復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的研究

汪 薇，肖燕清，白衛(wèi)東

(仲愷農業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東廣州 510225)

復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的研究

汪 薇，肖燕清，白衛(wèi)東*

(仲愷農業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東廣州 510225)

選用瑞士乳桿菌和乳酸乳球菌混合發(fā)酵產雙乙酰。研究表明，當發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、牛奶與奶油濃度之比、反應體系的pH、乳糖添加量和檸檬酸添加量分別為32h、37℃、3∶1、6.5、1.0%和2.0%時，雙乙酰的產量達到了125mg/L。此外，添加乳糖和檸檬酸能大大促進產物雙乙酰的積累。

雙乙酰，發(fā)酵，乳酸菌

雙乙酰，又名丁二酮、聯乙酰等，經稀釋后呈強烈的奶油香氣，是乳制品中一種重要的風味物質，主要用于配制奶制品香精(黃油、乳酪、牛奶、酸乳酪)和香草、巧克力、糖果、堅果、咖啡以及水果等香精。天然的雙乙酰存在于茴香μ月桂油、香旱芹子油、樹莓、水仙μ郁金香μ覆盆子μ草莓μ熏衣草μ香茅、巖薔薇及奶油中。在食品工業(yè)中，雙乙酰主要用作軟飲料μ冷飲μ焙烤食品糖果等的增香劑，在乳發(fā)酵制品的滋味與香味中，雙乙酰也是起作用的重要化合物之一［1］。目前國內雙乙酰的生產工藝主要是采用亞硝化法，但該工藝在制備過程產生大量硫酸氫鈉，難以回收，且亞硝酸類物質毒性大、沸點低，對環(huán)境危害嚴重［2］。隨著人們生活水平的提高，以及對食品安全的關注度不斷提升，其使用效果和安全性已經不能滿足消費者和食品香精香料行業(yè)的發(fā)展需求。于是，國內外的研究重點轉向了采用崇尚自然、回歸自然的微生物發(fā)酵法來制備雙乙酰。不同微生物產雙乙酰的能力差別較大，Anuradha等利用乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰，其產量達64mg/g葡萄糖［3］;Jyoti等選擇不同的底物進行發(fā)酵，雙乙酰最高產量可達0.1g/g葡萄糖［4］;東北農業(yè)大學于鵬等人對乳酸乳球菌乳酸亞種采用亞硝基胍進行誘變選育，但其產量僅為0.72mg/L［5］;北京工商大學宋煥祿等發(fā)酵檸檬酸鹽產雙乙酰，最高產量為98mg/L［6］。本文利用兩株乳酸菌進行混合發(fā)酵，研究了不同發(fā)酵條件以及添加碳源和檸檬酸鹽對該復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的影響，建立了一條高產雙乙酰的發(fā)酵路線。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

瑞士乳桿菌(GIM 1.157) 購自廣東省微生物研究所;乳酸乳球菌乳亞種6018 購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;脫脂奶粉 新西蘭進口分裝;無鹽奶油 上海光明乳業(yè)股份有限公司;其他試劑 均為市售分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵方法 用脫脂奶粉配制10%的牛奶，取等量10%的牛奶與奶油在三角瓶中攪拌均勻，于85℃水浴滅菌15m in，降至室溫后，接入10%活化好的復合乳酸菌，其中，瑞士乳桿菌和乳酸乳球菌的菌量為1∶1，于恒溫搖床中37℃進行發(fā)酵28h后，取樣測量雙乙酰含量。

1.2.2 雙乙酰含量的測定［7］

1.2.2.1 雙乙酰標準曲線的測定 用脫脂奶粉配制10%的牛奶，于121℃滅菌10m in后迅速冷卻，加等體積16%三氯乙酸溶液，混勻，3500×g離心10min，然后分別取上清液10m L加入兩支試管(1號和2號)中，其中1號管中加入1%的鄰苯二胺溶液0.5m L，2號管不加。兩管搖勻后置于黑暗處放置30m in，然后分別向1號管和2號管中加入4.0mol/L HCl溶液2.0m L和2.5m L終止反應。以2號管作為參比，利用紫外－可見分光光度計在335nm波長下測定其OD值。每樣至少做2個平行，取平均值，然后以雙乙酰濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2.2 樣品中雙乙酰含量的測定 取待測乳樣，加等體積16%三氯乙酸溶液，混勻，3500×g離心10m in，取澄清的上清液稀釋至適當濃度，按照1.2.2.1中的方法對樣品中雙乙酰的含量進行測定。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵時間對復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的影響

由圖1可知，復合乳酸菌對底物奶油和牛奶的混合物進行發(fā)酵，隨著發(fā)酵時間的延長，雙乙酰的產量明顯提高，當發(fā)酵時間為32h時達到最高，約為55mg/L，之后，隨著發(fā)酵時間的延長，雙乙酰的產量略有減少，當發(fā)酵時間超過36h，雙乙酰的產量迅速下降。根據Kempler和Mckay提出的雙乙酰的發(fā)酵代謝途徑［8］，這可能是因為發(fā)酵所得的雙乙酰能在3－羥基丁酮脫氫酶的作用下可逆地生成3－羥基丁酮，并進一步轉化為2，3－丁二醇所致。因此，發(fā)酵時間過長會導致雙乙酰產量的下降。綜上可知，適宜的發(fā)酵時間為32h。

圖1 發(fā)酵時間對復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的影響

2.2 發(fā)酵溫度對復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的影響

微生物細胞內的酶類對溫度比較敏感，溫度過高會使其鈍化，而溫度過低會抑制酶的活性。取等量的10%的牛奶與奶油在三角瓶中攪拌均勻，于85℃水浴滅菌15m in，降至室溫后，接入10%活化好的復合乳酸菌，于不同溫度的恒溫搖床中進行發(fā)酵32h后，測量雙乙酰含量，結果如圖2所示。當發(fā)酵溫度低于37℃時，溫度的升高有利于雙乙酰的累積;當發(fā)酵溫度高于37℃，雙乙酰的產量迅速下降，原因可能涉及兩個方面，一方面，這可能是由于隨著溫度的升高，細胞內酶變性失活的速度增大，從而使酶促反應速度急劇下降，產物的產量也隨之減少;另一方面，一般乳酸菌的適宜生長溫度也是37℃，當發(fā)酵溫度與生長溫度一致時，有利于反應所需酶系的分泌，保證酶活性的穩(wěn)定，有利于該反應的進行。

2.3 底物濃度之比對復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的影響

本研究采用不同比例的10%的牛奶與奶油的混合物，接入活化好的復合乳酸菌，于37℃的恒溫搖床中進行發(fā)酵32h后，測量雙乙酰含量。由圖3可知，牛奶與奶油的比例對雙乙酰產量的影響比較顯著。當牛奶與奶油的濃度之比為5.0時，雙乙酰產量不到15mg/L，隨著牛奶比例的減少，奶油比例的增加，雙乙酰的產量顯著增加，當兩者比例為3.0時，雙乙酰產量達到了67mg/L。之后，隨著奶油所占比例的繼續(xù)增加，雙乙酰的產量緩慢下滑?？梢?，適宜的底物濃度之比為牛奶與奶油比例為3.0。

圖2 發(fā)酵溫度對復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的影響

圖3 底物濃度之比對復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的影響

2.4 反應體系的pH對復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的影響

反應體系pH的改變會影響細胞內酶分子的活性構象，影響底物與酶分子的“誘導契合”，進而影響酶反應速度。此外，反應體系的pH還會影響細胞膜所帶的電荷、底物和產物分子的離子化程度，從而影響微生物細胞的生物轉化。鑒于此，對比研究了復合乳酸菌細胞在不同反應體系pH環(huán)境下發(fā)酵產雙乙酰的情況，考察了不同反應體系pH對該反應的影響規(guī)律。

本研究所采用的底物為3∶1的10%的牛奶和奶油，攪拌均勻并調節(jié)其pH，滅菌后接入活化好的復合乳酸菌，于恒溫搖床中37℃進行發(fā)酵32h后，取樣測量雙乙酰含量，結果如圖4所示。隨著反應體系的pH從3.5升至6.5，復合乳酸菌發(fā)酵所得雙乙酰的產量隨之迅速增加，并均在pH為6.5時達到最高，當反應體系的pH繼續(xù)升高，雙乙酰的產量出現明顯的下降趨勢，這可能是近中性的pH環(huán)境不適合乳酸菌的生長，進而導致相關酶系的分泌減少所致。綜合考慮，復合乳酸菌細胞發(fā)酵制備雙乙酰的最適pH選擇6.5為宜。

圖4 反應體系的pH對復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的影響

2.5 添加不同碳源對復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的影響

根據Kempler和Mckay提出的雙乙酰的發(fā)酵代謝途徑［8］，微生物細胞對糖類物質進行代謝，轉化為葡萄糖后進入糖酵解途徑，進而轉化為丙酮酸，再進一步轉化為雙乙酰。于是，我們嘗試向反應體系中添加不同碳源，考察其對復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的影響。本研究以牛奶和奶油為底物，調節(jié)其pH為6.5，并嘗試添加不同碳源，然后接入復合乳酸菌，于恒溫搖床中37℃進行發(fā)酵32h后，取樣測量雙乙酰含量。由圖5可知，在添加的幾種碳源中，復合乳酸菌對乳糖的利用效率最高。以乳糖為碳源時，雙乙酰的產量達到了78mg/L。復合乳酸菌對果糖、葡萄糖、蔗糖和木糖的利用效率均不夠理想，這可能是因為所選用的復合乳酸菌內的半乳糖苷酶、半乳糖激酶比較豐富，因此能大量代謝乳糖生成雙乙酰，故而選擇乳糖作為適宜的碳源。

圖5 添加不同碳源對復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的影響

2.6 乳糖添加量對復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的影響

復合乳酸菌能利用乳糖作為底物轉化為雙乙酰。一般來說，對于生物催化過程而言，底物在適宜的范圍內有利于產物的生成，當底物濃度超過一定范圍，可能導致底物抑制，影響產物的積累。為此，對比研究了不同乳糖添加量對復合乳酸菌細胞發(fā)酵產雙乙酰的影響。本研究以牛奶和奶油為底物，調節(jié)其pH為6.5，添加不同含量的乳糖，然后接入復合乳酸菌，于恒溫搖床中37℃進行發(fā)酵32h后，取樣測量雙乙酰含量。由圖6可知，不添加乳糖時，雙乙酰產量僅為67mg/L。當添加乳糖之后，雙乙酰產量迅速增加，所添加的乳糖量為1.0%時，雙乙酰產量達到了98mg/L，之后隨著乳糖添加量的繼續(xù)增加，雙乙酰產量明顯下降，這可能是過高的乳糖濃度導致底物抑制所致。綜上可知，乳糖添加量為1.0%較為適宜。

圖6 乳糖添加量對復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的影響

2.7 檸檬酸添加量對復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的影響

由于乳酸菌還可利用檸檬酸產生丙酮酸，進而合成雙乙酰，此外，檸檬酸的加入可部分阻遏丁二酮還原酶的產生，促進雙乙酰的積累［6］，因此，本文嘗試向反應體系中添加檸檬酸，考察其對復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的影響。本研究以牛奶和奶油為底物，調節(jié)其pH為6.5，添加1%的乳糖和不同含量的檸檬酸，然后接入復合乳酸菌，于恒溫搖床中37℃進行發(fā)酵32h后，取樣測量雙乙酰含量。由圖7可知，添加適量的檸檬酸的確能促進雙乙酰的積累，當檸檬酸的添加量達到2.0%時，雙乙酰的產量高達125mg/L，當檸檬酸添加量繼續(xù)增加，雙乙酰的產量出現較明顯的下降趨勢，這可能也是底物抑制所致，所以檸檬酸的添加量選擇2.0%為宜。

圖7 檸檬酸添加量對復合乳酸菌發(fā)酵產雙乙酰的影響

3 結論

本文以牛奶和奶油為底物，選用瑞士乳桿菌和乳酸乳球菌混合發(fā)酵產雙乙酰。研究表明，添加乳糖和檸檬酸能大大促進產物雙乙酰的積累，當發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、牛奶與奶油濃度之比、反應體系的pH、乳糖添加量和檸檬酸添加量分別為32h、37℃、3∶1、6.5、1.0%和2.0%時，雙乙酰的產量最高，達到了125mg/L，較之國內外目前的報道有明顯的提高。下一步，本課題組一方面將研究選擇廉價易得的底物進行發(fā)酵制備雙乙酰，以降低生產成本;另一方面，探究所選用菌種的生長特性、代謝途徑及其協同作用，以進一步提高雙乙酰產量。

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Production of dimethylglyoxal fermented by compound lactobacillus

WANG Wei，XIAO Yan－qing，BAI Wei－dong*

(College of Light Industry and Food Science，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China)

Production of dimethylglyoxal fermented by lactobacillus helveticus and lactococcuslac tis was conducted.The result showed that when fermentation time，fermentation temperature，the ratio of milk to c ream，pH of the reaction system，the addition amount of lactose and the addition amount of citric acid were 32h，37℃，3∶1，6.5，1.0%and 2.0%，respectively，the yield of dimethyl glyoxal reached 125mg/L.Additionally，the addition of lactose and citric acid could greatly promote the accumulation of dimethylglyoxal.

dimethylglyoxal;ferment;lactobacillus

TS201.3

A

1002－0306(2011)07－0214－03

2010－03－07 *通訊聯系人

汪薇(1981－)，女，講師，主要從事香精香料的開發(fā)利用。

廣州市黃埔區(qū)科技計劃項目(1025);仲愷農業(yè)工程學院自然科學基金(G3091415)。