DPPH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect of flavonoids from pumpkin seedlings at various concentrations on DPPH free radicals

由圖1可知，隨著黃酮質(zhì)量濃度的增加，清除DPPH自由基的效果增強。對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析得黃酮質(zhì)量濃度(x，mg/mL)與清除率(y，%)的回歸方程為y=3140x－3.9，R2=0.971。通過方程求出南瓜苗黃酮清除DPPH自由基的半抑制率(EC50，即清除率達到50%時所需樣品的質(zhì)量濃度)為0.017mg/mL。與其他文獻報道比較[2,4]，南瓜苗黃酮具有良好的清除DPPH自由基能力。

2.3.2 南瓜苗黃酮對·OH的清除能力

圖2 南瓜苗黃酮對·OH的清除作用Fig.2 Scavenging effect of flavonoids from pumpkin seedlings at various concentrations on hydroxyl free radicals

由圖2可知，隨著黃酮質(zhì)量濃度的增加，對·OH的清除效果增強。通過對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析得黃酮質(zhì)量濃度(x，mg/mL)與清除率(y，%)的回歸方程為y=2482x＋1.73，R2=0.953。南瓜苗黃酮清除·OH的半抑制率(EC50)為0.019mg/mL。與其他文獻報道比較[2,4]，南瓜苗黃酮也具有很強的清除·OH能力。

3 討論與結(jié)論

南瓜苗總黃酮最佳提取條件為提取溫度70℃、提取時間4h、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、料液比1:25(g/mL)。在該條件下南瓜苗中總黃酮得率最高，達到2.56%。南瓜苗總黃酮具有很強的清除DPPH自由基和·OH能力，其EC50(半抑制質(zhì)量濃度)分別為0.017mg/mL和0.019mg/mL。

我國南瓜的產(chǎn)量在世界排名第二，在各地廣有栽培。但南瓜苗除了少量的被食用和作為飼料外，其利用率很低，造成嚴(yán)重的資源浪費。根據(jù)本研究可知，南瓜苗中含有豐富的黃酮，具有很強的抗氧化活性。同時對南瓜苗中總黃酮的提取工藝進行了探討，為開發(fā)利用該資源提供了一定的參考依據(jù)。

[1] 劉亞敏, 劉玉民, 馬明, 等. 楓香樹葉總黃酮提取工藝優(yōu)化及含量動態(tài)變化[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(4): 35-38.

[2] 姜天甲, 應(yīng)鐵進, 陳秋平, 等. 油茶籽殼總黃酮的提取及抗氧化研究[J]. 中國食品學(xué)報, 2010, 10(1): 93-99.

[3] 朱慧, 馬瑞君, 吳雙桃, 等. 薇甘菊總黃酮的提取及清除羥自由基活性的測定[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(6): 70-73.

[4] 吳瓊英, 賈俊強. 柚皮黃酮的超聲輔助提取及抗氧化性研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(2): 29-33.

[5] 索金玲, 彭秧, 張縱圓, 等. 石榴葉總黃酮提取工藝及體外抗氧化性研究[J]. 生物技術(shù), 2009, 19(1): 63-65.

[6] 方敏, 占才貴, 宮智勇. 玉米須總黃酮的提取與抗氧化活性研究[J].食品科學(xué), 2009, 30(18): 206-208.

[7] 王小華, 鄧斌, 張曉軍, 等. 南瓜葉黃酮類化合物提取條件的優(yōu)化[J].化學(xué)工程師, 2008, 159(12): 1-3.

[8] 范文秀, 李新崢. 南瓜營養(yǎng)成分分析及功能特性的研究[J]. 廣東微量元素科學(xué), 2005, 12(2): 38-40.

[9] 馬銳. 南瓜苗菜高產(chǎn)栽培技術(shù)[J]. 農(nóng)村實用技術(shù), 2009(9): 37.

[10] 牟水元. 新興蔬菜-南瓜苗[J]. 蔬菜, 2007(2): 9.

[11] 黃曄, 龍光錦, 姜林華, 等. 玉米須總黃酮的提取及鑒別[J]. 時珍國醫(yī)藥, 2006, 17(6): 1008-1009.

[12] AMAROWICZ R, NACZK M, SHAHIDI F. Antioxidant activity of various fractions of non-tanin phenolics of canola hulls[J]. J Agric Food Chem, 2000, 48(7): 2755-2759.

[13] 張?zhí)m杰, 候冬巖, 辛廣, 等. D-氨基葡萄糖鹽酸鹽的制備及抗氧化特性的研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(4): 103-105.

Extraction and Free Radical Scavenging Activity of Total Flavonoids from Pumpkin Seedlings

LI Nan-wei，LIU Chang-hai，HUANG Kai
(College of Light Industry and Food Technology, Zhongkai University of Agricultural and Engineering, Guangzhou 510225, China)

Aim: To optimize the extraction of total flavonoids from pumpkin seedlings and to evaluate their free radical scavenging activity. Methods: Aqueous ethanol solution was the solvent for flavonoid compounds in pumpkin seedlings.Orthogonal array design method was employed for the optimization of extraction process. Free radical scavenging activity evaluation was achieved by determining the abilities to scavenge DPPH and hydroxyl free radicals (by salicylic acid method).Results: The optimized extraction conditions were found to be extraction at 70 ℃ for 4 h using 85% aqueous ethanol solution at a solid/liquid ratio of 1:25 (g/mL). The extraction efficiency for total flavonoids from pumpkin seedlings reached up to 2.56%under these conditions. The median effective concentration (EC50) of total flavonoids from pumpkin seedlings against DPPH and hydroxyl free radicals were determined to be 0.017 mg/mL and 0.019 mg/mL, respectively. Conclusion: Flavonoid compounds are abundant in pumpkin seedlings and those from pumpkin seedlings have strong free radical scavenging activity.

pumpkin sprout；total flavonoids；extraction；antioxidant activity

O623.54

A

1002-6630(2011)08-0058-03

2010-06-14

廣東省科技計劃項目(2008A024200003)

李南薇(1982—)，女，講師，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：linanwei2006@yahoo.com.cn