小干擾RNA沉默hPTTG1基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖和凋亡的影響*

劉 潔， 沈文靜， 盧 瑤， 趙 恂， 宋 敏

(中國醫(yī)科大學(xué)1實驗技術(shù)中心，2附屬第一臨床學(xué)院婦科，3病理教研室， 遼寧 沈陽 110001)

小干擾RNA沉默hPTTG1基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖和凋亡的影響*

劉 潔1△， 沈文靜2， 盧 瑤1， 趙 恂1， 宋 敏3

(中國醫(yī)科大學(xué)1實驗技術(shù)中心，2附屬第一臨床學(xué)院婦科，3病理教研室， 遼寧 沈陽 110001)

目的利用RNA干擾技術(shù)沉默人垂體瘤轉(zhuǎn)化基因1(hPTTG1)表達(dá)，觀察卵巢癌細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞凋亡的改變并探討分子機制。方法化學(xué)合成靶定hPTTG1的小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的A2780細(xì)胞，RT-PCR和Western blotting檢測hPTTG1及c-myc表達(dá)水平；MTT法和[3H]-TdR摻入實驗檢測hPTTG1對細(xì)胞增殖的影響；annexin V/PI染色流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法測定各組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果hPTTG1 siRNA轉(zhuǎn)染組hPTTG1 mRNA和蛋白表達(dá)下降，抑制率分別為70.5%±3.9%和63.8%±4.5%；轉(zhuǎn)染hPTTG1 siRNA 24 h細(xì)胞吸光度值開始下降，48 h抑制效果最明顯，抑制率為42.9%±5.2%；轉(zhuǎn)染hPTTG1 siRNA后細(xì)胞[3H]-TdR放射性計數(shù)明顯低于空白組和陰性對照組；hPTTG1 siRNA干擾組細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞凋亡率和壞死率均增加；TUNEL染色分析結(jié)果可見hPTTG1 siRNA干擾組凋亡指數(shù)明顯高于空白組和陰性對照組；hPTTG1干擾后c-mycmRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)。結(jié)論hPTTG1 siRNA通過下調(diào)c-myc表達(dá)抑制A2780細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，hPTTG1可作為卵巢癌基因治療的候選靶點。

基因，人垂體瘤轉(zhuǎn)化; 卵巢腫廇； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡；c-myc

卵巢癌是死亡率最高的婦科腫瘤，其發(fā)病率較高，診治困難，傳統(tǒng)的治療手段療效差且復(fù)發(fā)率極高，以免疫治療和基因治療為代表的生物治療顯示出一定的優(yōu)越性。人垂體瘤轉(zhuǎn)化基因1(human pituitary tumor-transforming gene,hPTTG1)廣泛參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1-3]，已有研究證實卵巢癌組織中hPTTG1異常高表達(dá)，且與較晚的手術(shù)病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[4，5]，提示其可作為卵巢癌基因治療的新靶點[6]。本研究選用RNA干擾技術(shù)，合成靶定hPTTG1基因的特異小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)，轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株A2780，觀察其對卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細(xì)胞株 人卵巢癌細(xì)胞株A2780由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。

1.2主要試劑hPTTG1 siRNA及陰性對照siRNA(sense：3’-AlexaFluor488)由南京凱基公司合成；羊抗人hPTTG1蛋白多克隆抗體、鼠抗人c-Myc單克隆抗體、增強型化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自Santa Cruz；hPTTG1、c-myc和內(nèi)參照GAPDH引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；RPMI-1640、胎牛血清、opti-MEM購自Gibco-BRL；Trizol、RNase H、SuperScriptTMⅢ first-strand synthesis cDNA kit和Lipofectamine 2000購自Invitrogen；KOD FX DNA PCR試劑購自Toyobo；分子量標(biāo)志物購自Fermentas；辣根過氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗購自北京中杉金橋生物有限公司；β-巰基乙醇、苯甲基磺酰氟(PMSF)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于Sigma；[3H]-TdR購于中國原子能研究所； 膜連蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司；TUNEL染色試劑盒購自Boehringer Mannheim。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) A2780細(xì)胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到85%匯聚時用0.25%胰蛋白酶消化傳代。在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中按照2×105cells/well的密度接種細(xì)胞，每孔加入1.5 mL不含抗生素和血清的RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞達(dá)到50%左右融合時，棄去原培養(yǎng)液用opti-MEM輕洗2次，參照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

2.2siRNA轉(zhuǎn)染hPTTG1 siRNA: 正義鏈 5’-GACCUGCAAUAAUCCAGAAdTdT-3’，反義鏈 5’-UUCUGGAUUAUUGCAGGUCdTdT-3’。將細(xì)胞分為hPTTG1干擾組(轉(zhuǎn)染hPTTG1 siRNA)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)和空白對照組(未進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染)。首先用陰性對照siRNA優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系，將100 pmol siRNA 用250 μL無抗生素、無血清opti-MEM培養(yǎng)液稀釋，輕混，室溫靜置5 min；在250 μL無抗生素、無血清opti-MEM培養(yǎng)液中稀釋5 μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，輕混，室溫靜置5 min；混合稀釋的siRNA 和轉(zhuǎn)染試劑，室溫靜置20 min，將500 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，混合均勻，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染6 h后更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行實驗檢測。

2.3RT-PCR檢測hPTTG1和c-myc表達(dá) 由GenBank檢索目的基因序列，利用Primer-BLAST在線設(shè)計引物，序列如下：hPTTG1上游引物 5’-CGGCTGTTAAGACCTGCAAT-3’，下游引物 5’-GGCAGGAACAGAGCTTTTTG-3’， 產(chǎn)物長度346 bp；c-myc上游引物 5’-ACGGCCGACCAGCTGGAGAT-3’， 下游引物 5’-TGGGCGAGCTGCTGTCGTTG-3’， 產(chǎn)物長度334 bp；同時以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照，上游引物 5’-CAGTCAGCCGCATCTTCTT-3’，下游引物 5’-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3’，產(chǎn)物長度288 bp。參照Trizol試劑說明書提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測定A260和A280值，計算其濃度和純度，每一樣品重復(fù)3次。利用oligo(dT)20引物和SuperScriptTMⅢ試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，在10 μL 反應(yīng)體系中按照KOD FX DNA polymerase試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)條件為： 94 ℃ 2 min，94 ℃15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33個循環(huán)，72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測，EB染色后利用自動電泳凝膠掃描分析系統(tǒng)測定電泳條帶的積分吸光度值(integrated absorbance，IA)，實驗重復(fù)3 次，取hPTTG1IA/GAPDHIA平均值作為其mRNA表達(dá)水平的相對值。

2.4Western blotting檢測hPTTG1和c-Myc蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后的3組細(xì)胞，冷PBS沖洗后，蛋白裂解液(50 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、0.1% SDS、0.02%NaN3、100 mg/L PMSF、1%NP-40、1 mg/L aprotinin)提取細(xì)胞總蛋白，冰浴30 min裂解混勻、4 ℃ 12 000 r/min離心10 min后，按照DC protein assay試劑說明行總蛋白測定，SDS-PAGE電泳后，半干轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入第Ⅰ抗體(hPTTG 1∶200，c-Myc 1∶200，GAPDH 1∶500)室溫孵育2 h，PBST洗膜后加入1∶5 000稀釋的第Ⅱ抗體孵育1 h，PBST洗膜后，ECL顯色曝光并通過X線膠片曝光洗片，經(jīng)自動電泳凝膠分析系統(tǒng)掃描并測定雜交條帶IA，實驗重復(fù)3 次，將hPTTG1IA/ GAPDHIA平均值作為其蛋白表達(dá)水平的相對值。

2.5MTT測定細(xì)胞增殖 胰酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，制備濃度為1×108cells/L單細(xì)胞懸液，96孔板每孔接種100 μL，基因沉默方法同前，測定轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h和96 h細(xì)胞增殖活性。在距離時間點結(jié)束4 h時小心吸去上清，加入80 μL無血清opti-MEM培養(yǎng)液，再加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸掉上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，混勻后以酶標(biāo)儀于570 nm處讀取各孔吸光度值(A570)，每組設(shè)定3個復(fù)孔，按下面公式計算細(xì)胞生長抑制率，細(xì)胞生長抑制率(%)=[1-(實驗組A570均值/對照組A570均值)]×100%，以時間為坐標(biāo)橫軸，吸光度值為坐標(biāo)縱軸繪圖。

2.6[3H]-TdR 摻入實驗分析細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞更換無血清培養(yǎng)基同步化處理24 h，每孔加入3.7×104Bq [3H]-TdR繼續(xù)培養(yǎng)16 h，吸棄上清，PBS沖洗，胰酶消化后將細(xì)胞抽濾到玻璃纖維素濾膜上，PBS沖洗，5%三氯醋酸固定，無水乙醇脫色脫水，濾膜烘干后加入閃爍液，用液閃爍計數(shù)儀測定[3H]每分鐘放射性計數(shù)值(counts/min)。

2.7Annexin V-FITC檢測細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞PBS洗滌，2 000 r/min離心5 min收集1×105細(xì)胞，用500 μL 1×binding buffer懸浮細(xì)胞，加入1 μL Annexin V-FITC混勻后加入5 μL 碘化丙啶(propi-dium iodide,PI)，然后混勻，避光室溫反應(yīng)5 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，F(xiàn)ITC綠色熒光通道用FL2檢測，PI紅色熒光通道用FL1檢測。

2.8TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡 將消毒滅菌的載玻片放置在6孔培養(yǎng)板上，細(xì)胞接種和轉(zhuǎn)染步驟同前，取出細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定，0.1%Triton-X100透膜，按照試劑盒說明進(jìn)行操作，通過顯微圖像分析系統(tǒng)采集圖像并計數(shù)凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，取其平均值作為各組細(xì)胞的凋亡指數(shù)。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1hPTTG1siRNA對A2780細(xì)胞hPTTG1mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，hPTTG1干擾組A2780細(xì)胞內(nèi)hPTTG1目的基因電泳條帶密度減弱，mRNA表達(dá)水平降低，其mRNA抑制率為70.5%±3.9%。hPTTG1干擾組hPTTG1 mRNA表達(dá)量為0.27±0.09，顯著低于空白組(0.91±0.03)和陰性對照組(0.89±0.06)(n=3,P<0.05)，而陰性對照組和空白組間無顯著差異(n=3,P>0.05),見圖1。

Figure 1. The expression ofhPTTG1 mRNA in A2780 ovarian cancer cell afterhPTTG1 siRNA transfection. M:ФX174 /HaeIII DNA marker; Lane 1:normal; Lane 2: negative siRNA; Lane3:hPTTG1siRNA.

圖1轉(zhuǎn)染hPTTG1siRNA后A2780細(xì)胞內(nèi)hPTTG1mRNA表達(dá)

2hPTTG1siRNA對A2780細(xì)胞中hPTTG1蛋白表達(dá)的影響

Western blotting 結(jié)果顯示，hPTTG1干擾組中hPTTG1蛋白雜交條帶信號降低，蛋白表達(dá)水平下降，其蛋白表達(dá)抑制率為63.8%±4.5%；hPTTG1干擾組中hPTTG1蛋白表達(dá)量為0.30±0.04，顯著低于空白組(0.82±0.04)和陰性對照組(0.78±0.02)(n=3,P<0.05)，而陰性對照組與空白組間無顯著差異(n=3,P>0.05),見圖2。

3hPTTG1siRNA對A2780細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示hPTTG1干擾組細(xì)胞增殖速度較其它2組細(xì)胞慢，各時點吸光度值明顯低于空白和陰性對照組，顯著差異(n=3，P<0.05)，而陰性對照組與空白組間吸光度值無顯著差異(n=3,P>0.05)。轉(zhuǎn)染hPTTG1 siRNA 24 h細(xì)胞吸光度值開始下降，24 h細(xì)胞抑制率為24.3%±3.7%；48 h抑制效果最明顯，抑制率為42.9%±5.2%；48 h后抑制效應(yīng)減弱，增殖速度有所提高，但仍低于空白和陰性對照組；72 h、96 h細(xì)胞抑制率分別為30.3%±2.9%和24.8%±5.4%，各時點的吸光度值曲線見圖3。

Figure 2. The expression of hPTTG1 protein in A2780 ovarian cancer cell afterhPTTG1 siRNA transfection. Lane 1:normal;Lane 2:negative siRNA;Lane 3:hPTTG1 siRNA.

圖2轉(zhuǎn)染hPTTG1siRNA后A2780細(xì)胞內(nèi)hPTTG1蛋白表達(dá)

圖3轉(zhuǎn)染hPTTG1siRNA對A2780細(xì)胞增殖的作用

4hPTTG1siRNA對A2780細(xì)胞[3H]-TdR摻入量的影響

與空白組和陰性對照組相比，hPTTG1 siRNA轉(zhuǎn)染組A2780細(xì)胞[3H]-TdR放射性強度明顯降低，差異顯著(n=3，P<0.05)；空白組和陰性對照組間放射性強度比較無顯著差異(n=3，P>0.05)。hPTTG1 siRNA轉(zhuǎn)染組放射性強度為(758.0±28.7)counts/min，空白組和陰性對照組分別為(1 327.0±109.5)counts/min和(1 164.0±98.3)counts/min，表明hPTTG1 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的DNA合成水平下降，細(xì)胞增殖受抑。

5hPTTG1siRNA對A2780細(xì)胞凋亡的影響

hPTTG1 siRNA干擾組細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞凋亡率和壞死率均增加，與空白和陰性對照組相比均有顯著差異(n=3，P<0.05)；陰性和空白對照組間細(xì)胞凋亡率、壞死率及存活率比較無顯著差異(n=3，P>0.05),見圖4、表1。

表13組細(xì)胞的AnnexinV-FITC染色流式細(xì)胞儀分析結(jié)果

RegionNormal(%)NegativesiRNA(%)hPTTG1siRNA(%)Lowerleft(survivalcells)73.61±4.1769.90±5.3851.85±3.97Upperright(necrosiscells)15.64±3.2918.26±2.5426.28±3.14Lowerright(cellapoptosis)8.54±1.139.17±1.4119.42±3.05

Figure 4. The influence ofhPTTG1 siRNA on the apoptosis of A2780 cells.

圖4轉(zhuǎn)染hPTTG1siRNA對A2780細(xì)胞凋亡的影響

6細(xì)胞凋亡的TUNEL檢測結(jié)果

空白組和陰性對照組細(xì)胞僅見少數(shù)胞核呈棕褐色，凋亡指數(shù)分別為(7.69±0.85)%和(8.34±1.07)%；hPTTG1 siRNA干擾組胞核陽性染色增多,見圖5，凋亡指數(shù)為(21.47±1.89)%，與空白組和陰性對照組相比較差異顯著(n=3，P<0.05)，空白和陰性對照組間無顯著差異(n=3，P>0.05), 表明hPTTG1 siRNA可誘導(dǎo)A2780細(xì)胞凋亡。

Figure 5. Cell apoptosis of A2780 cell detected by TUNEL staining test(×20).A:normal;B:hPTTG1 siRNA.

圖5TUNEL染色檢測A2780細(xì)胞凋亡

7hPTTG1siRNA對A2780細(xì)胞中c-mycmRNA和蛋白表達(dá)的影響

hPTTG1干擾后c-mycmRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)，hPTTG1干擾組c-mycmRNA表達(dá)量為0.43±0.07，顯著低于空白組(0.78±0.05)和陰性對照組(0.74±0.03),n=3,P<0.05；hPTTG1干擾組c-Myc蛋白表達(dá)量為0.51±0.04，顯著低于空白組(0.83±0.06)和陰性對照組(0.79±0.05),n=3,P<0.05)，而陰性對照組和空白組間mRNA和蛋白無顯著差異(n=3,P>0.05),見圖6、7。

Figure 6. The expression ofc-mycmRNA in A2780 ovarian cancer cells afterhPTTG1 siRNA transfection. M:ФX174 /HaeIII DNA marker; Lane 1:normal; Lane 2: negative siRNA; Lane 3:hPTTG1 siRNA.

圖6hPTTG1siRNA轉(zhuǎn)染對A2780細(xì)胞內(nèi)c-mycmRNA表達(dá)的影響

Figure 7. The expression of c-Myc protein in A2780 ovarian cancer cells afterhPTTG1 siRNA transfection.Lane 1:normal;Lane 2: negative siRNA;Lane 3:hPTTG1 siRNA.

圖7hPTTG1表達(dá)下降對細(xì)胞c-Myc蛋白表達(dá)的影響

討 論

hPTTG1定位于5 號染色體長臂5q35.1，在大多數(shù)正常成人組織中只有弱表達(dá)甚至檢測不到，而胚胎肝、睪丸、胸腺中強表達(dá)[1-3]。在多種惡性腫瘤組織及細(xì)胞株中均檢測到hPTTG1異常高表達(dá)，其可通過多條途徑參與腫瘤演進(jìn)，并與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。hPTTG1表達(dá)呈細(xì)胞周期依賴性，在有絲分裂期達(dá)高峰。hPTTG1蛋白是一種封閉素(securin)蛋白，其過表達(dá)能夠抑制姐妹染色單體分離阻礙有絲分裂，誘導(dǎo)子代細(xì)胞非整倍體化和基因不穩(wěn)定性[7]。作為一種強細(xì)胞轉(zhuǎn)化癌基因，hPTTG1還具有激活增殖功能，在無其它輔助癌基因作用下即可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化[8]。hPTTG1對細(xì)胞凋亡的調(diào)控也具有雙重作用，其過度表達(dá)可引起p53依賴性和p53非依賴性細(xì)胞凋亡，還可通過上調(diào)survivin表達(dá)、抑制p53活性拮抗凋亡[9]。hPTTG1功能的復(fù)雜性可能與該基因表達(dá)的組織特異性、亞細(xì)胞定位、劑量依賴性和蛋白磷酸化狀態(tài)相關(guān)[10]。盡管已有文獻(xiàn)證實卵巢癌組織中hPTTG1高表達(dá)，但其與卵巢癌增殖和凋亡的關(guān)系還未見報道。

RNAi技術(shù)能夠高效、特異地抑制目的基因表達(dá)，已成為基因功能研究和基因治療的新手段。siRNA為RNAi產(chǎn)生效應(yīng)的中介分子，目前主要通過化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、長片段dsRNAs降解、表達(dá)載體和PCR制備法獲得siRNA[11]，經(jīng)過探索和改進(jìn)，化學(xué)合成法已克服價格昂貴的缺點，并且合成周期短，操作簡便，較載體途徑的siRNA更為接近臨床。本實驗將合成的hPTTG1基因siRNA轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR和Western blotting驗證能夠在細(xì)胞內(nèi)有效實現(xiàn)其基因沉默效應(yīng)。hPTTG1基因下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞生長速度減慢，增殖受抑，48 h抑制效率最高，細(xì)胞凋亡率增加，說明hPTTG1下調(diào)可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡進(jìn)而阻抑細(xì)胞增殖形成。癌基因c-myc位于人染色體8q24，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，編碼磷酸化蛋白p62，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和凋亡的雙重功能，在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12]。hPTTG1可與其它核蛋白組成復(fù)合物，直接與c-myc轉(zhuǎn)錄起始區(qū)結(jié)合，激活c-myc轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)其蛋白表達(dá)刺激細(xì)胞周期進(jìn)程，引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成[13]。

本研究還發(fā)現(xiàn)hPTTG1干擾后細(xì)胞c-mycmRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，從而抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化。由于卵巢癌的發(fā)生發(fā)展是一個多階段逐步演變的過程，涉及多個基因的改變和相互作用，可針對其中起關(guān)鍵作用的基因利用siRNA技術(shù)抑制或下調(diào)靶基因的表達(dá)．從而實現(xiàn)基因治療的目的[14]。陳剛等[15]將反義hPTTG1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞系SK-OV-3導(dǎo)致其克隆形成率下降。EI-Naggar等[16]研究證實hPTTG1 siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞增殖能力下降50%，軟瓊脂克隆形成率下降70%，裸鼠成瘤能力受抑，提示hPTTG1可作為卵巢癌基因治療的新靶點，關(guān)于其調(diào)控卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的機制有待進(jìn)一步深入探討。

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EffectofhPTTG1siRNAonproliferationandapoptosisofovariancancercells

LIU Jie1, SHEN Wen-jing2, LU Yao1, ZHAO Xun1, SONG Min3

(1ExperimentalTechnologyCenter,2DepartmentofMaternity,TheFirstAffiliatedHospital;3DepartmentofPathology,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.E-mail:lj6152003@163.com)

AIM: To observe the proliferation and apoptosis of ovarian cancer cells by silencing the expression of human pituitary tumor-transforming gene 1 (hPTTG1) using RNA interference technique.METHODSThe chemically synthesized siRNA targetinghPTTG1 was transfected into ovarian cancer cell line A2780invitro. The expression levels ofhPTTG1 andc-mycwere examined by RT-PCR and Western blotting. Cell proliferation was measured by MTT colorimetric assay and [3H]-TdR incorporation test. Cell apoptosis was detected by flow cytometry with annexin V/PI and TUNEL labeling.RESULTSThe expression ofhPTTG1 at mRNA and protein levels was inhibited after transfection ofhPTTG1 siRNA. The inhibitory efficiency was 70.5%±3.9% and 63.8%±4.5%, respectively. The absorbance began to decrease 24 h after transfection ofhPTTG1 siRNA,and the highest inhibitory rate was 42.9%±5.2% at 48 h post-transfection. Radioactive incorporation of [3H]-TdR inhPTTG1 siRNA group was lower than that in normal and negative groups. The survival rate declined while the apoptotic rate and necrotic rate increased inhPTTG1 siRNA group. Apoptotic index inhPTTG1 siRNA group was higher than that in normal and negative groups. The expression ofc-mycat mRNA and protein levels was down-regulated.CONCLUSIONCell proliferation is inhibited and cell apoptosis is induced byhPTTG1 siRNA through down-regulating the expression ofc-myc.hPTTG1 can be regarded as a candidate gene for ovarian cancer gene therapy.

Genes,human pituitaty tumor-transforming; Ovarian neoplasms; Cell proliferation; Apoptosis;c-myc

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.020

1000-4718(2011)01-0102-06

2010-08-16

2010-11-04

遼寧省教育廳科研項目(No.L2010681)

△通訊作者 Tel:024-23256666-5494；E-mail:lj6152003@163.com