中間水分食品體系中乳球蛋白糖基化位點(diǎn)的鑒定

余園芳，陶冠軍，劉小鳴，周 鵬

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

中間水分食品體系中乳球蛋白糖基化位點(diǎn)的鑒定

余園芳，陶冠軍，劉小鳴，周 鵬﹡

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

在中間水分食品體系中，乳球蛋白很容易與葡萄糖等還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，使食品的色澤、風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)等發(fā)生變化。為了深入理解中間水分食品在貯藏過(guò)程中蛋白發(fā)生的糖基化修飾，電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜（ESI-TOF/MS）被用來(lái)分析蛋白經(jīng)胰蛋白酶水解后的肽段，以便鑒定乳球蛋白與葡萄糖在45℃下貯藏2d后的糖基化位點(diǎn)。結(jié)果顯示，乳球蛋白上被糖基化的氨基酸殘基有L1、K47、K70、K77、K83、K91、K100和K135。

乳球蛋白，葡萄糖，糖基化反應(yīng)，糖基化位點(diǎn)

中間水分食品通常是指水分活度在0.5～0.9之間的一類(lèi)食品[1]。乳清蛋白是高蛋白中間水分食品中常用的蛋白源，其賴(lài)氨酸（Lys）含量高，所以它很容易與葡萄糖等還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，使食品的色澤、風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)等品質(zhì)變差。因此，研究食品蛋白的糖基化修飾對(duì)于深入理解食品在加工和貯存過(guò)程中的物理化學(xué)變化及食品的穩(wěn)定性尤為重要。文獻(xiàn)中報(bào)道的主要是對(duì)較高程度的美拉德反應(yīng)的研究，而對(duì)反應(yīng)初期蛋白糖基化修飾的研究比較少。糖基化反應(yīng)通常是指美拉德反應(yīng)的初期[2]，測(cè)定蛋白糖基化反應(yīng)常見(jiàn)的方法有HPLC法測(cè)糠氨酸的含量[3]，酶解比色法[4]和鄰苯二甲醛法（OPA法）測(cè)定游離賴(lài)氨酸的含量[5-6]等。但這些方法只能評(píng)價(jià)較高程度的美拉德反應(yīng)，不能鑒定出反應(yīng)初期蛋白上哪些氨基酸殘基被修飾了。質(zhì)譜技術(shù)分析時(shí)間短[6]，靈敏度高，因此逐漸被用來(lái)評(píng)價(jià)和描述蛋白糖基化反應(yīng)，獲得關(guān)于糖基化反應(yīng)的更加準(zhǔn)確和詳細(xì)的信息。軟離子化技術(shù)，例如電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）和基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜（MALDI-MS），結(jié)合酶解可以檢測(cè)蛋白的糖基化位點(diǎn)[7-12]，為研究糖基化修飾對(duì)食品蛋白物化性質(zhì)的變化和延長(zhǎng)食品保質(zhì)期提供理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)用胰蛋白酶水解蛋白，再用LC-ESIMS分析酶解后得到的肽段，來(lái)鑒定乳球蛋白的糖基化位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳球蛋白（LG） BioPURE，DaviscoFoods International,Inc.；葡萄糖 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶（TPCK-treated trypsin，from bovine pancreas） 酶活力≥10,000 BAEE units/mg，Sigma公司；乙腈、甲酸 色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

高效十點(diǎn)磁力攪拌器 德國(guó)IKA公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；水分活度密閉容器（Plastic water activity sample cup） 美國(guó)Decagon公司；封口膜（Parafilm） 美國(guó)Pechiney Plastic Packaging公司；Hygrolab 2/3四通道臺(tái)式水分活度儀 瑞士Novasina公司；透析袋（截留分子量7K） 美國(guó)聯(lián)合碳化物公司；Platform ZMD 4000液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中間水分食品模型體系的制備 將葡萄糖溶解于水，加入甘油，攪拌均勻。再加入乳球蛋白粉，用手混合，揉成均勻的面團(tuán)。放入水分活度密閉容器中，用封口膜密封，以防止水分丟失。將樣品在室溫下平衡2h，測(cè)定水分活度。測(cè)得體系的水分活度為0.54，處于中間水分食品體系的水分活度范圍內(nèi)。最后，將樣品置于裝有Mg（NO3）2過(guò)飽和溶液的干燥器（水分活度為0.529）中，放入恒溫生化培養(yǎng)箱中，45℃下貯藏。模型體系的配方見(jiàn)表1。

表1 模型體系配方

1.2.2 乳清蛋白糖基化位點(diǎn)的鑒定 用電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜（ESI-TOF/MS）分析45℃下貯藏2d的樣品，用0d的樣品作對(duì)照。

取50mg蛋白面團(tuán)，加到22.5mL超純水中，室溫下磁力攪拌1h，轉(zhuǎn)速400r/min。量取12mL蛋白液到透析袋中，4℃下用超純水透析。隔8h換一次水，共換兩次。用0.05mol/L NH4OH將透析液的pH調(diào)至8.0，加入12μL胰蛋白酶（1mg/mL），37℃恒溫水浴振蕩16h，用0.05mol/L HCl調(diào)pH至低于2來(lái)終止酶解。將酶解液過(guò)0.45μm的濾膜，濾液直接用LC-MS分析。

用MassLynx V4.1（美國(guó)Waters公司）和ProteinLynx Global server 2.3（美國(guó)Waters公司）分析圖譜。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：BEH C18（2.1×100mm）；柱溫：45℃；檢測(cè)器：WATERS ACQUITY PDA；流動(dòng)相：A液是100%的乙腈，B液是0.1%的甲酸溶液；洗脫梯度：100%B（0min）→60%B（30min）→0%B（50～55min）；流速：300μL/min；進(jìn)樣量：2μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子化方式：ESI，正離子模式；毛細(xì)管電壓：2.0kV；錐孔電壓：30V；離子源溫度：100℃；脫溶劑氣溫度：250℃；質(zhì)量掃描范圍m/z：600～3000。

2 結(jié)果與討論

用ProteinLynx軟件在SWISSPROT-1.0數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索沒(méi)有被糖基化的肽段（見(jiàn)表2）。

觀察總離子流色譜圖（見(jiàn)圖1）發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組（0d的樣品）相比，樣品組的總離子流圖中有的峰信號(hào)強(qiáng)度降低或消失，同時(shí)有新的峰出現(xiàn)。這些強(qiáng)度降低或消失的峰對(duì)應(yīng)的肽段可能被糖基化了，而新出現(xiàn)的峰則可能是糖基化的肽段。以肽段1～8（圖1，峰6）為例，其信號(hào)強(qiáng)度從0d的2.35e3降至2d的83.8，面積從1120降至39。1～8糖基化后的肽段（圖1，峰B）信號(hào)強(qiáng)度為389，峰面積為172。另外，糖基化的肽段的質(zhì)量數(shù)比理論肽段的大162n（n為整數(shù)）。在對(duì)照組[圖2（1）]中，主要是肽段1～8的質(zhì)譜峰（933.7603和467.3648），而對(duì)于2d的樣品[圖2（2）]，還出現(xiàn)了m/z=1095.8567（z=1）和m/z=548.4205（z=2）的峰。1095.8567比933.7603大162，548.4205比467.3648大81，所以，1095.8567和548.4205應(yīng)該是葡萄糖化后的肽段1～8，再次證明肽段1～8被糖基化了。乳清蛋白的糖基化位點(diǎn)主要是Lys殘基，N末端氨基酸殘基，也有少數(shù)幾個(gè)Arg殘基[13]。每個(gè)糖基化的肽段中存在2個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)。以肽段70～75為例，它含有70位和75位Lys。胰蛋白酶特異性地切除Lys（K）和Arg羧基端的肽鍵，由于K75的羧基端被斷開(kāi)了，而Lys殘基被糖基化后其羧基端是不會(huì)被切開(kāi)的，所以K75沒(méi)有被糖基化，K70是糖基化的氨基酸。

圖1 肽段的總離子流色譜圖

圖2 肽段1～8的質(zhì)譜圖

圖3 求峰面積后的Tic圖

檢測(cè)到的糖基化的氨基酸有L1、K47、K70、K77、K83、K91、K100和K135（見(jiàn)表2）。Chevalier等[14]研究了乳球蛋白和葡萄糖的溶液模型體系在60℃下的糖基化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)乳球蛋白的糖基化位點(diǎn)有L1、K14、K47、K69、K75、K100和K135。Marvin等[15]發(fā)現(xiàn)嬰兒配方奶粉中乳球蛋白的乳糖化位點(diǎn)有L1、K69、K70、K75、K77、K83和K100。Morgan等[16]研究了乳球蛋白和乳糖在干狀態(tài)（水分活度為0.65，50℃）下的糖基化反應(yīng)，鑒定出乳球蛋白上最易被糖基化的位點(diǎn)是K47和K91，隨后是L1、K14、K70和K100，接著是K60、K69、K75、K77、K83、K135和K138，最后是K14和K141。

另外，不同體系中同種蛋白的糖基化位點(diǎn)不完全相同，Morgan等[11,16]鑒定到的K8、K14、K60和K138等在本實(shí)驗(yàn)體系中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。Leonil等[18]鑒定出乳球蛋白上最先被乳糖化的位點(diǎn)是K47，而Fogliano等[9]卻發(fā)現(xiàn)K100的活性最高。這些不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能是溫度、水分活度等因素不同所導(dǎo)致的。

目前，對(duì)造成蛋白中的氨基酸殘基糖基化活性不同的解釋主要有兩種。第一個(gè)因素是氨基酸殘基的暴露程度。Chevalier等[17]發(fā)現(xiàn)K14和Arg40深藏于乳球蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)的中間，K14位于N-末端區(qū)域疏水部分的末端，Arg40位于分子的β-折疊B的始端，不易被糖基化。另外，K70比K69先發(fā)生糖基化反應(yīng)。因?yàn)樵谌S結(jié)構(gòu)中，K69、K70位于β-折疊D上，但K70的側(cè)鏈伸在外面，K69插入到疏水區(qū)，所以前者比后者先被糖基化。另一個(gè)因素是臨近帶電氨基酸的作用。Fogliano等[9]從蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中得到乳球蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，發(fā)現(xiàn)活性較高的K47的暴露程度卻低于活性很低的K141的暴露程度，但K47非常接近帶電氨基酸K70。而臨近的帶電氨基酸對(duì)Amadori重排有促進(jìn)作用，所以K47的活性較高[5,9]。

有的被修飾的肽段未被檢測(cè)到，導(dǎo)致部分位點(diǎn)沒(méi)有被鑒定出，其原因有：與其他一起洗脫的肽段相比，這些肽段離子的量太少，不足以被檢測(cè)到[5,14]；一些糖基化了的肽段的質(zhì)量數(shù)與未糖基化的肽段相同[5]；含糖基化氨基酸的肽段的兩端的氨基酸也被修飾了，抑制了胰蛋白酶的水解，因此不能水解得到這種肽段[14]；這些肽段被糖基化后，其離子化特性發(fā)生了變化。Meltretter等[8]用AspN酶解蛋白樣品后只檢測(cè)到了一個(gè)或兩個(gè)Amadori產(chǎn)物，而水解之前在完整的乳球蛋白和乳白蛋白中卻發(fā)現(xiàn)四個(gè)Amadori產(chǎn)物，這說(shuō)明糖基化改變了離子化特性。

表2 胰蛋白酶水解后用LC-ESI-TOF/MS鑒定到的肽段

3 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)中，用LC-MS鑒定出中間水分模型體系中乳球蛋白在45℃下與葡萄糖儲(chǔ)藏2d后的糖基化位點(diǎn)有L1、K47、K70、K77、K83、K91、K100和K135。根據(jù)文獻(xiàn)的報(bào)道可知，主要是這些氨基酸殘基的暴露程度比較高或者這些氨基酸殘基附近有帶電氨基酸所造成的。

[1]Pomeranz Y.Advances in cereal science and technology[M].AACC Press,1988:91-128.

[2]Yeboah F K,Yaylayan V A.Analysis of glycated proteins by mass spectrometric techniques:Qualitative and quantitative aspects[J].Nahrung/Food,2001,45:164-171.

[3]Fenaille F,Parisod V,Visani P,et al.Modifications of milk constituents during processing:A preliminary benchmarking study[J].International Dairy Journal,2006,16:728-739.

[4]Rockland L.Water in foods[M].Academic Press:New York,1981:605-650.

[5]Ledesma-Osuna A I,Ramos-Clamont G,Vázquez-Moreno L.Characterization of bovine serum albumin glycated with glucose,galactose and lactose [J].Acta Biochimica Polonica,2008,55:491-497.

[6]Fenaille F,Campos-Gimenez E,Guy P A,et al.Monitoring of β-lactoglobulin dry-state glycation using various analytical techniques[J].Analytical Biochemistry,2003,320:144-148.

[7]Siciliano R,Rega B,Amoresano A,et al.Modern mass spectrometric methodologies in monitoring milk quality[J].Analytical Chemistry,2000,72:408-415.

[8]Meltretter J,Seeber S,Humeny A,et al.Site-specific formation of maillard,oxidation and condensation products from whey proteins during reaction with lactose[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry,2007,55:6096-6103.

[9]Fogliano V,Monti S M,Visconti A,et al.Identification of a β-lactoglobulin lactosylation site [J].Biochimica et Biophysica Acta,1998,1388:295-304.

[10]Morgan F,LéonilJ,Mollé D,etal.Nonenzymatic lactosylation of bovine β-lactoglobulin under mild heat treatment leads to structural heterogeneity of the glycoforms[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,1997,236:413-417.

[11]Fenaille F,Morgan F,Parisod V,et al.Solid-state glycation of β-lactoglobulin by lactose and galactose:localization of the modified amino acids using mass spectrometric techniques[J].Journal of Mass Spectrometry,2004,39:16-28.

[12]Mollé D,Morgan F,Bouhallab S,et al.Selective detection of lactolated peptides in hydrolysates by liquid chromatography/electrospray tandem mass spectrometry[J].Analytical Biochemistry,1998,259:152-161.

[13]Fenaille F,Morgan F,Parisod V,et al.Solid-state glycation of β-lactoglobulin monitored by electrospray ionisation mass spectrometry and gel electrophoresis techniques [J].Rapid Communnications in Mass Spectrometry,2003,17:1483-1492.[14]Chevalier F,Chobert J M,Mollé D,et al.Maillard glycation of β-lactoglobulin with several sugars:comparative study of the properties of the obtained polymers and of the substituted sites[J].Lait,2001,81:651-666.

[15]Marvin L,Parisod V,Fay L B,et al.Characterization of lactosylated proteins of infant formula powders using twodimensionalgelelectrophoresisand nanoelectrospray mass spectrometry[J].Electrophoresis,2002,23:2505-2512.

[16]Morgan F,Bouhallab S,Mollé D,et al.Lactolation of β -lactoglobulin monitored by electrospray ionization mass spectrometry[J].International Dairy Journal,1998,8:95-98.

[17]ChevalierF,ChobertJM,DalgalarrondoM,etal.Characterizationofthemaillardreactionproductsof β-lactoglobulin glucosylated in milk conditions [J].Journal Food Biochemistry,2001,25:33-55.

[18]Leonil J,Molle D,Fauquant J,et al.Characterization by ionization mass spectrometry of lactosyl β-lactoglobulin conjugates formed during heat treatment of milk and whey and identification of one lactose-binding site[J].Journal of Dairy Science,1997,80:2270-2281.

Identification of the glycation sites of beta-lactoglobulin in an intermediate moisture food system

YU Yuan-fang，TAO Guan-jun，LIU Xiao-ming，ZHOU Peng*

（State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China）

Beta-lactoglobulin is liable to react with reducing sugars like glucose in intermediate moisture food system，causing changes to color，flavor and texture.In order to further understand the glycated modification，the glycation sites of beta-lactoglobulin were identified by using ESI-TOF/MS to analyze the peptides from tryptic digest of beta-lactoglobulin incubated with glucose at 45℃for two days.It was showed that the modified amino acid residues were L1，K47，K70，K77，K83，K91，K100 and K135.

beta-lactoglobulin；glucose；glycation reaction；glycation site

TS201.2+1

A

1002-0306（2011）10-0079-04

2010-09-10 *通訊聯(lián)系人

余園芳（1986-），女，碩士在讀，研究方向：食品結(jié)構(gòu)與物性。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金（JUSRP21004）。