超排卵對大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)及生殖內(nèi)分泌的影響*

王志新, 張 芳

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科， 廣東 廣州 510630)

超排卵對大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)及生殖內(nèi)分泌的影響*

王志新△, 張 芳

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科， 廣東 廣州 510630)

目的探討超排卵對大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)和生殖內(nèi)分泌功能的影響，為臨床合理使用超排卵提供理論依據(jù)。方法30只雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組: 實驗A組接受孕馬血清和人絨毛膜促性腺激素重復(fù)6次超排卵，實驗B組 給予3次生理鹽水注射及孕馬血清和人絨毛膜促性腺激素重復(fù)3次超排卵，對照組接受6次生理鹽水注射。15 d及30 d后分別處死各組一半大鼠，觀察卵巢組織形態(tài)學(xué)變化，采用放射免疫法檢測血清雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)水平，并計算FSH/LH水平，比較各組間的差異。結(jié)果實驗A和B組大鼠卵巢始基卵泡和初級卵泡計數(shù)明顯低于對照組(P<0.05)，但各組大鼠體內(nèi)血清基礎(chǔ)激素水平無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論超排卵會引起大鼠卵巢的卵泡發(fā)育受限，且隨著超排卵次數(shù)的增加而加重，但尚未導(dǎo)致生殖內(nèi)分泌激素水平的顯著改變。

超排卵； 卵泡； 大鼠； 生殖內(nèi)分泌

應(yīng)用促排卵藥物促使多個卵泡發(fā)育并成熟即超排卵(superovulation)，是治療女性不孕癥的重要手段之一。自上世紀(jì)60年代以來，促排卵藥物被廣泛應(yīng)用在各種不孕癥患者的治療中，而且隨著近年不孕癥發(fā)病率的增高和輔助生育技術(shù)的普及,超排卵越來越普遍。超排卵通常用于有排卵障礙的患者以及輔助生育技術(shù)等的促排卵周期，目的是通過增加獲取的成熟卵子的數(shù)量，以提高妊娠率。但由于促排卵藥物畢竟使卵巢處于非生理狀態(tài)的刺激下，所以超排卵是否會影響卵巢的儲備功能從而導(dǎo)致患者卵巢早衰，甚至使患者過早進(jìn)入更年期，一直是臨床醫(yī)生和科研工作者共同關(guān)注的課題[1]。本研究通過對大鼠進(jìn)行超排卵，觀察卵巢組織形態(tài)學(xué)及生殖內(nèi)分泌的變化，旨在探討超排卵對卵巢組織結(jié)構(gòu)和功能的影響，為臨床合理選擇超排卵治療提供直接的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1動物及分組

清潔級雌性成年未孕spague-Dawley(SD)大鼠，鼠齡60-70 d，體質(zhì)量為(230±20)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)5 d熟悉環(huán)境后，每天晨8∶00至9∶00取陰道分泌物涂片，顯微鏡觀察動情周期，選擇30只有正常動情周期的動物，隨機(jī)分為實驗A組：重復(fù)超排卵6個周期(10只)； 實驗B組：重復(fù)超排卵3個周期(10只)； 對照組：生理鹽水注射(10只)。

2超排卵方案

參照盧慶等[2]的方法，用棉簽沾生理鹽水后， 取陰道脫落細(xì)胞涂片，顯微鏡下觀察到角化上皮細(xì)胞、白細(xì)胞和少許有核上皮細(xì)胞視為動情后期，實驗A組在動情后期腹腔注射孕馬血清40 IU/1 mL(寧波市第二激素廠，1 000 IU/支)，48 h后再次腹腔注射人絨毛膜促性腺激素40 IU/1 mL(寧波市第二激素廠，1 000 IU/支)進(jìn)行超排卵。2 d后重復(fù)同樣操作，共6次； 實驗B組在實驗A組前3個超排卵周期的同時，只重復(fù)腹腔注射生理鹽水1 mL，后3個超排卵周期進(jìn)行與實驗組A同樣的操作； 對照組同時重復(fù)腹腔注射生理鹽水1 mL，共6個周期。

3卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察及卵泡數(shù)目計數(shù)

超排卵后15 d及30 d后，分別處死各組一半大鼠，剖腹迅速取下雙側(cè)卵巢，去除卵巢周圍脂層，置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片；每間隔9張取1張切片(即第10張)，HE染色，顯微鏡觀察組織學(xué)變化；按Myers等[3]計數(shù)卵泡的方法以卵母細(xì)胞核為計數(shù)標(biāo)志，根據(jù)卵泡形態(tài)，計數(shù)始基卵泡和初級卵泡數(shù)目。采用單盲法獨立觀察所有切片。

4放射免疫法檢測血清基礎(chǔ)激素水平

麻醉大鼠后，暴露腹主動脈，用注射器取血3 mL，3 000 r/min離心15 min分離血清，取血清置于-20 ℃待測。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行放射免疫法檢測血清中血清雌二醇(estrodiol，E2)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)水平，并計算FSH/LH比值。3種性激素放射免疫分析試劑盒均購于北京華英生物技術(shù)研究所，同一種激素檢測均同一批進(jìn)行。

5統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1超排卵對大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)及各級卵泡數(shù)目的影響

超排卵后15 d及30 d，對照組(圖1E-F)可見較多生長卵泡，直徑大小不等，卵巢皮質(zhì)下見較多始基卵泡和初級卵泡分布。實驗A和B組(圖1A-D)生長卵泡數(shù)目較少，未見較大直徑卵泡，閉鎖卵泡數(shù)目較多，卵巢皮質(zhì)下始基卵泡和初級卵泡可見。

Figure 1. The hematoxylin-eosin staining showed the number of primordial follicles and primary follicles in the rats treated with superovulation by injecting PMSG and HCG for 6 times and the rats treated with superovulation for 3 times was significantly less than that in the control rats, which were treated with normal saline for 6 times.The more frequently used,the more seriously superovulation caused ( HE staining,×25). A: experimental group A(15 d after 6-time superovulation); B: experimental group A (30 d after 6-time superovulation); C: experimental group B (15 d after 3-time superovulation); D:experimental group B(30 d after 3-time superovulation); E: control group after 15 d; F: control group after 30 d.

圖1大鼠卵巢組織蘇木素-伊紅染色

超排卵后15 d，實驗A組始基卵泡和初級卵泡數(shù)明顯少于實驗B組和對照組(P<0.05)，實驗B組亦明顯低于對照組(P<0.05)。超排卵后30 d，實驗A和B組始基卵泡和初級卵泡數(shù)均明顯少于對照組(P<0.05)，但兩實驗組之間無顯著差異(P>0.05)。實驗B組隨時間變化，始基卵泡和初級卵泡數(shù)顯著降低(P<0.05)，見表1。

2超排卵對血清E2、FSH、LH、FSH/LH的影響

超排卵后30 d, 實驗A組 E2水平低于對照組，但差異無顯著(P>0.05)；實驗A、B兩組FSH水平均高于對照組，但無顯著差異(P>0.05)；實驗B組 LH水平高于對照組，但差異無顯著(P>0.05); 實驗A組 FSH/LH值高于對照組，但無顯著差異(P>0.05)。超排卵后15 d實驗A、B兩組FSH/LH值均低于對照組，但無顯著差異(P>0.05),見表2、3。

表1各組大鼠始基卵泡和初級卵泡計數(shù)變化

Group15daftersuperovulation30daftersuperovulationControl461±50467±92ExperimentalA351±59*#321±51*ExperimentalB417±27*362±58*

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsexperimental B group.

表2 超排卵對大鼠血清基礎(chǔ)激素水平的影響

表3超排卵對大鼠血清FSH/LH的影響

Group15daftersuperovulation30daftersuperovulationControl0.90±0.160.77±0.18ExperimentalA0.73±0.160.84±0.07ExperimentalB0.67±0.180.73±0.15

討 論

近年來不孕癥的發(fā)生率也不斷升高，輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)的臨床運用及研究都取得了巨大進(jìn)步，獲得足夠數(shù)量的成熟卵母細(xì)胞是決定輔助生殖技術(shù)治療周期成敗的重要環(huán)節(jié)，一般通過合理選擇超排卵來解決。但超排卵是否會引起卵巢早衰，一直備受關(guān)注。本研究用SD大鼠為研究對象，對其進(jìn)行重復(fù)超排卵，通過觀察大鼠的卵巢組織形態(tài)學(xué)及卵泡發(fā)育的變化、檢測血清中E2、FSH、LH水平及FSH/LH比值，為合理選擇超排卵治療提供直接的理論依據(jù)。

周期性是雌性生殖的特點，卵子的成熟和性激素的分泌都呈周期性波動。動情周期則是性腺功能是否正常的客觀標(biāo)志之一[4]。陰道黏膜上皮為復(fù)層扁平上皮，會發(fā)生周期性脫落。動情周期中陰道脫落細(xì)胞形態(tài)的變化主要是受動情周期中雌激素變化的影響[5]，故研究選擇在動情后期實施超排卵處理。

卵巢儲備功能反映女性的生育能力，從形態(tài)學(xué)上看，主要包括卵巢內(nèi)存留的卵泡數(shù)目和卵子質(zhì)量兩個方面。卵巢儲備的基本形式是始基卵泡和初級卵泡，其數(shù)量是反映卵巢儲備的客觀指標(biāo)，對評估卵巢儲備功能具有重要價值。但臨床上難以對卵巢內(nèi)存留的卵泡數(shù)或卵子質(zhì)量進(jìn)行直接檢測，多通過綜合評判基礎(chǔ)血清E2、FSH、LH水平、FSH/LH比值等,間接反映卵巢儲備功能[6]。

正常情況下，婦女卵巢中卵泡的儲備在新生兒出生時就已經(jīng)確定，除了在生育期大約有300-400個卵母細(xì)胞發(fā)育成熟并經(jīng)排卵過程排出外，其余卵泡均在發(fā)育過程中逐漸退化閉鎖。但在超排卵時，由于大量的卵泡同時募集發(fā)育，所以每個周期的排卵量大大增加。本研究通過觀察大鼠卵巢組織連續(xù)切片，計數(shù)始基卵泡和初級卵泡數(shù)，結(jié)果顯示超排卵后15 d，實驗A組始基卵泡和初級卵泡數(shù)明顯少于實驗B組和對照組(P<0.05)，實驗B組亦明顯低于對照組(P<0.05)。超排卵后30 d，實驗A和B組始基卵泡和初級卵泡數(shù)均明顯少于對照組(P<0.05)，但兩實驗組之間的差異無顯著(P>0.05)。實驗B組隨時間變化，始基卵泡和初級卵泡數(shù)顯著降低(P<0.05)。證實超排卵降低了大鼠卵巢的儲備功能。

目前生殖醫(yī)學(xué)專家學(xué)者普遍認(rèn)為反復(fù)的卵巢刺激及卵巢穿刺手術(shù)本身不影響卵巢的儲備功能，其原因可能是促性腺激素主要是通過卵泡膜細(xì)胞/顆粒細(xì)胞上的FSH及LH受體來發(fā)揮促進(jìn)卵泡生長的生理作用，而只有當(dāng)卵泡發(fā)育至竇卵泡前期時顆粒細(xì)胞才出現(xiàn)特異性FSH的表達(dá)，此時卵泡已經(jīng)完成由卵泡池中的始基卵泡的募集過程。因此，每次超排卵募集并不消耗作為卵巢儲備功能基本功能單位的始基卵泡，而是通過外源性的給予大量的FSH/HMG，減少已募集的卵泡發(fā)生閉鎖，從而使得更多的同簇卵泡生長發(fā)育。所以患者在接受多個周期的促排卵治療后卵巢的儲備功能并沒有出現(xiàn)過度消耗[7]。但是本實驗結(jié)果卻證實超排卵會消耗卵泡資源，這可能與高彥等[8]的研究結(jié)果有關(guān)，他們認(rèn)為促排卵時，不同于自然生理周期的FSH和LH升高，可使停滯于黃體晚期的早期竇狀卵泡階段得到進(jìn)一步的發(fā)育，從而實現(xiàn)在黃體晚期達(dá)到對卵泡的提前募集，使卵泡的募集提早到前一周期的黃體中期，從而引起竇卵泡池中卵泡數(shù)量的減少。而始基卵泡提早凋亡的機(jī)制可能與李忠香等[9]的研究有關(guān)，他們應(yīng)用末端標(biāo)記法(TUNEL)和免疫組織化學(xué)方法研究生育年齡女性早期卵泡內(nèi)細(xì)胞凋亡和Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)早期卵泡內(nèi)卵細(xì)胞凋亡以及凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bax在卵細(xì)胞表達(dá)，提示Bax介導(dǎo)的卵細(xì)胞凋亡可能是生育年齡女性早期卵泡閉鎖的機(jī)制。超排卵過程可能觸發(fā)了相關(guān)凋亡機(jī)制，從而導(dǎo)致作為儲備功能的始基卵泡和初級卵泡大量凋亡。

通常情況下隨著卵巢儲備功能的下降，卵泡顆粒細(xì)胞分泌的抑制素會減少，導(dǎo)致月經(jīng)第3 d的基礎(chǔ)FSH水平逐漸升高，促進(jìn)一定數(shù)量竇卵泡的發(fā)育生長，由此所分泌的E2水平也會逐漸升高，因此在基礎(chǔ)狀態(tài)下的FSH和E2水平某種程度上可以間接反映卵巢的儲備功能。但是與其他實驗結(jié)果相比較，雖然本研究中實驗A組超排卵治療后30 d大鼠血清E2水平較對照組降低，F(xiàn)SH升高，F(xiàn)SH/LH比值增高，但均無顯著差異(P>0.05)，在激素水平上尚不支持超排卵導(dǎo)致大鼠卵巢儲備功能降低。Nelson等[10]發(fā)現(xiàn)有些卵巢早衰患者會有暫時性的卵巢功能恢復(fù)，經(jīng)連續(xù)測定血清性激素，結(jié)果顯示幾乎半數(shù)卵巢早衰婦女表現(xiàn)有間斷性卵巢功能恢復(fù)，E2水平可達(dá)183 pmol/L以上。因此徐苓等[11]認(rèn)為這種現(xiàn)象的病理生理特點和絕經(jīng)過渡期相似，此間卵巢內(nèi)殘存的卵泡仍有間斷活動，可導(dǎo)致性激素水平的波動性和不穩(wěn)定性。因此，僅1次測定顯示FSH水平升高并不能斷定卵巢功能一定完全衰竭，有時需重復(fù)測定，F(xiàn)SH持續(xù)升高才提示卵巢早衰可能。應(yīng)該注意的是，血清FSH水平并不能夠一定反應(yīng)卵巢中原始卵泡的數(shù)目，F(xiàn)SH升高只是竇狀卵泡在發(fā)育過程中缺乏雌激素和抑制素的負(fù)反饋作用時的表現(xiàn)。本研究結(jié)果提示血清基礎(chǔ)激素水平已有所變化，但尚無顯著差異(P>0.05)，可能與樣本量尚較少，放免法靈敏度高以及實驗誤差有關(guān)。

綜上所述，本研究認(rèn)為,超排卵可影響卵巢卵泡發(fā)育，使其儲備能力下降。因此,在臨床應(yīng)用中，在提高妊娠率的同時，合理應(yīng)用促排卵藥物，合理安排超排卵周期及其間隔時間，防止卵巢早衰的發(fā)生。

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Effectsofsuperovulationonhistologicalchangesandfunctionsofreproductiveendocrineinratovary

WANG Zhi-xin, ZHANG Fang

(DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:wangzhixin6666@126.com)

AIM: To study the effects of superovulation on the histological changes and reproductive endocrinic functions of rat ovary.METHODSThirty female SD rats were randomly divided into 3 groups: the rats in experimental group A were treated with pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) and human chorionic gonadotropin (HCG) for 6 times; the rats in experimental group B were treated with normal saline for 3 times, subsequently stimulated with the same reagents in experimental group A for 3 times; the control rats were treated with normal saline for 6 times. Half of the rats were killed on the 15th day of the experiment, and the others were killed at the end of the experiment. The ovarian morphology and follicle number were observed. The serum estrodiol-2 (E2), follicle stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH) and FSH/LH levels were determined by radioimmunoassay.RESULTSThe number of primordial follicles and primary follicles in the two experimental groups were significantly lower than those in control group (P<0.05). However, no significant difference of the serum basal hormone level among the 3 groups was observed (P>0.05).CONCLUSIONSuperovulation can restrain the development of the follicles in a frequency-dependent manner.

Superovulation; Follicle; Rats; Reproductive endocrine

R71

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.031

1000-4718(2011)01-0161-04

2010-10-27

2010-11-24

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金資助項目(No.A2010325)

△ 通訊作者 Tel：020-38688105; E-mail: wangzhixin6666@126.com