響應(yīng)曲面法優(yōu)化苦水玫瑰中抗氧化物質(zhì)提取工藝參數(shù)

李鵬飛，蔣玉梅，李霽昕，畢 陽，艾娜絲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化苦水玫瑰中抗氧化物質(zhì)提取工藝參數(shù)

李鵬飛，蔣玉梅*，李霽昕，畢 陽，艾娜絲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

以苦水玫瑰花提取物的總抗氧化能力為評價指標(biāo)，在單因素和中心旋轉(zhuǎn)組合實驗設(shè)計結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化苦水玫瑰花中抗氧化物質(zhì)的提取工藝參數(shù)。結(jié)果顯示:4個因素對苦水玫瑰花中抗氧化物質(zhì)提取的影響依次為溫度＞液料比＞乙醇濃度＞時間。典型性分析顯示，苦水玫瑰花抗氧化物質(zhì)提取最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度50%、液料比25∶1、溫度90℃、時間120min，苦水玫瑰中抗氧化物質(zhì)的總抗氧化能力為 3343.9μmol·g－1，與預(yù)測值3365μmol·g－1的相對誤差為0.63%?；貧w方程的預(yù)測值和實驗值差異不顯著，所得回歸模型擬合情況良好，符合要求。

苦水玫瑰花，抗氧化能力，響應(yīng)面

流行病學(xué)研究表明，植物中的黃酮類和酚類對癌癥、中風(fēng)、冠心病和神經(jīng)退行性疾病有預(yù)防作用［1－3］。人類自身雖然擁有抗氧化防御系統(tǒng)，但其防御效率較低，有研究顯示攝入抗氧化物質(zhì)豐富的食品會降低人類疾病的發(fā)病率［4－5］。因此，天然抗氧化物質(zhì)的提取分析受到了眾多學(xué)者的關(guān)注，但多集中于水果蔬菜，花卉類研究鮮見報道［6］。玫瑰花由于含有豐富的VC、酚類物質(zhì)和類胡蘿卜素等天然抗氧化劑［7－8］，在東亞和歐洲一直被作為藥茶，同時也用來補(bǔ)充維生素和加工食品。苦水玫瑰(R.Setate×R.Rugosa)是鈍齒薔薇和我國傳統(tǒng)玫瑰的雜交種，在甘肅省永登縣苦水鎮(zhèn)有大面積種植，其抗逆性、產(chǎn)花量、含油量和油的香氣都可與國際上久負(fù)盛名的保加利亞大馬士革玫瑰相媲美，是甘肅省主要香料作物［9］，通常用于精油提取和干花蕾加工，原料利用率較低，深度加工缺乏基礎(chǔ)研究支持。近年來，苦水玫瑰的分析研究雖然也開始受到關(guān)注［10－12］，但關(guān)于苦水玫瑰抗氧化物質(zhì)的提取和活性研究還未見報道。本文采用乙醇浸提法提取苦水玫瑰花中的抗氧化物質(zhì)，以總抗氧化能力作為評價指標(biāo)，采用中心旋轉(zhuǎn)組合實驗設(shè)計分析提取時間、溫度、液料比和乙醇濃度對苦水玫瑰花抗氧化物質(zhì)提取物總抗氧化能力的影響，通過響應(yīng)面法(RSM)對苦水玫瑰抗氧化物質(zhì)的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定乙醇浸提法提取苦水玫瑰抗氧化物質(zhì)的最佳工藝參數(shù)，以期為甘肅苦水玫瑰花的深加工和提高原料利用率提供科學(xué)參考和理論數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦水玫瑰花 2009年5月中旬上午6～10點間采摘于甘肅永登苦水上新溝村，采后加冰袋迅速降溫，當(dāng)天上午運(yùn)抵實驗室，低溫速凍，凍藏備用，參照邵大偉的方法［13］將原料干制后，分離花瓣和花托，粉碎花瓣，過40目篩備用;無水乙醇、硫酸亞鐵、硫酸、氯化鐵、鹽酸、乙酸鈉、冰乙酸 均為分析純;三吡啶三吖嗪(2，4，6－tripyridyl－s－triazine，TPTZ) 日本TCI，色譜純。

紫外－可見分光光度計UV－2550 日本島津;電子天平AL104型 上海梅特勒－托利多儀器上海有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R－201型 上海申勝生物技術(shù)有限公司;離心機(jī)H－1850R 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總抗氧化能力的測定 鐵離子還原法(ferricreducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)，參照 Benzuie 和Strain 的方法［14］，略做改進(jìn)。

FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線:4.75m L TPTZ工作液(由0.3mol/L的乙酸－乙酸鈉緩沖溶液，pH3.6;10mmol/L TPTZ 溶液;20mmol/L FeCl3溶液按 10∶1∶1 的比例混勻)，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mmol/L FeSO4各0.25m L，以加入0.25m L去離子水為空白，混勻后37℃反應(yīng)10m in，于593nm處測定吸光度，以此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試樣還原活性(FRAP值)以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4的毫摩爾數(shù)表示，每份試樣做3個平行。

1.2.2 單因素實驗 在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度、液料比、提取溫度和提取時間四個因素進(jìn)行單因素實驗，分別考察其對苦水玫瑰花瓣提取物總抗氧化能力的影響，確定各因素的優(yōu)化區(qū)間。稱取玫瑰花瓣干粉5g置于500m L三口燒瓶中，選擇乙醇濃度梯度分別為30%、40%、50%、60%、70%和80%;液料比梯度為 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1;溫度梯度為 30、40、50、60、70、80、90℃;浸提時間梯度為 30、60、90、120、150min。加熱回流提取，熱過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮體積至約70m L，離心取上清液，定容至100m L備用。每份試樣做3個平行。

1.2.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化苦水玫瑰中抗氧化成分的提取工藝參數(shù) 根據(jù)單因素實驗，選取時間(m in)、溫度(℃)、乙醇濃度(%)、液料比(V/m)四個因素為自變量(xi)，以總抗氧化能力(FRAP)為響應(yīng)值(Y)，進(jìn)行中心旋轉(zhuǎn)組合實驗設(shè)計，共30個實驗點，由單因素實驗確定各因素變化區(qū)間。每個實驗點均做三個平行，應(yīng)用Design－Expert7.1軟件建立方差分析模型，選擇P＜0.05的因素作為主效應(yīng)因素，因素水平編碼見表1。

表1 中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計因素水平編碼表

1.2.4 模型的驗證 通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化苦水玫瑰花中抗氧化物質(zhì)的提取條件。在優(yōu)化條件下提取玫瑰花中抗氧化物質(zhì)，通過比較預(yù)測值和實驗值來驗證模型的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 總抗氧化能力(FRAP)工作曲線

以FeSO4濃度為橫坐標(biāo)(x)，593nm處吸光度為縱坐標(biāo)(y)，確定了標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為 y=0.9818x+0.0097，相關(guān)系數(shù)R2為0.9991，表明FeSO4濃度在0.1～0.6μmol·m L－1范圍內(nèi)與其吸光值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，該方程可用于玫瑰總抗氧化能力的定量測定。

圖1 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.2 苦水玫瑰抗氧化物質(zhì)提取單因素實驗結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對提取物抗氧化能力的影響 乙醇濃度對苦水玫瑰花瓣提取物抗氧化能力的影響呈單峰型變化(圖2)，乙醇濃度為40%時提取物的總抗氧化能力最高，當(dāng)乙醇濃度大于40%時，隨著乙醇濃度增加，總抗氧化能力快速下降，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時，提取物的總抗氧化能力較最高值下降了23%。

圖2 乙醇濃度對抗氧化成分提取的影響

2.2.2 液料比對提取物抗氧化能力的影響 隨著液料比的增加，苦水玫瑰花瓣提取物的總抗氧化能力呈上升趨勢(圖3)。說明隨著液料比增加，玫瑰花瓣中抗氧化物質(zhì)的浸出率提高。料液比達(dá)到20∶1后，繼續(xù)增加料液比，提取物的總抗氧化能力無明顯變化。料液比為30∶1的苦水玫瑰花瓣提取物總抗氧化能力僅較料液比為20∶1的提取物總抗氧化能力高1%，考慮到提取成本和后續(xù)處理問題，選用液料比為 20∶1。

圖3 液料比對抗氧化成分提取的影響

2.2.3 溫度對提取物抗氧化能力的影響 溫度對苦水玫瑰花瓣提取物抗氧化能力的影響總體趨勢呈單峰型變化(圖4)，80℃時提取物的總抗氧化能力達(dá)到最大值，是提取溫度為30℃時的1.26倍，說明當(dāng)浸提溫度小于80℃時，隨著浸提溫度升高，玫瑰花瓣中的抗氧化物質(zhì)的浸出率提高。繼續(xù)升溫，提取物的總抗氧化能力有所下降。

圖4 溫度對抗氧化成分提取的影響

2.2.4 時間對提取物抗氧化能力的影響 隨著浸提時間的延長，苦水玫瑰花瓣提取物的總抗氧化能力呈上升趨勢(圖5)，說明隨著浸提時間延長，玫瑰花瓣中抗氧化物質(zhì)的浸出率提高。浸提時間在30m in至60m in之間，提取物的總抗氧化能力增加最為明顯，浸提時間為60m in時，提取物的總抗氧化能力為30m in時的1.16倍，60m in后，提取物的總抗氧化能力略有增加，120m in時總抗氧化能力最高，較60m in時增加了1.4%。120m in后提取物的總抗氧化能力略有降低。這可能是因為隨著加熱時間的延長，部分抗氧化物質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果。

圖5 時間對抗氧化成分提取的影響

2.3 模型的擬合

利用Design－Expert 7.1軟件進(jìn)行方差分析和二次多項回歸擬合實驗，以提取溫度、提取時間、乙醇濃度、液料比為自變量，實驗設(shè)計和響應(yīng)值見表2。擬合所得多元二次回歸方程如下:

總抗氧化能力的預(yù)測值與實際實驗值擬合情況見圖6，顯示預(yù)測值和實驗值擬合良好。模型P＜0.0001，決定系數(shù)(R－squared)為 0.9629，校正系數(shù)(AdjR－squared)為0.9281(表3)，響應(yīng)變量 R2高于0.80，證明此模型顯著，可充分地反映各變量之間的關(guān)系［15］。

圖6 總抗氧化能力的預(yù)測值和實際值的對應(yīng)關(guān)系

表2 中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計和響應(yīng)值

由表 3 可知，x1、x2、x3、x4、x1x2、x1x3、x1x4、x3x4、x21、、項對抗氧化物質(zhì)提取率有顯著影響，其他因素影響不顯著。回歸方程一次項的回歸系數(shù)絕對值大小依次為 x1、x2、x3、x4，表明溫度對抗氧化物質(zhì)提取率的影響最大，其次是液料比、乙醇濃度和時間。不同處理條件對苦水玫瑰中抗氧化物質(zhì)提取物抗氧化能力影響的等高線和響應(yīng)面圖見圖7～圖12。

液料比和乙醇濃度對苦水玫瑰花瓣提取物抗氧化能力的影響(圖7)結(jié)果顯示:當(dāng)總抗氧化能力達(dá)到3231μmol·g－1時，隨著液料比的增加，乙醇濃度需相應(yīng)增加，當(dāng)乙醇濃度超過58%時，液料比增加，其總抗氧化能力不會再提高。因此將液料比控制在20∶1和30∶1之間，乙醇濃度在35%～58%之間時，總抗氧化能力可達(dá)到本次實驗中的最大值。

表3 中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方差分析表

圖7 液料比與乙醇濃度對苦水玫瑰抗氧化成分提取影響的等高線和響應(yīng)面

響應(yīng)面分析溫度與乙醇濃度對苦水玫瑰花瓣提取物抗氧化能力的影響(圖8)結(jié)果顯示:溫度與乙醇濃度存在著協(xié)同作用，即在一定濃度區(qū)域內(nèi)，只有兩者同時升高或同時降低，才能提高總抗氧化能力。當(dāng)二者分別在溫度為75～95℃和乙醇濃度為34%～52%時總抗氧化能力最高，達(dá)到3206μmol·g－1。兩者之間等高線的形狀呈橢圓形，表明交互影響作用很顯著［16］。

圖8 溫度與乙醇濃度對苦水玫瑰抗氧化成分提取影響的等高線和響應(yīng)面

時間與乙醇濃度對苦水玫瑰花瓣提取物抗氧化能力的影響(圖 9)結(jié)果顯示:當(dāng)浸提時間大于60m in，乙醇濃度在25%～50%之間時，總抗氧化能力有最大值，為 3217μmol· g－1，當(dāng)浸提時間小于60m in，乙醇濃度高于50%或低與25%時，總抗氧化能力下降。

圖9 時間與乙醇濃度對苦水玫瑰抗氧化成分提取影響的等高線和響應(yīng)面

溫度與液料比對苦水玫瑰花瓣提取物抗氧化能力的影響(圖10)結(jié)果顯示:溫度在75～95℃之間時，液料比在18∶1到28∶1之間時提取物總抗氧化能力達(dá)最大值，為 3231μmol·g－1。液料比小于 18∶1 時，其對總抗氧化能力的影響較大，液料比大于18∶1時，其對總抗氧化能力影響趨勢趨于平緩。

時間與液料比對苦水玫瑰花瓣提取物抗氧化能力的影響(圖11)結(jié)果顯示:當(dāng)液料比小于20∶1時，隨著浸提時間的延長，提取物總抗氧化能力逐漸增大，當(dāng)液料比大于20∶1時，60min前浸提時間對總抗氧化能力的影響顯著，90m in后浸提時間對提取物總抗氧化能力無顯著影響。

圖10 溫度與液料比對苦水玫瑰抗氧化物質(zhì)提取影響的等高線和響應(yīng)面

圖11 時間與液料比對苦水玫瑰抗氧化物質(zhì)提取影響的等高線和響應(yīng)面

時間與溫度對苦水玫瑰花瓣提取物抗氧化能力的影響(圖12)結(jié)果顯示:浸提時間大于90m in，提取溫度在75～95℃區(qū)間內(nèi)時，提取物總抗氧化能力最大，為 3284μmol·g－1。當(dāng)浸提時間小于 90m in 或溫度高于95℃或低于75℃時，提取物的總抗氧化能力均呈下降趨勢。

圖12 時間與溫度對苦水玫瑰抗氧化物質(zhì)提取影響的等高線和響應(yīng)面

3 結(jié)論

苦水玫瑰中抗氧化物質(zhì)提取的最適工藝條件為:乙醇濃度 50%、液料比 25∶1、溫度 90℃、時間120min。在此條件下，苦水玫瑰中抗氧化成分提取物的總抗氧化能力的預(yù)測值為3365μmol·g－1，驗證實驗所得值為3343.9μmol·g－1，實際值與預(yù)測值之間的相對誤差為0.63%。

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Optimization of extraction technology of antioxidant components from R.Setate×R.Rugosa using response surface methodology

LI Peng－fei，JIANG Yu－mei*，LI Ji－xin，BI Yang，AI Na－si

(Food Science and Engineering College of Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China)

A central composite design was employed to op timize the extraction conditions of antioxidant components from R.Setate ×R.Rugosa by ethanol with four factors:ethanol concentration，the ratio of liquid to solid，temperature and extraction time.And the combined effects of these variables on totalantioxidant power were investigated.Results showed that the generated regression models adequately explained the data variation and significantly rep resented the actual relationship between the independent variables and the responses.The results indicated that the effect order of four factors was as follows:temperature，liquid to solid，ethanol concentration and time.The canonical analysis revealed that the optimal conditions for extraction were:ethanol concentration 50%，the ratio of liquid to solid 25∶1，temperature 90℃，time 120m in.Under optimal conditions，the predicted value of the total antioxidant capacity was 3365μmol·g－1，the testing value was 3343.9μmol·g－1，and its relative error was 0.63%.There were no obvious difference between the testing value and theoretic values from regression equation and the regression model was fitted well.

R.Setate×R.Rugosa;antioxidant capacity;response surface methodology

TS201.1

B

1002－0306(2011)07－0278－05

2010－07－08 *通訊聯(lián)系人

李鵬飛(1985－)，男，在讀碩士，研究方向:天然產(chǎn)物。

科技人員服務(wù)企業(yè)行動項目(2009GJG10042)。