高壓二氧化碳對西瓜汁中過氧化物酶鈍化動力學的研究

劉 野，張 超，許 勇，李 武，趙曉燕，*

(1.北京市農林科學院蔬菜研究中心，北京100097; 2.北京工商大學化學與環(huán)境工程學院，北京100048)

高壓二氧化碳對西瓜汁中過氧化物酶鈍化動力學的研究

劉 野1，2，張 超1，許 勇1，李 武1，趙曉燕1，*

(1.北京市農林科學院蔬菜研究中心，北京100097; 2.北京工商大學化學與環(huán)境工程學院，北京100048)

為了延長西瓜汁的貨架期，研究高壓二氧化碳處理對西瓜汁中過氧化物酶(peroxidase，POD)的鈍化效果。研究以熱處理為對照，比較不同高壓二氧化碳處理溫度和壓強對其POD活性殘存率的影響。采用二段式模型模擬POD的鈍化效果(R2＞0.975)，證明西瓜汁中POD存在敏感型和穩(wěn)定型兩部分。通過動力學分析考察兩種類型POD對溫度和壓強的敏感性，確認高壓二氧化碳處理溫度、壓力、時間、pH和CO2等因素共同導致了POD活性的降低。高壓二氧化碳處理比熱處理可以更加有效鈍化西瓜汁中POD，有助于延長西瓜汁的貨架期。

高壓二氧化碳，西瓜汁，過氧化物酶，動力學分析

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

京玲無籽西瓜(Citrullus lanatus) 種植于北京市農林科學院蔬菜研究中心延慶農場，西瓜經過清洗、去皮，果肉用打漿機打漿，勻漿經過濾得西瓜汁;聚乙烯聚吡咯烷酮 上海Sigma-Aldrich公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、過氧化氫、無水乙醇 北京化工廠;愈創(chuàng)木酚 國藥集團化學試劑有限公司。

天平 瑞士梅特勒-托利多公司;868型pH計美國奧利龍;打漿機 中國珠海飛利浦公司;電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;3-18 SARTORIUS高速離心機 德國賽多利斯;UV-3802紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;高壓二氧化碳殺菌機 中國農業(yè)大學研制，型號CAU-HPCD-1，專利號:ZL200520132590.X。

1.2 實驗方法

1.2.1 西瓜汁的熱處理 量取5mL西瓜汁置于10mL塑料離心管中，放置于30、40、50℃水浴中加熱，處理時間分別為2.5、5、10、20、30min，處理后迅速置于冰水浴中冷卻。

1.2.2 西瓜汁的HPCD處理 HPCD處理釜預熱到設定溫度，量取5mL西瓜汁置于10mL塑料離心管中，將燒杯置于HPCD處理釜中。在30MPa下，設定30、40、50℃，每個溫度下處理時間分別為2.5、5、10、20、30min。在50℃下，設定8、15、22、30MPa，每個壓力下處理時間分別為2.5、5、10、20、30min。處理后迅速從處理釜中取出放入冰水浴冷卻。

1.2.3 POD活性測定 POD活性測定參考Fricks等的方法稍作修改［8］。POD粗酶液的提取:10mL西瓜汁加入1%聚乙烯聚吡咯烷酮，在4℃、10000×g條件下離心20min，取上清液進行酶活性測定。POD的反應體系:2.7mL 200mmol/L pH6.0磷酸緩沖液，0.05mL 0.5%的過氧化氫，0.2mL 2%的愈創(chuàng)木酚和0.05mL粗酶液，加酶液后自動反應3min。470nm波長下測定OD值，每隔30s記錄一次讀數。每毫升西瓜汁每分鐘吸光值變化0.001個單位定義為一個酶活力單位。

1.2.4 動力學分析 西瓜汁中POD活性的鈍化分析采用兩段式模型分析［9］。此模型假設樣品中存在兩類同工酶，即穩(wěn)定型和敏感型:

式中:AL和AS分別為敏感型和穩(wěn)定型酶活性在總酶活中占的比例;kL和kS分別為敏感型和穩(wěn)定型酶活性的鈍化速率(min-1)。

D是指數遞減時間(min)，即在設定的溫度下，酶活性降低90%所需要的時間。

ZP和ZT表示D值對壓強和溫度的敏感性，即D值變化一個對數時對應的壓強或者溫度的變化;P1和P2表示D1和D2對應的壓強。

壓強和溫度對酶鈍化反應的影響分別用Eyring公式和Arrhenius公式分析［5，10］?；罨w積Va(cm3/ mol)和活化能Ea(kJ/mol)表示壓強和溫度對反應常數k的影響;P1和P2、T1和T2表示對應k1和k2的壓強和絕對溫度;R是氣體常數，其值為8.314。

1.2.5 統計分析 采用SAS8.12進行因子方差分析及Ducan’s多重檢驗(P＜0.05)。實驗均做三次重復，以均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 處理時間對西瓜汁中POD活性的影響

從表1可以看出，30℃熱處理30min內不會降低POD的活性。而40℃和50℃熱處理中，POD的活性總體上均呈現下降的趨勢，并且處理30min后活性分別下降了11.70%和17.08%。而在30MPa HPCD處理(圖1)的幾個溫度條件下，從0～2.5min，POD的活性迅速下降;而從2.5～30min，POD的活性下降緩慢。同樣，在50℃HPCD處理(圖2)的幾個壓強條件下，從0～2.5min，POD的活性急劇下降;而2.5～30min，POD的活性下降則較為緩慢。這種先快后慢的下降方式前人曾有報道。陳瑋等報道，胡蘿卜中POD在經過25～45℃、15min熱處理后其活性急劇下降，而后下降的速度變緩［11］。而Liu等研究則發(fā)現，甜菜粗提液中POD活性經35℃熱處理不會發(fā)生變化，經55℃熱處理則隨時間延長呈線性下降的趨勢，到60min時下降了21.7%;而其在HPCD處理中也隨著時間的延長呈線性下降趨勢［7］。

表1 常壓熱處理對西瓜汁中POD殘存活性的影響

2.2 處理溫度對西瓜汁中POD活性的影響

在西瓜汁的熱處理(表1)過程中，除處理時間為10min外，其他處理時間POD的活性總體上都隨著溫度的升高而呈下降趨勢。而在30MPa的HPCD處理(圖1)過程中，與30℃下的POD活性相比，40℃下的酶活性只有在處理時間為30min時顯著降低;而50℃條件下各處理時間點的POD活性與40℃相比均顯著降低。說明在有壓強存在的條件下，西瓜中POD對較低溫度(30～40℃)下的溫度變化不敏感，而隨著溫度的升高(40～50℃)其敏感度會增加。

2.3 處理壓力對西瓜汁中POD活性的影響

如圖2所示，同一處理時間的POD殘存活性隨著壓強的增大而顯著降低(除20min和30min時8MPa和15MPa下的活性)。在50℃、30min時，8、15、 22、30MPa下的殘存酶活依次為77.35%、73.68%、51.78%和42.19%，顯著低于同一溫度和處理時間熱處理的殘存酶活(82.92%)。因此，隨著壓強的增大，POD對溫度的敏感性越來越高。并且，HPCD處理對西瓜汁中POD的鈍化效果明顯好于熱處理。

表2 兩段式模型擬合HPCD處理對西瓜汁中POD鈍化的動力學參數

圖1 30MPa不同溫度HPCD處理對西瓜汁中POD活性的影響

圖2 50℃不同壓力HPCD處理對西瓜汁中POD活性的影響

2.4 西瓜汁中POD鈍化動力學分析

由于30℃熱處理過程中，西瓜汁中POD的活性不發(fā)生變化，因此不能用動力學模型進行擬合。盡管40℃和50℃熱處理對POD的鈍化均符合一級動力學模型，但仍然不能計算出相應的動力學參數。所以無法與HPCD處理的動力學參數進行對比。因此，在這里只做HPCD對西瓜汁中POD鈍化的動力學分析。用式(3)對HPCD處理后西瓜中POD的殘存活性進行擬合，得到R2均大于0.975，因此HPCD處理對POD活性的影響符合兩段式模型。該模型認為在西瓜汁中的POD存在敏感型和穩(wěn)定型兩部分，從而引起兩段式的鈍化。陳瑋等的報道與我們的研究結果相似，認為胡蘿卜中的POD熱鈍化呈兩段形式［11］。曾慶梅等研究表明，碭山梨汁中 POD在50℃、400MPa超高壓處理過程中，從0～34min其活性下降速度呈現先快后慢的趨勢［12］。而另外一些研究認為POD的鈍化都符合一級反應動力學，例如甜菜［7］、甜玉米［13］和番茄汁［14］中的 POD。這種差異是由于不同來源的POD具有不同的性質造成的。

如表2所示，AL和AS分別為西瓜汁POD敏感部分和穩(wěn)定部分所占比例。隨著溫度和壓強的升高，AL逐漸增大，AS逐漸減小，說明溫度和壓強的升高可以促使POD的穩(wěn)定部分向敏感部分轉化。而西瓜汁中POD鈍化的反應速率常數和指數遞減時間分別表示為kL，DL(敏感部分)和kS，DS(穩(wěn)定部分)。并且，同一溫度和壓強下的DL遠小于DS，說明敏感型POD的鈍化速率要遠高于穩(wěn)定型。另外，在同一壓強下，DL和DS值均隨著溫度的升高而逐漸降低。同樣，在同一溫度下，兩者也都隨著壓強的增大而逐漸減小。說明在HPCD處理中溫度和壓強的共同作用導致西瓜汁中POD活性的降低。通常認為，在同樣的處理條件下，Ea和Va值越高表示反應對溫度和壓強的依賴性越大。在表3中，ZT，S(=66.67℃)低于ZT，L(=86.95℃)，而ZP，S(=37.04MPa)高于ZP，L(= 34.48MPa)，說明穩(wěn)定型POD對溫度的敏感性高于敏感型POD，而對壓強的敏感性低于敏感型POD。另外，Ea，S(=28.57kJ/mol)高于Ea，L(=21.86 kJ/mol)，而Va，S的絕對值(=165.91cm3/mol)低于Va，L的絕對值(=178.85cm3/mol)，說明POD穩(wěn)定部分的鈍化對溫度的依賴性高于敏感型POD，而對壓強的依賴性低于敏感型POD。這與Zhi等關于HPCD鈍化蘋果果膠甲基酯酶(PME)的研究結果類似，該研究表明穩(wěn)定型PME比敏感型PME具有更低的ZT值和更高的Ea值［15］。并且Wicker等報道用熱處理鈍化橙汁中PME時，敏感部分的ZT值也高于穩(wěn)定部分［16］。

表3 兩段式模型擬合HPCD處理對西瓜汁中POD鈍化的動力學參數

2.5 西瓜汁中POD鈍化機理的探討

通常認為對酶進行熱鈍化的機理是加熱使原本卷曲成一定構象的酶蛋白伸展開，從而使酶活性中心被破壞而導致失活。而HPCD處理對酶的鈍化機理則比較復雜，比如一些功能基團和起到關鍵作用的金屬離子發(fā)生脫落可以導致酶的活性喪失。另外，pH是對酶活性有重要影響的一個因素。Denès等報道，當pH從7.5調到4.0時，金冠蘋果中的果膠甲基酯酶活性僅存1%［18］。同時酶蛋白中的一些氨基酸可以與CO2結合生成復合物，從而阻礙了酶與底物的結合，使酶的催化效率降低［19］。并且HPCD處理可以改變酶的二級和三級結構，這也是HPCD處理后酶活性變化的原因［20-21］。所以，HPCD處理對西瓜汁中POD的鈍化是溫度、壓力、處理時間、pH、CO2等一系列因素綜合作用的結果。

3 結論與討論

3.1 熱處理30℃條件下，與對照相比，POD活性不發(fā)生變化;而40℃和50℃條件下，其活性隨著處理時間的延長而呈現一定程度的下降。并且，在同一處理時間下，POD的活性也隨著溫度的升高而顯著降低。在50℃、30min其鈍化率為17.08%。從節(jié)約能源的角度考慮，工業(yè)生產中可以采用50℃、2.5min的處理條件即可以鈍化西瓜汁中的大部分POD活性。

3.2 在HPCD處理中，POD的活性的下降隨時間呈現先急后緩的趨勢;并且隨著溫度的升高和壓強的增大而顯著降低。在30MPa、50℃、30min其鈍化率為57.81%。用兩段式模型可以對POD的降低趨勢進行很好的擬合，說明西瓜汁中POD存在敏感型和穩(wěn)定型兩部分。敏感型POD的鈍化速率約高于穩(wěn)定型兩個數量級以上。并且與穩(wěn)定型相比，敏感型對溫度的敏感性較低，對壓力的敏感性較高。

3.3 HPCD處理對POD的鈍化是溫度、壓力、時間、pH和CO2等因素共同作用的結果。雖然HPCD對西瓜汁中POD具有較好的鈍化效果，但其鈍化機理及其對酶結構的影響仍有待進一步的研究。

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Inactivation of peroxidase in watermelon juice by high pressure carbon dioxide

LIU Ye1，2，ZHANG Chao1，XU Yong1，LI Wu1，ZHAO Xiao-yan1，*
(1.Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China; 2.School of Chemical and Environmental Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

The effect of high pressure carbon dioxide(HPCD)on peroxidase(POD)activity in watermelon juice was evaluated to extent its shelf-life with the thermal treatments as a control.The experimental plots were well fit by the two-fraction model(R2＞0.975)，suggested that the POD in the watermelon juice included labile and stable fractions.The two fractions had the different sensitivity to the temperature and pressure by the kinetics analysis. Moreover，it was concluded that the combined effects of temperature，pressure，treatment time，pH，and CO2were suggested as the cause of POD inactivation.Consequently，HPCD treatment showed a great capacity to inactive POD of watermelon juice than the thermal treatment，being an option to extend its shelf-life.

high pressure carbon dioxide;watermelon juice;peroxidase;kinetics analysis

TS255.44

A

1002-0306(2011)07-0160-04

在西瓜的加工產品中，西瓜汁越來越受到消費者歡迎，其消費量快速增長［1］。但由于西瓜汁中過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性很高，會導致西瓜汁在貯藏過程中發(fā)生顏色和風味的變化［2］。而西瓜又屬于熱敏性水果，傳統的熱加工會使西瓜汁產生“煮熟味”，并且會使西瓜汁中的呈色物質聚集形成沉淀，嚴重影響西瓜的感官品質［3］。所以，傳統熱處理手段不適于西瓜汁的加工。高壓二氧化碳(High Pressure Carbon Dioxide，HPCD)是一種新型的非熱技術，在食品加工中有著越來越廣泛的應用。該技術可以在較低的溫度下鈍化酶活性和殺滅微生物，有效保持食品的營養(yǎng)成分和感官品質［4］。而且，二氧化碳很易從食品體系中排出，不會產生食品安全的隱患。因此，利用HPCD處理鈍化食品體系酶活性的研究越來越多。Balaban等研究證明HPCD可以有效鈍化橙汁中的果膠酯酶［5］。Gui等發(fā)現HPCD處理可以將蘋果汁中的多酚氧化酶活性鈍化至60%以上(55℃、30MPa處理60min)［6］。Liu等發(fā)現HPCD處理可以將甜菜粗提液中過氧化物酶活性鈍化至86%(55℃、37.5MPa處理60min)［7］。但是，HPCD處理在西瓜汁加工中的應用至今還未見報道。本文通過動力學分析考察了HPCD處理中溫度、壓強和處理時間對西瓜汁中POD活性的影響，并通過動力學分析探討其鈍化機理。

2010-06-10 *通訊聯系人

劉野(1981-)，男，博士研究生，主要從事食品非熱加工技術方面的研究。