α-葡萄糖苷酶的異源表達(dá)及純化研究進(jìn)展

吳孔陽，陳桂光，黃時(shí)海，張?jiān)崎_，于 嵐，梁智群，*

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004; 2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005)

α-葡萄糖苷酶的異源表達(dá)及純化研究進(jìn)展

吳孔陽1，陳桂光2，黃時(shí)海2，張?jiān)崎_2，于 嵐2，梁智群2，*

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004; 2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005)

α－葡萄糖苷酶是工業(yè)生產(chǎn)低聚異麥芽糖的關(guān)鍵酶，應(yīng)用領(lǐng)域較廣，目前α－葡萄糖苷酶有大腸桿菌、酵母等表達(dá)系統(tǒng)，但酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)α－葡萄糖苷酶更具有顯著的優(yōu)勢(shì)。層析是分離純化α－葡萄糖苷酶的重要途徑。概述了α－葡萄糖苷酶及其異源表達(dá)、分離純化的最新研究進(jìn)展，以便為該酶的深入研究和應(yīng)用提供借鑒作用。

α－葡萄糖苷酶，低聚異麥芽糖，異源表達(dá)，純化

α－葡萄糖苷酶(α－glucosidase，EC.3.2.l.20)，又名α－D－葡萄糖苷水解酶或α－葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，廣泛存在于許多植物、動(dòng)物、微生物中。根據(jù)其底物特異性和蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)，將該酶分成α－葡萄糖苷酶Ⅰ、Ⅱ兩個(gè)家族，也就是糖苷水解酶(GH)家族13和31，還可將該酶分成α－葡萄糖苷酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，這三種類型［1－2］。例如，α－葡萄糖苷酶家族Ⅰ中的成員，能夠水解不同質(zhì)底物如對(duì)硝基苯基－α－吡喃葡萄糖苷和蔗糖，且屬于α－葡萄糖苷酶Ⅰ型，而α－葡萄糖苷酶家族Ⅱ中的成員則較易水解同質(zhì)底物如可溶性淀粉、糖原和麥芽低聚糖等，且屬于α－葡萄糖苷酶Ⅲ型［3－4］。大多數(shù)α－葡萄糖苷酶可以水解麥芽糖并發(fā)生轉(zhuǎn)苷作用。例如，黑曲霉α－葡萄糖苷酶能從麥芽糖等分子中的非還原末端切開α－1，4糖苷鍵，釋放出葡萄糖，并能將游離出的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一個(gè)葡萄糖分子或麥芽糖等分子中的α－1，6位，形成異麥芽糖、潘糖等低聚異麥芽糖［5］。低聚異麥芽糖(isomaltooligosaccharides，IMOs)能使人體內(nèi)的雙歧桿菌得到顯著增殖［6－7］，促進(jìn)食物的消化吸收，調(diào)整腸道內(nèi)的菌群，增加有益菌的比例，維持腸道正常功能等。將具有潛在價(jià)值的α－葡萄糖苷酶基因轉(zhuǎn)入到其它適于工業(yè)化生產(chǎn)的工程菌中，實(shí)現(xiàn)低成本、高效率表達(dá)，用于轉(zhuǎn)苷生產(chǎn)低聚異麥芽糖，具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值［7］。

1 α－葡萄糖苷酶簡述

α－葡萄糖苷酶屬于鍵專一性酶，其相對(duì)分子質(zhì)量一般在40000～145000之間［8，32］。α－葡萄糖苷酶等電點(diǎn)一般在pH 3.0～5.0之間，但最適pH可以超過7. 0［9］。研究人員對(duì)不同來源的α－葡萄糖苷酶的分子結(jié)構(gòu)做了大量研究，但僅少數(shù)一級(jí)結(jié)構(gòu)得以確認(rèn)，對(duì)其活性中心和高級(jí)結(jié)構(gòu)，催化基團(tuán)等方面的研究仍未弄清楚。有些α－葡萄糖苷酶為糖蛋白或者部分糖基化，Takayanagi等［10］從黑曲霉α－葡萄糖苷酶中分離出7種低聚糖，主要含有甘露糖、N－乙酰葡萄糖胺和半乳糖等。此外，有相關(guān)文獻(xiàn)［11－13］報(bào)道了關(guān)于α－葡萄糖苷酶的水解轉(zhuǎn)苷機(jī)制及底物識(shí)別等方面的研究。

表1 國內(nèi)外部分已克隆表達(dá)的α－葡萄糖苷酶基因

2 α－葡萄糖苷酶的異源表達(dá)概況

現(xiàn)已報(bào)道的α－葡萄糖苷酶異源表達(dá)的例子很多，α－葡萄糖苷酶基因的來源主要集中在嗜熱菌屬、曲霉屬、大麥等(見表1)。表達(dá)所選用的宿主主要是大腸桿菌和畢赤酵母，此外也有研究人員選用釀酒酵母及其他絲狀真菌。

2.1 α－葡萄糖苷酶的在原核生物中的表達(dá)

大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的基因表達(dá)工具，因其簡單、廉價(jià)、高效的特性而成為蛋白質(zhì)表達(dá)及功能研究的首選。Martino等［14］從硫化葉菌MT－4菌株(Sulfolobus solfataricusMT－4)中擴(kuò)增其α－葡萄糖苷酶基因，在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，濕生物質(zhì)的酶活可達(dá)到87.5U/g，且重組嗜熱α－葡萄糖苷酶的性質(zhì)與商品化黑曲霉α－葡萄糖苷酶相當(dāng)。該重組酶可以在高溫下作用更長時(shí)間，整個(gè)工藝過程能保證高的底物溶解性和生物反應(yīng)器的無菌狀態(tài)，因而使其在糖化工藝中更有競(jìng)爭力。本課題組利用大腸桿菌工程菌 DHS－2，表達(dá)來源于黑曲霉(Aspergillus niger)M－1菌株的高轉(zhuǎn)苷活性α－葡萄糖苷酶基因，并對(duì)DHS－2的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，重組 α－葡萄糖苷酶活力由 178.53U/mL提高到618.75U/mL。質(zhì)粒穩(wěn)定性研究表明，DHS－2在傳代100代以內(nèi)，質(zhì)粒的保留率為82%以上，表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，并且工程菌能夠?qū)⒏邼舛塞溠刻?25%)有效地轉(zhuǎn)化為低聚異麥芽糖［15－16］。Nakao等［17］曾將枯草芽孢桿菌α－葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中表達(dá)，重組酶有較寬的底物特異性和高的熱穩(wěn)定性，十分有利于轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到連續(xù)生產(chǎn)低聚糖的目的。

Nashiru等［18］首次報(bào)道了一株嗜熱菌α－葡萄糖苷酶基因的序列，并將該基因在大腸桿菌中表達(dá)，重組酶活力是天然酶的10倍。Wang等［19］將一株具有潛在工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的嗜熱厭氧乙醇菌JW200的α－葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中表達(dá)，所獲得的重組酶能夠?qū)⒏邼舛塞溠刻侨芤?40%)轉(zhuǎn)化生成低聚糖，轉(zhuǎn)化率達(dá)到52%，形成的低聚糖中有83%的組分為低聚異麥芽糖(異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖)。這與其他來源的α－葡萄糖苷酶所形成的轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物不同，比如釀酒酵母和黑曲霉α－葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物主要是異麥芽糖、潘糖，而地芽孢桿菌α－葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物則是異麥芽糖。

此外，α－葡萄糖苷酶還可以在枯草芽孢桿菌系統(tǒng)中表達(dá)，Hung等［20］將一株分離自深海沉積物中的細(xì)菌Geobacillusα－葡萄糖苷酶基因在枯草芽孢桿菌中過量表達(dá)，并進(jìn)行了定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明除了Asp199、Asp326、Glu256位氨基酸以外，Asp98也是保證酶活性所必須的氨基酸，重組酶和天然酶的分泌量都在2g/L左右，而且它們的酶學(xué)性質(zhì)相似。

2.2 α－葡萄糖苷酶在真核生物中的表達(dá)

雖然原核表達(dá)技術(shù)已十分成熟，且能在較短的時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，且所需的成本相對(duì)較低，但還存在許多難以克服的缺點(diǎn)，如目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，致使產(chǎn)物純化困難;原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低等。這也使得一些α－葡萄糖苷酶基因需要其他系統(tǒng)才能實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，其中比較理想的是酵母表達(dá)系統(tǒng)。因其具有:a.營養(yǎng)要求簡單、生長快、操作方便、易于培養(yǎng)和遺傳操作［21］，b.對(duì)蛋白進(jìn)行翻譯后的加工修飾如糖基化、脂酰化、磷酸化以及蛋白裂解、折疊、二硫鍵的形成等［22］，c.發(fā)酵工藝成熟、易放大［23］，d.重組蛋白表達(dá)量高［24］，e.安全性高等優(yōu)點(diǎn)［25］，已成為生產(chǎn)重組蛋白的重要工具。此外，在大腸桿菌中以包涵體形式出現(xiàn)的蛋白在酵母中表達(dá)時(shí)可生成可溶性的蛋白，易于分離純化。

Hostinová等［26］將復(fù)膜孢酵母屬的α－葡萄糖苷酶基因在釀酒酵母中進(jìn)行了異源表達(dá)，重組酶主要集中在細(xì)胞表面，同樣能夠水解麥芽低聚糖，但是不能夠水解可溶性淀粉，這與α－葡萄糖苷酶的底物特異性相一致。來源于黑曲霉、構(gòu)巢曲霉的α－葡萄糖苷酶被證實(shí)具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)苷活性［27］，尤其是對(duì)黑曲霉α－葡萄糖苷酶的異源表達(dá)研究成為熱點(diǎn)，作為工業(yè)生產(chǎn)菌株黑曲霉GN－3(Aspergillus nigerGN－3)多次成為異源表達(dá)的基因來源，并取得一系列成果。Nakamura等［28］克隆得到黑曲霉GN－3菌株的α－葡萄糖苷酶基因，序列分析表明，該菌株α－葡萄糖苷酶基因含有3個(gè)內(nèi)含子，cDNA序列全長2955bp，編碼985個(gè)氨基酸，并將其導(dǎo)入構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)中進(jìn)行表達(dá)，酶活力達(dá)到0.4mU/mg。Lee等［29］通過構(gòu)建新的重組質(zhì)粒，將Aspergillus nigerGN－3的α－葡萄糖苷酶基因在Aspergillus niger中表達(dá)，轉(zhuǎn)化子的酶活力達(dá)到240mU/mg，極大提高了酶活力，這對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)極為有利，并將其應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中。之后，Ogawa等［30］又將該菌株的α－葡萄糖苷酶基因在構(gòu)巢曲霉中進(jìn)行表達(dá)研究，盡管重組酶的分子量比出發(fā)菌株稍低一些，但是兩者的最適pH和底物特異性依然相近。Tong和 Chen等采用Overlap－PCR方法擴(kuò)增得到黑曲霉(NO.SG136) α－葡萄糖苷酶基因［31］和RT－PCR方法擴(kuò)增得到黑曲霉(CICIM F0620)α－葡萄糖苷酶基因［32］，先后將這兩種方法獲得的基因在畢赤酵母中表達(dá)，結(jié)果表明，得到的重組α－葡萄糖苷酶活力相差近25倍(0.08U/mL VS 2.07U/mL)，并認(rèn)為前者酶活低可能原因是由于所得的α－葡萄糖苷酶基因序列在酵母中的不識(shí)別和靶基因的低拷貝數(shù)所致。值得提出的是，黑曲霉(CICIM F0620)α－葡萄糖苷酶在酵母中表達(dá)的酶活力是迄今已報(bào)道的黑曲霉α－葡萄糖苷酶的最高水平。

此外，植物來源α－葡萄糖苷酶的異源表達(dá)主要集中在對(duì)大麥的研究上，同樣也取得較大突破，α－葡萄糖苷酶在谷類作物種子萌發(fā)、淀粉降解過程中起到重要作用。最早是Tibbot等［33］將其在畢赤酵母中表達(dá)，該研究表明植物糖酶可以在畢赤酵母中進(jìn)行異源表達(dá)，使得通過基因修飾來獲取所期望的工業(yè)性狀的重組酶成為可能。Muslin等［34］同樣將大麥來源的α－葡萄糖苷酶在畢赤酵母中表達(dá)，通過40L發(fā)酵罐的放大實(shí)驗(yàn)，分泌蛋白的產(chǎn)量達(dá)到2g/L，比之前他們用搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果高出12倍多(2g/L VS 0.15g/L)，他們還首次報(bào)道了底物對(duì)任何α－葡萄糖苷酶都有抑制作用。

3 α－葡萄糖苷酶分離純化的研究

3.1 表達(dá)檢測(cè)的方法

α－葡萄糖苷酶可與許多底物作用，且方法簡便靈敏度較高使得篩選工作很方便。目前篩選重組轉(zhuǎn)化子和檢測(cè)酶活大致有 3種方法:a.發(fā)色底物(pNPG)測(cè)定α－葡萄糖苷酶活力，采用對(duì)－硝基苯酚－α－D－吡喃葡萄糖苷(pNPG)(其為無色)作底物，經(jīng)α－葡萄糖苷酶水解α－1，4－葡萄糖苷鍵后可以釋放出對(duì)－硝基苯酚(pNP)(堿性條件下是黃色)，因此可以通過測(cè)定400～420nm之間的吸光度;b.Knight－Allen法:測(cè)定其催化甲基－α－D－吡喃葡萄糖苷分解產(chǎn)生的葡萄糖，依據(jù)輔助酶的不同，檢測(cè)葡萄糖方法又可分為葡萄糖氧化酶法、葡萄糖脫氫酶法和己糖激酶法，以葡萄糖氧化酶法較為常用［35］;c.熒光法，利用4－甲基傘形吡喃葡萄糖苷［36］、9－羥基異吩噻唑［37］等具有強(qiáng)烈熒光的特點(diǎn)，將它們衍生為無熒光的底物，以此進(jìn)行測(cè)定。

3.2 重組α－葡萄糖苷酶的純化方法

在重組α－葡萄糖苷酶的分離純化中，與其它層析方法相比，親和層析的純化能力更為強(qiáng)大，一步純化就可以得到很高的純度，可以使酶純化很多倍，活性蛋白的回收率通常很高，而且可以純化其它方法難以分離的蛋白質(zhì)。由于構(gòu)建的載體攜帶有親和標(biāo)簽，這樣就可以通過親和層析純化蛋白，比如6個(gè)組氨酸標(biāo)簽等。Naested等［38］構(gòu)建的畢赤酵母工程菌，其重組的α－葡萄糖苷酶的N端、C端均帶有組氨酸標(biāo)簽。研究發(fā)現(xiàn)，只有N端的多聚組氨酸標(biāo)簽可以較弱地與鎳柱進(jìn)行親和層析，最后用咪唑?qū)⑵湎疵撓聛怼端標(biāo)簽不能與之結(jié)合，可能是由于形成的融合蛋白將其包埋所致。

疏水層析色譜、離子交換色譜、凝膠過濾色譜等方法也常用于重組α－葡萄糖苷酶的分離純化，通常是幾種分離方法同時(shí)使用，這樣可以達(dá)到理想的分離效果［19，32，34］。

4 展望

低聚異麥芽糖生產(chǎn)的關(guān)鍵酶制劑是α－葡萄糖苷酶［39］。雖然α－葡萄糖苷酶用途廣泛，但就是缺少大量廉價(jià)的酶源供應(yīng)。目前國內(nèi)生產(chǎn)低聚異麥芽糖用α－葡萄糖苷酶主要依賴于進(jìn)口，多為日本天野酶制劑公司提供，該制品從黑曲霉(Aspergillus niger)發(fā)酵制?。?1］。黑曲霉α－葡萄糖苷酶屬胞內(nèi)酶，胞外酶的含量很低。如用傳統(tǒng)的破壁方法從菌體中提取該酶，不僅周期長，成本高，而且工藝比較復(fù)雜。從酶法轉(zhuǎn)化工藝路線的長短、技術(shù)的可行性和經(jīng)濟(jì)性、今后的實(shí)際應(yīng)用前景等方面考慮，構(gòu)建α－葡萄糖苷酶基因高效低成本的表達(dá)系統(tǒng)、降低制酶費(fèi)用、一步轉(zhuǎn)化麥芽糖得到低聚異麥芽糖是一個(gè)可以期待的研究方向。事實(shí)上，目前解決酶源問題的一個(gè)重要方法就是通過α－葡萄糖苷酶的異源表達(dá)，實(shí)現(xiàn)大量廉價(jià)獲得α－葡萄糖苷酶的目標(biāo)。α－葡萄糖苷酶已通過大腸桿菌、酵母、絲狀真菌等成熟表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá)，雖然得到了一些高表達(dá)量的工程菌株，但是總體看來，表達(dá)量仍然需要進(jìn)一步提高才能滿足工業(yè)上的需要。從現(xiàn)有的報(bào)道來看，α－葡萄糖苷酶異源表達(dá)呈現(xiàn)出多源化途徑，毋庸置疑，曲霉屬的α－葡萄糖苷酶很多都具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)苷活性［27］，相比之下，真核表達(dá)系統(tǒng)以其特有的優(yōu)勢(shì)，在表達(dá)該種來源的α－葡萄糖苷酶方面更具有吸引力。此外，隨著新的純化方法的出現(xiàn)，重組酶的分離純化過程將會(huì)變得更加快捷。

本課題組采用的pSE380載體為胞內(nèi)表達(dá)型，其表達(dá)產(chǎn)物可能會(huì)被大腸桿菌蛋白酶降解，從而導(dǎo)致表達(dá)水平下降，今后可以考慮選擇具有更為高效的表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)較高水平表達(dá)。若采用分泌型的質(zhì)粒表達(dá)該α－葡萄糖苷酶基因可能會(huì)提高目的蛋白的表達(dá)量。隨著進(jìn)一步的研究，通過考慮多重因素來設(shè)計(jì)高效表達(dá)方案以及新的表達(dá)系統(tǒng)的出現(xiàn)，相信在不久的將來，α－葡萄糖苷酶的異源表達(dá)將會(huì)取得更多突破，將會(huì)在基因工程產(chǎn)品及工業(yè)應(yīng)用的各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

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Advancement in heterologous expression and purification of α－glucosidase

WU Kong－yang1，CHEN Gui－guang2，HUANG Shi－h(huán)ai2，ZHANG Yun－kai2，YU Lan2，LIANG Zhi－qun2，*
(1.College of Light Industry and Food Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China; (2.College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530005，China)

α－glucosidase was the key enzyme preparation to industrial production of Isomaltooligosaccharides，and its application field was extensive.The currently expression system used for the expression of α－glucosidase were E.coli yeast cells and other expression systems.The yeast expression system had more significant advantages. Chromatography was a important way for the isolation and purification of α－glucosidase.α－glucosidase and heterogenous expression，separation and purification of the latest research progress of the enzyme in prokaryotic expression systems and eukaryotic expression systems were summarized，which provided some reference for further investigations and application of this enzyme.

α－glucosidase;Isomaltooligosaccharides;heterologous expression;purification

TS201.2+5

A

1002－0306(2011)12－0547－05

2010－11－08 *通訊聯(lián)系人

吳孔陽(1985－)，男，博士研究生，研究方向:糖類物質(zhì)的生物利用與功能開發(fā)技術(shù)。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863計(jì)劃”(2006AA10Z339);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20362001)。