小干擾RNA沉默hPTTG1基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖和凋亡的影響*

劉 潔， 沈文靜， 盧 瑤， 趙 恂， 宋 敏

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，2附屬第一臨床學(xué)院婦科，3病理教研室， 遼寧 沈陽(yáng) 110001)

小干擾RNA沉默hPTTG1基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖和凋亡的影響*

劉 潔1△， 沈文靜2， 盧 瑤1， 趙 恂1， 宋 敏3

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，2附屬第一臨床學(xué)院婦科，3病理教研室， 遼寧 沈陽(yáng) 110001)

目的利用RNA干擾技術(shù)沉默人垂體瘤轉(zhuǎn)化基因1(hPTTG1)表達(dá)，觀察卵巢癌細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞凋亡的改變并探討分子機(jī)制。方法化學(xué)合成靶定hPTTG1的小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的A2780細(xì)胞，RT-PCR和Western blotting檢測(cè)hPTTG1及c-myc表達(dá)水平；MTT法和[3H]-TdR摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hPTTG1對(duì)細(xì)胞增殖的影響；annexin V/PI染色流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法測(cè)定各組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果hPTTG1 siRNA轉(zhuǎn)染組hPTTG1 mRNA和蛋白表達(dá)下降，抑制率分別為70.5%±3.9%和63.8%±4.5%；轉(zhuǎn)染hPTTG1 siRNA 24 h細(xì)胞吸光度值開(kāi)始下降，48 h抑制效果最明顯，抑制率為42.9%±5.2%；轉(zhuǎn)染hPTTG1 siRNA后細(xì)胞[3H]-TdR放射性計(jì)數(shù)明顯低于空白組和陰性對(duì)照組；hPTTG1 siRNA干擾組細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞凋亡率和壞死率均增加；TUNEL染色分析結(jié)果可見(jiàn)hPTTG1 siRNA干擾組凋亡指數(shù)明顯高于空白組和陰性對(duì)照組；hPTTG1干擾后c-mycmRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)。結(jié)論hPTTG1 siRNA通過(guò)下調(diào)c-myc表達(dá)抑制A2780細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，hPTTG1可作為卵巢癌基因治療的候選靶點(diǎn)。

基因，人垂體瘤轉(zhuǎn)化; 卵巢腫廇； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡；c-myc

卵巢癌是死亡率最高的婦科腫瘤，其發(fā)病率較高，診治困難，傳統(tǒng)的治療手段療效差且復(fù)發(fā)率極高，以免疫治療和基因治療為代表的生物治療顯示出一定的優(yōu)越性。人垂體瘤轉(zhuǎn)化基因1(human pituitary tumor-transforming gene,hPTTG1)廣泛參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1-3]，已有研究證實(shí)卵巢癌組織中hPTTG1異常高表達(dá)，且與較晚的手術(shù)病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[4，5]，提示其可作為卵巢癌基因治療的新靶點(diǎn)[6]。本研究選用RNA干擾技術(shù)，合成靶定hPTTG1基因的特異小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)，轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株A2780，觀察其對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細(xì)胞株 人卵巢癌細(xì)胞株A2780由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。

1.2主要試劑hPTTG1 siRNA及陰性對(duì)照siRNA(sense：3’-AlexaFluor488)由南京凱基公司合成；羊抗人hPTTG1蛋白多克隆抗體、鼠抗人c-Myc單克隆抗體、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購(gòu)自Santa Cruz；hPTTG1、c-myc和內(nèi)參照GAPDH引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；RPMI-1640、胎牛血清、opti-MEM購(gòu)自Gibco-BRL；Trizol、RNase H、SuperScriptTMⅢ first-strand synthesis cDNA kit和Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen；KOD FX DNA PCR試劑購(gòu)自Toyobo；分子量標(biāo)志物購(gòu)自Fermentas；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司；β-巰基乙醇、苯甲基磺酰氟(PMSF)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)于Sigma；[3H]-TdR購(gòu)于中國(guó)原子能研究所； 膜連蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基公司；TUNEL染色試劑盒購(gòu)自Boehringer Mannheim。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) A2780細(xì)胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到85%匯聚時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代。在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中按照2×105cells/well的密度接種細(xì)胞，每孔加入1.5 mL不含抗生素和血清的RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞達(dá)到50%左右融合時(shí)，棄去原培養(yǎng)液用opti-MEM輕洗2次，參照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

2.2siRNA轉(zhuǎn)染hPTTG1 siRNA: 正義鏈 5’-GACCUGCAAUAAUCCAGAAdTdT-3’，反義鏈 5’-UUCUGGAUUAUUGCAGGUCdTdT-3’。將細(xì)胞分為hPTTG1干擾組(轉(zhuǎn)染hPTTG1 siRNA)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA)和空白對(duì)照組(未進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染)。首先用陰性對(duì)照siRNA優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系，將100 pmol siRNA 用250 μL無(wú)抗生素、無(wú)血清opti-MEM培養(yǎng)液稀釋?zhuān)p混，室溫靜置5 min；在250 μL無(wú)抗生素、無(wú)血清opti-MEM培養(yǎng)液中稀釋5 μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，輕混，室溫靜置5 min；混合稀釋的siRNA 和轉(zhuǎn)染試劑，室溫靜置20 min，將500 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，混合均勻，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染6 h后更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

2.3RT-PCR檢測(cè)hPTTG1和c-myc表達(dá) 由GenBank檢索目的基因序列，利用Primer-BLAST在線(xiàn)設(shè)計(jì)引物，序列如下：hPTTG1上游引物 5’-CGGCTGTTAAGACCTGCAAT-3’，下游引物 5’-GGCAGGAACAGAGCTTTTTG-3’， 產(chǎn)物長(zhǎng)度346 bp；c-myc上游引物 5’-ACGGCCGACCAGCTGGAGAT-3’， 下游引物 5’-TGGGCGAGCTGCTGTCGTTG-3’， 產(chǎn)物長(zhǎng)度334 bp；同時(shí)以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照，上游引物 5’-CAGTCAGCCGCATCTTCTT-3’，下游引物 5’-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度288 bp。參照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260和A280值，計(jì)算其濃度和純度，每一樣品重復(fù)3次。利用oligo(dT)20引物和SuperScriptTMⅢ試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，在10 μL 反應(yīng)體系中按照KOD FX DNA polymerase試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為： 94 ℃ 2 min，94 ℃15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，EB染色后利用自動(dòng)電泳凝膠掃描分析系統(tǒng)測(cè)定電泳條帶的積分吸光度值(integrated absorbance，IA)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取hPTTG1IA/GAPDHIA平均值作為其mRNA表達(dá)水平的相對(duì)值。

2.4Western blotting檢測(cè)hPTTG1和c-Myc蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后的3組細(xì)胞，冷PBS沖洗后，蛋白裂解液(50 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、0.1% SDS、0.02%NaN3、100 mg/L PMSF、1%NP-40、1 mg/L aprotinin)提取細(xì)胞總蛋白，冰浴30 min裂解混勻、4 ℃ 12 000 r/min離心10 min后，按照DC protein assay試劑說(shuō)明行總蛋白測(cè)定，SDS-PAGE電泳后，半干轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入第Ⅰ抗體(hPTTG 1∶200，c-Myc 1∶200，GAPDH 1∶500)室溫孵育2 h，PBST洗膜后加入1∶5 000稀釋的第Ⅱ抗體孵育1 h，PBST洗膜后，ECL顯色曝光并通過(guò)X線(xiàn)膠片曝光洗片，經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠分析系統(tǒng)掃描并測(cè)定雜交條帶IA，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，將hPTTG1IA/ GAPDHIA平均值作為其蛋白表達(dá)水平的相對(duì)值。

2.5MTT測(cè)定細(xì)胞增殖 胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備濃度為1×108cells/L單細(xì)胞懸液，96孔板每孔接種100 μL，基因沉默方法同前，測(cè)定轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h和96 h細(xì)胞增殖活性。在距離時(shí)間點(diǎn)結(jié)束4 h時(shí)小心吸去上清，加入80 μL無(wú)血清opti-MEM培養(yǎng)液，再加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸掉上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，混勻后以酶標(biāo)儀于570 nm處讀取各孔吸光度值(A570)，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，按下面公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組A570均值/對(duì)照組A570均值)]×100%，以時(shí)間為坐標(biāo)橫軸，吸光度值為坐標(biāo)縱軸繪圖。

2.6[3H]-TdR 摻入實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞更換無(wú)血清培養(yǎng)基同步化處理24 h，每孔加入3.7×104Bq [3H]-TdR繼續(xù)培養(yǎng)16 h，吸棄上清，PBS沖洗，胰酶消化后將細(xì)胞抽濾到玻璃纖維素濾膜上，PBS沖洗，5%三氯醋酸固定，無(wú)水乙醇脫色脫水，濾膜烘干后加入閃爍液，用液閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定[3H]每分鐘放射性計(jì)數(shù)值(counts/min)。

2.7Annexin V-FITC檢測(cè)細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞PBS洗滌，2 000 r/min離心5 min收集1×105細(xì)胞，用500 μL 1×binding buffer懸浮細(xì)胞，加入1 μL Annexin V-FITC混勻后加入5 μL 碘化丙啶(propi-dium iodide,PI)，然后混勻，避光室溫反應(yīng)5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)ITC綠色熒光通道用FL2檢測(cè)，PI紅色熒光通道用FL1檢測(cè)。

2.8TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將消毒滅菌的載玻片放置在6孔培養(yǎng)板上，細(xì)胞接種和轉(zhuǎn)染步驟同前，取出細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定，0.1%Triton-X100透膜，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，通過(guò)顯微圖像分析系統(tǒng)采集圖像并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，取其平均值作為各組細(xì)胞的凋亡指數(shù)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1hPTTG1siRNA對(duì)A2780細(xì)胞hPTTG1mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，hPTTG1干擾組A2780細(xì)胞內(nèi)hPTTG1目的基因電泳條帶密度減弱，mRNA表達(dá)水平降低，其mRNA抑制率為70.5%±3.9%。hPTTG1干擾組hPTTG1 mRNA表達(dá)量為0.27±0.09，顯著低于空白組(0.91±0.03)和陰性對(duì)照組(0.89±0.06)(n=3,P<0.05)，而陰性對(duì)照組和空白組間無(wú)顯著差異(n=3,P>0.05),見(jiàn)圖1。

Figure 1. The expression ofhPTTG1 mRNA in A2780 ovarian cancer cell afterhPTTG1 siRNA transfection. M:ФX174 /HaeIII DNA marker; Lane 1:normal; Lane 2: negative siRNA; Lane3:hPTTG1siRNA.

圖1轉(zhuǎn)染hPTTG1siRNA后A2780細(xì)胞內(nèi)hPTTG1mRNA表達(dá)

2hPTTG1siRNA對(duì)A2780細(xì)胞中hPTTG1蛋白表達(dá)的影響

Western blotting 結(jié)果顯示，hPTTG1干擾組中hPTTG1蛋白雜交條帶信號(hào)降低，蛋白表達(dá)水平下降，其蛋白表達(dá)抑制率為63.8%±4.5%；hPTTG1干擾組中hPTTG1蛋白表達(dá)量為0.30±0.04，顯著低于空白組(0.82±0.04)和陰性對(duì)照組(0.78±0.02)(n=3,P<0.05)，而陰性對(duì)照組與空白組間無(wú)顯著差異(n=3,P>0.05),見(jiàn)圖2。

3hPTTG1siRNA對(duì)A2780細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示hPTTG1干擾組細(xì)胞增殖速度較其它2組細(xì)胞慢，各時(shí)點(diǎn)吸光度值明顯低于空白和陰性對(duì)照組，顯著差異(n=3，P<0.05)，而陰性對(duì)照組與空白組間吸光度值無(wú)顯著差異(n=3,P>0.05)。轉(zhuǎn)染hPTTG1 siRNA 24 h細(xì)胞吸光度值開(kāi)始下降，24 h細(xì)胞抑制率為24.3%±3.7%；48 h抑制效果最明顯，抑制率為42.9%±5.2%；48 h后抑制效應(yīng)減弱，增殖速度有所提高，但仍低于空白和陰性對(duì)照組；72 h、96 h細(xì)胞抑制率分別為30.3%±2.9%和24.8%±5.4%，各時(shí)點(diǎn)的吸光度值曲線(xiàn)見(jiàn)圖3。

Figure 2. The expression of hPTTG1 protein in A2780 ovarian cancer cell afterhPTTG1 siRNA transfection. Lane 1:normal;Lane 2:negative siRNA;Lane 3:hPTTG1 siRNA.

圖2轉(zhuǎn)染hPTTG1siRNA后A2780細(xì)胞內(nèi)hPTTG1蛋白表達(dá)

圖3轉(zhuǎn)染hPTTG1siRNA對(duì)A2780細(xì)胞增殖的作用

4hPTTG1siRNA對(duì)A2780細(xì)胞[3H]-TdR摻入量的影響

與空白組和陰性對(duì)照組相比，hPTTG1 siRNA轉(zhuǎn)染組A2780細(xì)胞[3H]-TdR放射性強(qiáng)度明顯降低，差異顯著(n=3，P<0.05)；空白組和陰性對(duì)照組間放射性強(qiáng)度比較無(wú)顯著差異(n=3，P>0.05)。hPTTG1 siRNA轉(zhuǎn)染組放射性強(qiáng)度為(758.0±28.7)counts/min，空白組和陰性對(duì)照組分別為(1 327.0±109.5)counts/min和(1 164.0±98.3)counts/min，表明hPTTG1 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的DNA合成水平下降，細(xì)胞增殖受抑。

5hPTTG1siRNA對(duì)A2780細(xì)胞凋亡的影響

hPTTG1 siRNA干擾組細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞凋亡率和壞死率均增加，與空白和陰性對(duì)照組相比均有顯著差異(n=3，P<0.05)；陰性和空白對(duì)照組間細(xì)胞凋亡率、壞死率及存活率比較無(wú)顯著差異(n=3，P>0.05),見(jiàn)圖4、表1。

表13組細(xì)胞的AnnexinV-FITC染色流式細(xì)胞儀分析結(jié)果

RegionNormal(%)NegativesiRNA(%)hPTTG1siRNA(%)Lowerleft(survivalcells)73.61±4.1769.90±5.3851.85±3.97Upperright(necrosiscells)15.64±3.2918.26±2.5426.28±3.14Lowerright(cellapoptosis)8.54±1.139.17±1.4119.42±3.05

Figure 4. The influence ofhPTTG1 siRNA on the apoptosis of A2780 cells.

圖4轉(zhuǎn)染hPTTG1siRNA對(duì)A2780細(xì)胞凋亡的影響

6細(xì)胞凋亡的TUNEL檢測(cè)結(jié)果

空白組和陰性對(duì)照組細(xì)胞僅見(jiàn)少數(shù)胞核呈棕褐色，凋亡指數(shù)分別為(7.69±0.85)%和(8.34±1.07)%；hPTTG1 siRNA干擾組胞核陽(yáng)性染色增多,見(jiàn)圖5，凋亡指數(shù)為(21.47±1.89)%，與空白組和陰性對(duì)照組相比較差異顯著(n=3，P<0.05)，空白和陰性對(duì)照組間無(wú)顯著差異(n=3，P>0.05), 表明hPTTG1 siRNA可誘導(dǎo)A2780細(xì)胞凋亡。

Figure 5. Cell apoptosis of A2780 cell detected by TUNEL staining test(×20).A:normal;B:hPTTG1 siRNA.

圖5TUNEL染色檢測(cè)A2780細(xì)胞凋亡

7hPTTG1siRNA對(duì)A2780細(xì)胞中c-mycmRNA和蛋白表達(dá)的影響

hPTTG1干擾后c-mycmRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)，hPTTG1干擾組c-mycmRNA表達(dá)量為0.43±0.07，顯著低于空白組(0.78±0.05)和陰性對(duì)照組(0.74±0.03),n=3,P<0.05；hPTTG1干擾組c-Myc蛋白表達(dá)量為0.51±0.04，顯著低于空白組(0.83±0.06)和陰性對(duì)照組(0.79±0.05),n=3,P<0.05)，而陰性對(duì)照組和空白組間mRNA和蛋白無(wú)顯著差異(n=3,P>0.05),見(jiàn)圖6、7。

Figure 6. The expression ofc-mycmRNA in A2780 ovarian cancer cells afterhPTTG1 siRNA transfection. M:ФX174 /HaeIII DNA marker; Lane 1:normal; Lane 2: negative siRNA; Lane 3:hPTTG1 siRNA.

圖6hPTTG1siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)A2780細(xì)胞內(nèi)c-mycmRNA表達(dá)的影響

Figure 7. The expression of c-Myc protein in A2780 ovarian cancer cells afterhPTTG1 siRNA transfection.Lane 1:normal;Lane 2: negative siRNA;Lane 3:hPTTG1 siRNA.

圖7hPTTG1表達(dá)下降對(duì)細(xì)胞c-Myc蛋白表達(dá)的影響

討 論

hPTTG1定位于5 號(hào)染色體長(zhǎng)臂5q35.1，在大多數(shù)正常成人組織中只有弱表達(dá)甚至檢測(cè)不到，而胚胎肝、睪丸、胸腺中強(qiáng)表達(dá)[1-3]。在多種惡性腫瘤組織及細(xì)胞株中均檢測(cè)到hPTTG1異常高表達(dá)，其可通過(guò)多條途徑參與腫瘤演進(jìn)，并與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。hPTTG1表達(dá)呈細(xì)胞周期依賴(lài)性，在有絲分裂期達(dá)高峰。hPTTG1蛋白是一種封閉素(securin)蛋白，其過(guò)表達(dá)能夠抑制姐妹染色單體分離阻礙有絲分裂，誘導(dǎo)子代細(xì)胞非整倍體化和基因不穩(wěn)定性[7]。作為一種強(qiáng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化癌基因，hPTTG1還具有激活增殖功能，在無(wú)其它輔助癌基因作用下即可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化[8]。hPTTG1對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控也具有雙重作用，其過(guò)度表達(dá)可引起p53依賴(lài)性和p53非依賴(lài)性細(xì)胞凋亡，還可通過(guò)上調(diào)survivin表達(dá)、抑制p53活性拮抗凋亡[9]。hPTTG1功能的復(fù)雜性可能與該基因表達(dá)的組織特異性、亞細(xì)胞定位、劑量依賴(lài)性和蛋白磷酸化狀態(tài)相關(guān)[10]。盡管已有文獻(xiàn)證實(shí)卵巢癌組織中hPTTG1高表達(dá)，但其與卵巢癌增殖和凋亡的關(guān)系還未見(jiàn)報(bào)道。

RNAi技術(shù)能夠高效、特異地抑制目的基因表達(dá)，已成為基因功能研究和基因治療的新手段。siRNA為RNAi產(chǎn)生效應(yīng)的中介分子，目前主要通過(guò)化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、長(zhǎng)片段dsRNAs降解、表達(dá)載體和PCR制備法獲得siRNA[11]，經(jīng)過(guò)探索和改進(jìn)，化學(xué)合成法已克服價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)，并且合成周期短，操作簡(jiǎn)便，較載體途徑的siRNA更為接近臨床。本實(shí)驗(yàn)將合成的hPTTG1基因siRNA轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR和Western blotting驗(yàn)證能夠在細(xì)胞內(nèi)有效實(shí)現(xiàn)其基因沉默效應(yīng)。hPTTG1基因下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，增殖受抑，48 h抑制效率最高，細(xì)胞凋亡率增加，說(shuō)明hPTTG1下調(diào)可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡進(jìn)而阻抑細(xì)胞增殖形成。癌基因c-myc位于人染色體8q24，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，編碼磷酸化蛋白p62，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和凋亡的雙重功能，在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12]。hPTTG1可與其它核蛋白組成復(fù)合物，直接與c-myc轉(zhuǎn)錄起始區(qū)結(jié)合，激活c-myc轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)其蛋白表達(dá)刺激細(xì)胞周期進(jìn)程，引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成[13]。

本研究還發(fā)現(xiàn)hPTTG1干擾后細(xì)胞c-mycmRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，從而抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化。由于卵巢癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段逐步演變的過(guò)程，涉及多個(gè)基因的改變和相互作用，可針對(duì)其中起關(guān)鍵作用的基因利用siRNA技術(shù)抑制或下調(diào)靶基因的表達(dá)．從而實(shí)現(xiàn)基因治療的目的[14]。陳剛等[15]將反義hPTTG1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞系SK-OV-3導(dǎo)致其克隆形成率下降。EI-Naggar等[16]研究證實(shí)hPTTG1 siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞增殖能力下降50%，軟瓊脂克隆形成率下降70%，裸鼠成瘤能力受抑，提示hPTTG1可作為卵巢癌基因治療的新靶點(diǎn)，關(guān)于其調(diào)控卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制有待進(jìn)一步深入探討。

[1] Grossman AB. The molecular biology of pituitary tumors: a personal perspective[J].Pituitary,2009,12(3):265-270.

[2] Kim DS, Franklyn JA, Smith VE, et al. Securin induces genetic instability in colorectal cancer by inhibiting double-stranded DNA repair activity[J]. Carcinogenesis, 2007, 28(3):749-759.

[3] Tfelt HJ, Kanuparthi D, Chattopadhyay N. The emerging role of pituitary tumor transforming gene in tumorigenesis[J]. Clin Med Res, 2006,4(2):130-137.

[4] 王言奎，李 軍，崔 娜，等.卵巢上皮性癌組織中PTTG的表達(dá)與微血管密度和bFGF的關(guān)系[J]. 腫瘤防治雜志，2005，12(12)：907-912.

[5] 成夜霞，馮 捷，張辛燕，等.人垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1在卵巢癌組織中的表達(dá)及意義[J]. 癌癥，2004，23(9)：1026-1030.

[6] Panguluri SK, Yeakel C, Kakar SS. PTTG: an important target gene for ovarian cancer therapy[J]. J Ovarian Res, 2008, 1(1):6.

[7] Bradshaw C, Kakar SS. Pituitary tumor transforming gene: an important gene in normal cellular functions and tumorigenesis [J]. Histol Histopathol, 2007, 22(2):219-226.

[8] Solbach C, Roller M, Peters S, et al. Pituitary tumor-transforming gene (PTTG): a novel target for anti-tumor therapy[J].Anticancer Res, 2005,25(1A):121-125.

[9] Salehi F, Kovacs K, Scheithauer BW, et al. Pituitary tumor-transforming gene in endocrine and other neoplasms: a review and update[J]. Endocr Relat Cancer, 2008, 15(3):721-743.

[10]Hamid T, Kakar SS.PTTG and cancer[J]. Histol Histopathol,2003,18(1):245-251.

[11]孔祥平，Reneker LW.核糖核酸干擾[J].中國(guó)病理生理雜志，2004，20(5)：900-903.

[12]Bapat SA, Krishnan A, Ghanate AD, et al. Gene expression: protein interaction systems network modeling identifies transformation-associated molecules and pathways in ovarian cancer[J].Cancer Res,2010,70(12):4809-4819.

[13]Pei L. Identification ofc-mycas a down-stream target for pituitary tumor-transforming gene[J].J Biol Chem,2001,276(11):8484-8491.

[14]Boxer LM, Dang CV. Translocations involvingc-mycandc-mycfunction[J].Oncogene,2001,20(40):5595-5610.

[15]陳 剛，李 靜，李輔軍，等. 反義PTTG真核表達(dá)載體對(duì)人卵巢癌細(xì)胞sk-ov-3惡性表型的抑制作用[J].癌癥，2003，22(10)：1009-1013.

[16]El-Naggar SM, Malik MT, Kakar SS. Small interfering RNA against PTTG: a novel therapy for ovarian cancer[J].Int J Oncol,2007,31(1)：137-143.

EffectofhPTTG1siRNAonproliferationandapoptosisofovariancancercells

LIU Jie1, SHEN Wen-jing2, LU Yao1, ZHAO Xun1, SONG Min3

(1ExperimentalTechnologyCenter,2DepartmentofMaternity,TheFirstAffiliatedHospital;3DepartmentofPathology,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.E-mail:lj6152003@163.com)

AIM: To observe the proliferation and apoptosis of ovarian cancer cells by silencing the expression of human pituitary tumor-transforming gene 1 (hPTTG1) using RNA interference technique.METHODSThe chemically synthesized siRNA targetinghPTTG1 was transfected into ovarian cancer cell line A2780invitro. The expression levels ofhPTTG1 andc-mycwere examined by RT-PCR and Western blotting. Cell proliferation was measured by MTT colorimetric assay and [3H]-TdR incorporation test. Cell apoptosis was detected by flow cytometry with annexin V/PI and TUNEL labeling.RESULTSThe expression ofhPTTG1 at mRNA and protein levels was inhibited after transfection ofhPTTG1 siRNA. The inhibitory efficiency was 70.5%±3.9% and 63.8%±4.5%, respectively. The absorbance began to decrease 24 h after transfection ofhPTTG1 siRNA,and the highest inhibitory rate was 42.9%±5.2% at 48 h post-transfection. Radioactive incorporation of [3H]-TdR inhPTTG1 siRNA group was lower than that in normal and negative groups. The survival rate declined while the apoptotic rate and necrotic rate increased inhPTTG1 siRNA group. Apoptotic index inhPTTG1 siRNA group was higher than that in normal and negative groups. The expression ofc-mycat mRNA and protein levels was down-regulated.CONCLUSIONCell proliferation is inhibited and cell apoptosis is induced byhPTTG1 siRNA through down-regulating the expression ofc-myc.hPTTG1 can be regarded as a candidate gene for ovarian cancer gene therapy.

Genes,human pituitaty tumor-transforming; Ovarian neoplasms; Cell proliferation; Apoptosis;c-myc

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.020

1000-4718(2011)01-0102-06

2010-08-16

2010-11-04

遼寧省教育廳科研項(xiàng)目(No.L2010681)

△通訊作者 Tel:024-23256666-5494；E-mail:lj6152003@163.com