高脂飲食敘利亞金黃地鼠胰島局部血管緊張素Ⅱ的生成途徑研究*

葉文慧， 孫 侃， 孫 嘉， 張 樺， 陳 宏， 蔡德鴻

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院內(nèi)分泌科， 廣州 廣東 510282)

高脂飲食敘利亞金黃地鼠胰島局部血管緊張素Ⅱ的生成途徑研究*

葉文慧， 孫 侃， 孫 嘉， 張 樺， 陳 宏， 蔡德鴻

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院內(nèi)分泌科， 廣州 廣東 510282)

目的觀察不同抑制劑阻斷局部腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)后，對(duì)血脂譜異常血癥敘利亞金黃地鼠胰島細(xì)胞生成血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的影響，探討高脂飲食下胰島局部血管緊張素的不同生成途徑。方法挑選分離純化后血脂譜異常及正常敘利亞金黃地鼠胰島細(xì)胞，各分為對(duì)照組和卡托普利組、糜蛋白酶抑素組、抑肽酶組、α-抗胰蛋白酶組和卡托普利+糜蛋白酶抑素組共12個(gè)組，加入血管緊張素Ⅰ后再按組別加入卡托普利、糜蛋白酶抑素、抑肽酶、α-抗胰蛋白酶及卡托普利聯(lián)合糜蛋白酶抑素干預(yù)胰島細(xì)胞。用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)上清中AngⅡ的含量。結(jié)果各干預(yù)組AngⅡ均較對(duì)照組減少。其中正常地鼠組中卡托普利組、糜蛋白酶抑素組、α-抗胰蛋白酶組、抑肽酶組和卡托普利聯(lián)合糜蛋白酶抑素組的AngⅡ分別較對(duì)照組減少了39.98%、50.10%(P<0.01)、23.04%、20.85%(P<0.05)和82.78%(P<0.01)；高脂組地鼠上述各值分別為42.12%、56.96%(P<0.01)、26.11%、22.68%(P<0.05)和83.59%(P<0.01)，正常組與高脂飲食地鼠糜蛋白酶組中AngⅡ差異顯著(P<0.05)。結(jié)論血脂譜異常雄性敘利亞金黃地鼠胰島局部血管緊張素Ⅱ的生成仍以經(jīng)典的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶途徑和糜蛋白酶途徑為主。在血脂異常病理狀態(tài)下，相比較血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑而言，糜蛋白酶抑素對(duì)局部AngⅡ生成的抑制更為強(qiáng)烈。

胰島； 高脂飲食； 腎素-血管緊張素系統(tǒng)； 糜蛋白酶

目前，關(guān)于局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)的研究在國(guó)內(nèi)外逐漸受到重視[1]。胰島已被證實(shí)存在局部的RAS系統(tǒng)[2]。在本課題組早期研究中我們發(fā)現(xiàn)，胰島局部血管緊張素Ⅱ的生成除經(jīng)典的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)途徑之外還存在有糜蛋白酶途徑[3]。而在血脂異常、高血壓及糖尿病等病理狀態(tài)下，除ACE介導(dǎo)的血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)生成之外，糜蛋白酶同樣介導(dǎo)局部AngⅡ的產(chǎn)生，既往關(guān)于病理狀態(tài)下胰島糜蛋白酶途徑相關(guān)的報(bào)道少之又少，本文旨在研究高脂飲食導(dǎo)致血脂異常病理情況下對(duì)敘利亞金黃地鼠胰島局部血管緊張素Ⅱ生成的影響并探討其可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物及主要材料 健康SPF級(jí)雄性敘利亞金黃地鼠，封閉群，體重150-200 g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。雙硫腙(DTZ，上海試劑三廠)；10%小牛血清(海克隆生物化學(xué)制品有限公司)；膠原酶V、Ficoll400、CMRI-1066培養(yǎng)基、血管緊張素Ⅰ、卡托普利粉劑、糜酶抑制劑、α-抗胰蛋白酶(Sigma)，抑肽酶(Amresco)；敘利亞金黃地鼠血管緊張素Ⅱ ELISA試劑盒(ADL)。4 ℃立式冷凍離心機(jī)(上海安亭公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Sanyo)；酶標(biāo)檢測(cè)儀(Bio-TeK ELx808)。基礎(chǔ)飼料：蛋白質(zhì)18.50%，水分9.80%，灰分5.60%，粗脂肪4.20%，粗纖維3.20%，鈣1.22%，磷0.84%。高脂飼料：10%豬油，10%玉米油，1%膽固醇，0.25%膽酸鈉+基礎(chǔ)飼料,均購買于廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

2方法

2.1動(dòng)物分組及高脂地鼠模型建立 雄性敘利亞金黃地鼠30只，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組(普通飼料)，高脂組(高脂飼料)，每組15只。第0、1、2、6、12周測(cè)定血漿葡萄糖(glucose, Glu)、甘油三酯(triglyceride, TG)、膽固醇(cholesterin, TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterin, HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterin, LDL-C)的水平。金黃地鼠過夜禁食12 h，第2 d清晨測(cè)體重，水合氯醛腹腔注射麻醉，玻璃毛細(xì)管自內(nèi)眥眼眶靜脈叢取血1.5 mL，肝素化的離心管3 000 r/min離心10 min，分離血清做生化分析檢測(cè)。12周末，分離胰島完畢后，肉眼觀察肝臟，肝臟稱重，計(jì)算肝指數(shù)(肝指數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)。留取肝臟葉，立即投入10%甲醛溶液固定，各級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，蘇木精和伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。肝組織病理均由2個(gè)病理科醫(yī)生在光學(xué)顯微鏡下檢查, 作出雙盲判斷。每張切片觀察5個(gè)肝小葉, 以平均每個(gè)肝小葉內(nèi)脂肪變性的肝細(xì)胞所占百分比表示肝臟脂肪變性程度,根據(jù)美國(guó)肝病協(xié)會(huì)(AASLD)2002年擬定的NAFLD診斷標(biāo)準(zhǔn)中的組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2.2地鼠胰島的分離純化與染色 地鼠禁食過夜后麻醉，作腹部“個(gè)”字型切口。近十二指腸端結(jié)扎膽總管，于近夾閉點(diǎn)用課題組自制穿刺針順行膽管內(nèi)插管。緩慢注入膠原酶Ⅴ溶液5 mL，使胰腺充分膨脹。摘取胰腺后38 ℃水浴靜止消化約15 min。取出后用力振搖使胰腺散開呈細(xì)沙狀顆粒，終止消化后收集沉淀。將分離好的胰島細(xì)胞加入50 mL離心管中，再加入預(yù)先配好不同濃度的Ficoll液，利用密度梯度法純化胰島。純化后胰島經(jīng)DTZ染色后置于倒置顯微鏡下觀察。

2.3不同抑制劑干預(yù)對(duì)胰島局部RAS生成AngⅡ的影響 倒置顯微鏡下手工挑取直徑150-200 μm(即1個(gè)胰島當(dāng)量)的胰島加于24孔板中，按健康及高脂分為對(duì)照組、卡托普利組、糜蛋白酶抑素組、抑肽酶組、α-抗胰蛋白酶組以及卡托普利+糜蛋白酶抑素組共12個(gè)組，每組各4個(gè)復(fù)孔，每孔加入20胰島當(dāng)量(IEQ)的胰島后補(bǔ)加含10%胎牛血清及5 mmol/L葡萄糖的CMRI-1066培養(yǎng)基0.5 mL，預(yù)孵育30 min后用PBS液沖洗胰島細(xì)胞3次，去除培養(yǎng)液中的血清，各組均加入0.02 μmol/L AngⅠ 50 μL。然后依據(jù)分組情況，對(duì)照組直接加入100 μL PBS；卡托普利組、糜蛋白酶抑素組、抑肽酶組、α-抗胰蛋白酶組均加入50 μL PBS后分別加入50 μL 2 mmol/L卡托普利；50μL 0.1mmol/L糜蛋白酶抑素；50 μL 1 mmol/L抑肽酶；50 μL 0.1 mg/L α-抗胰蛋白酶；卡托普利+糜蛋白酶抑素組加入50 μL 2 mmol/L卡托普利和50 μL 0.1 mmol/L糜蛋白酶抑素。待添加完成后將24孔板置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育120 min。120 min后收集各孔上清，采用競(jìng)爭(zhēng)法ELISA檢測(cè)上清中AngⅡ濃度，于波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀上讀數(shù)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1高脂模型建立

高脂喂養(yǎng)組金黃地鼠出現(xiàn)明顯的乳糜血，高脂組TC、TG、HDL-C和LDL-C與對(duì)照組相比均升高，差異均顯著(P<0.01)。高脂組地鼠肝指數(shù)升高，差異顯著(P<0.01)；高脂組地鼠與對(duì)照組相比肝指數(shù)升高，差異顯著(P<0.05)，見表1。正常組地鼠肝臟呈鮮紅色，邊緣銳利，表面光滑，質(zhì)地柔軟，體積無增大；高脂組地鼠肝臟顏色黃、紫、紅色相交，邊緣圓鈍，包膜緊張，體積明顯增大。光鏡觀察：對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊，體積正常，肝臟邊緣薄，形態(tài)未見明顯變化，見圖1A。高脂組肝細(xì)胞明顯腫脹增大，有脂肪滴即脂肪囊存在，部分肝細(xì)胞呈空泡狀，肝細(xì)胞間見炎癥細(xì)胞,見圖1B。

表112周時(shí)2組金黃地鼠血脂及肝指數(shù)比較

GroupTC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)Hepatosomaticindex(%)Control2.36±0.521.80±2.301.26±0.501.16±0.312.95±0.26High-fat8.23±1.22**10.52±1.20**2.09±0.2*3.02±0.12**5.62±0.51**

*P<0.05,**P<0.01vscontrol.TC:total cholesterol; TG:triglyceride; HDL-C:high-density lipoproteol cholesterol; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol.

Figure 1. Histopathological changes in the liver (HE staining,×200). A:control group;B:high-fat diet group.

圖1各組肝組織病理變化

2胰島分離與純化

按本課題組早期純化方法[3，4]，純化后的胰島包膜完整，基本不含外分泌腺組織，見圖2。胰島細(xì)胞純度>90%，胰島細(xì)胞存活率>90%。

Figure 2. Hamster islets of Langerhans after purification (DTZ, ×400).

圖2初步純化后的地鼠胰島細(xì)胞團(tuán)

3各組抑制劑正常組地鼠胰島細(xì)胞AngⅡ產(chǎn)生的影響

各組抑制劑中血管緊張素Ⅱ濃度差異顯著?？ㄍ衅绽M、糜蛋白酶抑素組、抑肽酶組、α-抗胰蛋白酶組以及卡托普利+糜蛋白酶抑素組中的AngⅡ均較對(duì)照組減少。其中卡托普利組和糜蛋白酶抑素組中的AngⅡ分別較對(duì)照組減少了39.98%和50.10%，P<0.01，但2組間的差異無顯著。而α-抗胰蛋白酶組和抑肽酶組的抑制效果雖不如前2組強(qiáng)，但也較對(duì)照組減少了23.04%和20.85%(P<0.05)?？ㄍ衅绽?糜蛋白酶抑素聯(lián)合組較對(duì)照組AngⅡ減少了82.78%(P<0.01)，見圖3。

4各組抑制劑對(duì)高脂飲食地鼠胰島細(xì)胞AngⅡ產(chǎn)生的影響

卡托普利組、糜蛋白酶抑素組、抑肽酶組、α-抗胰蛋白酶組以及卡托普利+糜蛋白酶抑素組中的AngⅡ均較對(duì)照組減少,其中卡托普利組和糜蛋白酶抑素組中的AngⅡ分別較對(duì)照組減少了42.12%和56.96%，P<0.05，卡托普利組和糜蛋白酶抑素組中AngⅡ的差異顯著。α-抗胰蛋白酶組和抑肽酶組的抑制效果仍然不如上述2組明顯，分別較對(duì)照組減少了26.11%和22.68%，P<0.05，卡托普利聯(lián)合糜蛋白酶抑素組較對(duì)照組AngⅡ的生成減少了83.59%，P<0.05，見圖4。糜蛋白酶抑素組中，血脂譜異常血癥地鼠胰島局部AngⅡ的生成與健康地鼠分別減少了50.10%和55.86%，P<0.05，2個(gè)糜蛋白酶抑素組中AngⅡ的差異顯著，見圖5。

圖3正常金黃地鼠不同抑制組對(duì)胰島細(xì)胞局部產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ的比較

圖4高脂喂養(yǎng)金黃地鼠不同抑制組對(duì)胰島細(xì)胞局部產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ的比較

圖5正常組及血脂異常組金黃地鼠胰島細(xì)胞局部產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ的比較

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，在局部RAS中，AngⅡ可由局部組織絲氨酸蛋白酶家族(包括糜蛋白酶、胰蛋白酶、緊張肽、組織蛋白酶G等)非ACE途徑生成[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[3,6]：敘利亞金黃地鼠胰島細(xì)胞主要由糜蛋白酶和ACE途徑來產(chǎn)生AngⅡ，卡托普利+糜蛋白酶抑素組對(duì)AngⅡ產(chǎn)生的抑制遠(yuǎn)超過2種抑制劑單獨(dú)使用，糜蛋白酶和ACE分別通過不同作用位點(diǎn)來刺激局部胰島產(chǎn)生AngⅡ。生理狀態(tài)下胰島細(xì)胞由ACE與糜蛋白酶途徑生成的AngⅡ作用相似。除糜蛋白酶以外，由絲氨酸蛋白酶家族其它途徑所生成的AngⅡ量占1/5左右，由糜蛋白酶途徑生成的AngⅡ并未占據(jù)主導(dǎo)地位。本研究應(yīng)用高脂飲食喂養(yǎng)構(gòu)建敘利亞金黃地鼠血脂紊亂模型，觀察在血脂紊亂疾病狀態(tài)下對(duì)不同AngⅡ生成途徑的影響。

本研究經(jīng)過12周高脂喂養(yǎng)敘利亞金黃地鼠，成功建立高脂地鼠模型，經(jīng)高脂喂養(yǎng)地鼠出現(xiàn)血脂紊亂、肝指數(shù)水平升高及肝內(nèi)脂肪樣變病理情況與文獻(xiàn)[3]研究結(jié)果相類似。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于高脂高熱量飼養(yǎng)的研究多取材于大鼠和小鼠。大鼠在血脂代謝上與人類存在很大差異，有種屬差異所致的局限性。大鼠和小鼠均具有抗動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的能力。大鼠血脂水平個(gè)體差異較大，經(jīng)肝外合成的內(nèi)源性膽固醇比例僅占35%，人類為90%，敘利亞金黃地鼠肝外合成內(nèi)源性膽固醇的比例為85%，與人類的十分接近。雄性敘利亞金黃地鼠因在脂類代謝及脂蛋白代謝受體基因序列上更接近人類，在給予高脂飼料時(shí)容易進(jìn)展成血脂代謝紊亂、脂肪肝及動(dòng)脈硬化。另外，研究發(fā)現(xiàn)，在人、猴、狗和地鼠中，某些組織局部90%的AngⅡ都是通過糜蛋白酶途徑生成，該途徑所產(chǎn)生的AngⅡ主要參與局部組織病理性重構(gòu)。相比較而言，大鼠、兔等動(dòng)物則無法通過糜蛋白酶途徑來產(chǎn)生AngⅡ[7]。因此，本研究選用金黃地鼠作為血脂代謝紊亂模型觀察AngⅡ生成影響。

近期的研究發(fā)現(xiàn)在機(jī)體病理過程中，體循環(huán)經(jīng)典RAS系統(tǒng)多參與急性調(diào)節(jié)，而局部RAS更多與亞急性、慢性調(diào)節(jié)相關(guān)[8]，并將局部RAS進(jìn)一步細(xì)分為細(xì)胞內(nèi)RAS和細(xì)胞外RAS，細(xì)胞內(nèi)RAS的AngⅡ合成在高糖持續(xù)刺激下更為顯著[9]。研究者們還發(fā)現(xiàn)，受損血管糜蛋白酶活性較正常血管明顯增高，而ACE通路作用產(chǎn)生的AngⅡ并沒有顯著變化。此外，糜蛋白酶抑制劑和ARB類藥物可明顯減少綴生血管及相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞的爬行，而ACEI組并未觀察到類似形態(tài)學(xué)改變[10]。本研究中，我們應(yīng)用高脂模型觀察到在血脂紊亂的病理狀態(tài)下，對(duì)照組地鼠的AngⅡ與健康對(duì)照組相比較無顯著差異，但卡托普利組和糜蛋白酶抑素組中的AngⅡ分別較對(duì)照組減少了42.12%和56.96%，二者對(duì)AngⅡ的抑制呈現(xiàn)明顯差異。糜蛋白酶抑素在此時(shí)能較卡托普利抑制更多的AngⅡ生成。并且血脂紊亂組糜蛋白酶組與正常組糜蛋白相比，AngⅡ較對(duì)照組減少了56.96%和50.10%，差異明顯，雖然這與國(guó)外報(bào)道的糜蛋白酶可阻止局部90%的AngⅡ生成的結(jié)果有所差別[7]，但本研究已說明糜蛋白酶在病理狀態(tài)下存在局部的高表達(dá)，在高脂血癥等疾病狀態(tài)下被加強(qiáng)激活，介導(dǎo)生成過量的AngⅡ并最終導(dǎo)致病理狀態(tài)下局部組織的損傷。血脂譜異常血癥雄性敘利亞金黃地鼠胰島局部血管緊張素Ⅱ的生成仍存在經(jīng)典的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶途徑和糜蛋白酶途徑，在此狀態(tài)下，敘利亞金黃地鼠由糜蛋白酶途徑所生成的AngⅡ比血管緊張素轉(zhuǎn)化酶途徑所生成的AngⅡ多，即糜蛋白酶抑素能較ACEI類藥物更強(qiáng)地抑制胰島局部AngⅡ的產(chǎn)生。

胰島為高密度毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)化的微器官，局部RAS系統(tǒng)擁有體循環(huán)經(jīng)典RAS系統(tǒng)的全部組分[11，12]，腎素、ACE、ACE2、AT1及AT2受體等均有表達(dá)[2,13]。而且，局部RAS系統(tǒng)多在糖脂紊亂、高血壓等疾病狀態(tài)下被過度激活，而此時(shí)體循環(huán)的腎素和AngⅡ水平并不顯著上升[2]。既往實(shí)驗(yàn)及本課題組研究均提示糜蛋白酶超過ACE成為介導(dǎo)某些局部組織AngⅡ生成的主要途徑，在病理狀態(tài)下局部RAS的激活可能是由于糜蛋白酶高表達(dá)又或者是糜蛋白酶和ACE二者協(xié)同作用所致。

綜上所述，胰島作為機(jī)體血供極其豐富的微器官之一，除體循環(huán)RAS外還存在局部RAS。局部RAS多在血脂紊亂、糖尿病、高血壓等疾病狀態(tài)下被過度激活，而此時(shí)體循環(huán)的腎素、AngⅡ和ACE水平并不顯著上升，而且部RAS中的 AngⅡ在不同生理和病理狀態(tài)下的產(chǎn)生途徑也存在明顯差別。血脂紊亂的病理狀態(tài)體下糜蛋白酶途徑被進(jìn)一步激活，比正常健康狀態(tài)下局部產(chǎn)生更多的AngⅡ。糜蛋白酶途徑在病理狀態(tài)下加強(qiáng)，提示我們?cè)谘芯縍AS相關(guān)疾病病理生理的時(shí)候應(yīng)注意局部RAS的獨(dú)立性和重要性。此外，糜蛋白酶及血脂代謝的種屬特異性還提示在研究RAS相關(guān)血脂紊亂病理狀態(tài)下局部組織重構(gòu)時(shí)應(yīng)選擇合適的動(dòng)物模型。但要進(jìn)一步了解整個(gè)RAS，仍需更多的研究。

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PathwaysoflocalangiotensinIIgenerationinisletsofLangerhansinSyriangoldenhamsterfedwithhigh-fatdiet

YE Wen-hui, SUN Kan, SUN Jia, ZHANG Hua, CHEN Hong, CAI De-hong

(DepartmentofEndocrinology,ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510282,China.E-mail:cai_deng_hong@126.com)

AIM: To investigate the diverse pathways of local angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) generation in islets of Langerhans in Syrian golden hamsters with dyslipidemia.METHODSThe Syrian golden hamsters were fed with high-fat diet to induce dyslipidemia. Purified islet cells from dyslipidemia and normal Syrian hamsters were prepared and divided into control group, captopril group, chymotrypsin endostatin group, aprotinin group, α-antitrypsin group and captopril+chymotrypsin endostatin group by adding respective reagents into the cultured cells after treated with angiotensin I. The Ang Ⅱ levels in the supernatants of each group were examined by ELISA.RESULTSCompared with the control animals, Ang Ⅱ levels decreased in all groups with interventions. Compared with the normal hamsters islet cells, the Ang Ⅱ levels in captopril group, chymotrypsin endostatin group, α-antitrypsin group, aprotinin group and captopril+chymotrypsin endostatin group were decreased by 39.98%, 50.10% (P<0.01), 23.04%, 20.85% (P<0.05) and 82.78% (P<0.01), respectively. Compared with high-fat group, the corresponding data were 42.12%, 56.96% (P<0.01), 26.11%, 22.68% (P<0.05) and 83.59% (P<0.01), respectively. The levels of Ang Ⅱ in chymotrypsin group between normal and high-fat diet hamsters were significantly different (P<0.05).CONCLUSIONUnder the condition of dyslipidemia, the classic angiotensin-converting enzyme-based pathway and chymotrypsin pathway are still the main approaches of producing Ang Ⅱ in male Syrian hamster islet to produce angiotensin. The effect of chymotrypsin endostatin is comparatively stronger in inhibiting the production of local Ang Ⅱ than the effect of angiotensin-converting enzyme inhibitor.

Islets of Langerhans; High-fat diet; Renin-angiotensin system; Chymotrypsin

R587.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.026

1000-4718(2011)01-0134-05

2010-07-06

2010-10-19

廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2007-Z-005)

△通訊作者 Tel: 020-62782330； E-mail: cai_deng_hong@126.com