• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    小干擾RNA沉默hPTTG1基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖和凋亡的影響*

    2011-10-24 01:39:51沈文靜
    中國病理生理雜志 2011年1期
    關(guān)鍵詞:檢測

    劉 潔, 沈文靜, 盧 瑤, 趙 恂, 宋 敏

    (中國醫(yī)科大學(xué)1實驗技術(shù)中心,2附屬第一臨床學(xué)院婦科,3病理教研室, 遼寧 沈陽 110001)

    小干擾RNA沉默hPTTG1基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖和凋亡的影響*

    劉 潔1△, 沈文靜2, 盧 瑤1, 趙 恂1, 宋 敏3

    (中國醫(yī)科大學(xué)1實驗技術(shù)中心,2附屬第一臨床學(xué)院婦科,3病理教研室, 遼寧 沈陽 110001)

    目的利用RNA干擾技術(shù)沉默人垂體瘤轉(zhuǎn)化基因1(hPTTG1)表達(dá),觀察卵巢癌細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞凋亡的改變并探討分子機制。方法化學(xué)合成靶定hPTTG1的小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的A2780細(xì)胞,RT-PCR和Western blotting檢測hPTTG1及c-myc表達(dá)水平;MTT法和[3H]-TdR摻入實驗檢測hPTTG1對細(xì)胞增殖的影響;annexin V/PI染色流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法測定各組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果hPTTG1 siRNA轉(zhuǎn)染組hPTTG1 mRNA和蛋白表達(dá)下降,抑制率分別為70.5%±3.9%和63.8%±4.5%;轉(zhuǎn)染hPTTG1 siRNA 24 h細(xì)胞吸光度值開始下降,48 h抑制效果最明顯,抑制率為42.9%±5.2%;轉(zhuǎn)染hPTTG1 siRNA后細(xì)胞[3H]-TdR放射性計數(shù)明顯低于空白組和陰性對照組;hPTTG1 siRNA干擾組細(xì)胞存活率下降,細(xì)胞凋亡率和壞死率均增加;TUNEL染色分析結(jié)果可見hPTTG1 siRNA干擾組凋亡指數(shù)明顯高于空白組和陰性對照組;hPTTG1干擾后c-mycmRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)。結(jié)論hPTTG1 siRNA通過下調(diào)c-myc表達(dá)抑制A2780細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,hPTTG1可作為卵巢癌基因治療的候選靶點。

    基因,人垂體瘤轉(zhuǎn)化; 卵巢腫廇; 細(xì)胞增殖; 細(xì)胞凋亡;c-myc

    卵巢癌是死亡率最高的婦科腫瘤,其發(fā)病率較高,診治困難,傳統(tǒng)的治療手段療效差且復(fù)發(fā)率極高,以免疫治療和基因治療為代表的生物治療顯示出一定的優(yōu)越性。人垂體瘤轉(zhuǎn)化基因1(human pituitary tumor-transforming gene,hPTTG1)廣泛參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1-3],已有研究證實卵巢癌組織中hPTTG1異常高表達(dá),且與較晚的手術(shù)病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[4,5],提示其可作為卵巢癌基因治療的新靶點[6]。本研究選用RNA干擾技術(shù),合成靶定hPTTG1基因的特異小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株A2780,觀察其對卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響,并探討機制。

    材 料 和 方 法

    1材料

    1.1細(xì)胞株 人卵巢癌細(xì)胞株A2780由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。

    1.2主要試劑hPTTG1 siRNA及陰性對照siRNA(sense:3’-AlexaFluor488)由南京凱基公司合成;羊抗人hPTTG1蛋白多克隆抗體、鼠抗人c-Myc單克隆抗體、增強型化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自Santa Cruz;hPTTG1、c-myc和內(nèi)參照GAPDH引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;RPMI-1640、胎牛血清、opti-MEM購自Gibco-BRL;Trizol、RNase H、SuperScriptTMⅢ first-strand synthesis cDNA kit和Lipofectamine 2000購自Invitrogen;KOD FX DNA PCR試劑購自Toyobo;分子量標(biāo)志物購自Fermentas;辣根過氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗購自北京中杉金橋生物有限公司;β-巰基乙醇、苯甲基磺酰氟(PMSF)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于Sigma;[3H]-TdR購于中國原子能研究所; 膜連蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司;TUNEL染色試劑盒購自Boehringer Mannheim。

    2方法

    2.1細(xì)胞培養(yǎng) A2780細(xì)胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng),置于37 ℃、5% CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞達(dá)到85%匯聚時用0.25%胰蛋白酶消化傳代。在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中按照2×105cells/well的密度接種細(xì)胞,每孔加入1.5 mL不含抗生素和血清的RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞達(dá)到50%左右融合時,棄去原培養(yǎng)液用opti-MEM輕洗2次,參照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

    2.2siRNA轉(zhuǎn)染hPTTG1 siRNA: 正義鏈 5’-GACCUGCAAUAAUCCAGAAdTdT-3’,反義鏈 5’-UUCUGGAUUAUUGCAGGUCdTdT-3’。將細(xì)胞分為hPTTG1干擾組(轉(zhuǎn)染hPTTG1 siRNA)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)和空白對照組(未進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染)。首先用陰性對照siRNA優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系,將100 pmol siRNA 用250 μL無抗生素、無血清opti-MEM培養(yǎng)液稀釋,輕混,室溫靜置5 min;在250 μL無抗生素、無血清opti-MEM培養(yǎng)液中稀釋5 μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑,輕混,室溫靜置5 min;混合稀釋的siRNA 和轉(zhuǎn)染試劑,室溫靜置20 min,將500 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,混合均勻,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),轉(zhuǎn)染6 h后更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行實驗檢測。

    2.3RT-PCR檢測hPTTG1和c-myc表達(dá) 由GenBank檢索目的基因序列,利用Primer-BLAST在線設(shè)計引物,序列如下:hPTTG1上游引物 5’-CGGCTGTTAAGACCTGCAAT-3’,下游引物 5’-GGCAGGAACAGAGCTTTTTG-3’, 產(chǎn)物長度346 bp;c-myc上游引物 5’-ACGGCCGACCAGCTGGAGAT-3’, 下游引物 5’-TGGGCGAGCTGCTGTCGTTG-3’, 產(chǎn)物長度334 bp;同時以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照,上游引物 5’-CAGTCAGCCGCATCTTCTT-3’,下游引物 5’-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3’,產(chǎn)物長度288 bp。參照Trizol試劑說明書提取各組細(xì)胞總RNA,紫外分光光度計測定A260和A280值,計算其濃度和純度,每一樣品重復(fù)3次。利用oligo(dT)20引物和SuperScriptTMⅢ試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA,在10 μL 反應(yīng)體系中按照KOD FX DNA polymerase試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴增,反應(yīng)條件為: 94 ℃ 2 min,94 ℃15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,33個循環(huán),72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測,EB染色后利用自動電泳凝膠掃描分析系統(tǒng)測定電泳條帶的積分吸光度值(integrated absorbance,IA),實驗重復(fù)3 次,取hPTTG1IA/GAPDHIA平均值作為其mRNA表達(dá)水平的相對值。

    2.4Western blotting檢測hPTTG1和c-Myc蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后的3組細(xì)胞,冷PBS沖洗后,蛋白裂解液(50 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、0.1% SDS、0.02%NaN3、100 mg/L PMSF、1%NP-40、1 mg/L aprotinin)提取細(xì)胞總蛋白,冰浴30 min裂解混勻、4 ℃ 12 000 r/min離心10 min后,按照DC protein assay試劑說明行總蛋白測定,SDS-PAGE電泳后,半干轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜,5%脫脂奶粉封閉2 h后,加入第Ⅰ抗體(hPTTG 1∶200,c-Myc 1∶200,GAPDH 1∶500)室溫孵育2 h,PBST洗膜后加入1∶5 000稀釋的第Ⅱ抗體孵育1 h,PBST洗膜后,ECL顯色曝光并通過X線膠片曝光洗片,經(jīng)自動電泳凝膠分析系統(tǒng)掃描并測定雜交條帶IA,實驗重復(fù)3 次,將hPTTG1IA/ GAPDHIA平均值作為其蛋白表達(dá)水平的相對值。

    2.5MTT測定細(xì)胞增殖 胰酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞,制備濃度為1×108cells/L單細(xì)胞懸液,96孔板每孔接種100 μL,基因沉默方法同前,測定轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h和96 h細(xì)胞增殖活性。在距離時間點結(jié)束4 h時小心吸去上清,加入80 μL無血清opti-MEM培養(yǎng)液,再加入20 μL MTT溶液(5 g/L),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,然后吸掉上清,每孔加入150 μL二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解,混勻后以酶標(biāo)儀于570 nm處讀取各孔吸光度值(A570),每組設(shè)定3個復(fù)孔,按下面公式計算細(xì)胞生長抑制率,細(xì)胞生長抑制率(%)=[1-(實驗組A570均值/對照組A570均值)]×100%,以時間為坐標(biāo)橫軸,吸光度值為坐標(biāo)縱軸繪圖。

    2.6[3H]-TdR 摻入實驗分析細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞更換無血清培養(yǎng)基同步化處理24 h,每孔加入3.7×104Bq [3H]-TdR繼續(xù)培養(yǎng)16 h,吸棄上清,PBS沖洗,胰酶消化后將細(xì)胞抽濾到玻璃纖維素濾膜上,PBS沖洗,5%三氯醋酸固定,無水乙醇脫色脫水,濾膜烘干后加入閃爍液,用液閃爍計數(shù)儀測定[3H]每分鐘放射性計數(shù)值(counts/min)。

    2.7Annexin V-FITC檢測細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞PBS洗滌,2 000 r/min離心5 min收集1×105細(xì)胞,用500 μL 1×binding buffer懸浮細(xì)胞,加入1 μL Annexin V-FITC混勻后加入5 μL 碘化丙啶(propi-dium iodide,PI),然后混勻,避光室溫反應(yīng)5 min,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,F(xiàn)ITC綠色熒光通道用FL2檢測,PI紅色熒光通道用FL1檢測。

    2.8TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡 將消毒滅菌的載玻片放置在6孔培養(yǎng)板上,細(xì)胞接種和轉(zhuǎn)染步驟同前,取出細(xì)胞爬片,4%多聚甲醛固定,0.1%Triton-X100透膜,按照試劑盒說明進(jìn)行操作,通過顯微圖像分析系統(tǒng)采集圖像并計數(shù)凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比,取其平均值作為各組細(xì)胞的凋亡指數(shù)。

    3統(tǒng)計學(xué)處理

    結(jié) 果

    1hPTTG1siRNA對A2780細(xì)胞hPTTG1mRNA表達(dá)的影響

    RT-PCR結(jié)果顯示,hPTTG1干擾組A2780細(xì)胞內(nèi)hPTTG1目的基因電泳條帶密度減弱,mRNA表達(dá)水平降低,其mRNA抑制率為70.5%±3.9%。hPTTG1干擾組hPTTG1 mRNA表達(dá)量為0.27±0.09,顯著低于空白組(0.91±0.03)和陰性對照組(0.89±0.06)(n=3,P<0.05),而陰性對照組和空白組間無顯著差異(n=3,P>0.05),見圖1。

    Figure 1. The expression ofhPTTG1 mRNA in A2780 ovarian cancer cell afterhPTTG1 siRNA transfection. M:ФX174 /HaeIII DNA marker; Lane 1:normal; Lane 2: negative siRNA; Lane3:hPTTG1siRNA.

    圖1轉(zhuǎn)染hPTTG1siRNA后A2780細(xì)胞內(nèi)hPTTG1mRNA表達(dá)

    2hPTTG1siRNA對A2780細(xì)胞中hPTTG1蛋白表達(dá)的影響

    Western blotting 結(jié)果顯示,hPTTG1干擾組中hPTTG1蛋白雜交條帶信號降低,蛋白表達(dá)水平下降,其蛋白表達(dá)抑制率為63.8%±4.5%;hPTTG1干擾組中hPTTG1蛋白表達(dá)量為0.30±0.04,顯著低于空白組(0.82±0.04)和陰性對照組(0.78±0.02)(n=3,P<0.05),而陰性對照組與空白組間無顯著差異(n=3,P>0.05),見圖2。

    3hPTTG1siRNA對A2780細(xì)胞增殖的影響

    MTT結(jié)果顯示hPTTG1干擾組細(xì)胞增殖速度較其它2組細(xì)胞慢,各時點吸光度值明顯低于空白和陰性對照組,顯著差異(n=3,P<0.05),而陰性對照組與空白組間吸光度值無顯著差異(n=3,P>0.05)。轉(zhuǎn)染hPTTG1 siRNA 24 h細(xì)胞吸光度值開始下降,24 h細(xì)胞抑制率為24.3%±3.7%;48 h抑制效果最明顯,抑制率為42.9%±5.2%;48 h后抑制效應(yīng)減弱,增殖速度有所提高,但仍低于空白和陰性對照組;72 h、96 h細(xì)胞抑制率分別為30.3%±2.9%和24.8%±5.4%,各時點的吸光度值曲線見圖3。

    Figure 2. The expression of hPTTG1 protein in A2780 ovarian cancer cell afterhPTTG1 siRNA transfection. Lane 1:normal;Lane 2:negative siRNA;Lane 3:hPTTG1 siRNA.

    圖2轉(zhuǎn)染hPTTG1siRNA后A2780細(xì)胞內(nèi)hPTTG1蛋白表達(dá)

    圖3轉(zhuǎn)染hPTTG1siRNA對A2780細(xì)胞增殖的作用

    4hPTTG1siRNA對A2780細(xì)胞[3H]-TdR摻入量的影響

    與空白組和陰性對照組相比,hPTTG1 siRNA轉(zhuǎn)染組A2780細(xì)胞[3H]-TdR放射性強度明顯降低,差異顯著(n=3,P<0.05);空白組和陰性對照組間放射性強度比較無顯著差異(n=3,P>0.05)。hPTTG1 siRNA轉(zhuǎn)染組放射性強度為(758.0±28.7)counts/min,空白組和陰性對照組分別為(1 327.0±109.5)counts/min和(1 164.0±98.3)counts/min,表明hPTTG1 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的DNA合成水平下降,細(xì)胞增殖受抑。

    5hPTTG1siRNA對A2780細(xì)胞凋亡的影響

    hPTTG1 siRNA干擾組細(xì)胞存活率下降,細(xì)胞凋亡率和壞死率均增加,與空白和陰性對照組相比均有顯著差異(n=3,P<0.05);陰性和空白對照組間細(xì)胞凋亡率、壞死率及存活率比較無顯著差異(n=3,P>0.05),見圖4、表1。

    表13組細(xì)胞的AnnexinV-FITC染色流式細(xì)胞儀分析結(jié)果

    RegionNormal(%)NegativesiRNA(%)hPTTG1siRNA(%)Lowerleft(survivalcells)73.61±4.1769.90±5.3851.85±3.97Upperright(necrosiscells)15.64±3.2918.26±2.5426.28±3.14Lowerright(cellapoptosis)8.54±1.139.17±1.4119.42±3.05

    Figure 4. The influence ofhPTTG1 siRNA on the apoptosis of A2780 cells.

    圖4轉(zhuǎn)染hPTTG1siRNA對A2780細(xì)胞凋亡的影響

    6細(xì)胞凋亡的TUNEL檢測結(jié)果

    空白組和陰性對照組細(xì)胞僅見少數(shù)胞核呈棕褐色,凋亡指數(shù)分別為(7.69±0.85)%和(8.34±1.07)%;hPTTG1 siRNA干擾組胞核陽性染色增多,見圖5,凋亡指數(shù)為(21.47±1.89)%,與空白組和陰性對照組相比較差異顯著(n=3,P<0.05),空白和陰性對照組間無顯著差異(n=3,P>0.05), 表明hPTTG1 siRNA可誘導(dǎo)A2780細(xì)胞凋亡。

    Figure 5. Cell apoptosis of A2780 cell detected by TUNEL staining test(×20).A:normal;B:hPTTG1 siRNA.

    圖5TUNEL染色檢測A2780細(xì)胞凋亡

    7hPTTG1siRNA對A2780細(xì)胞中c-mycmRNA和蛋白表達(dá)的影響

    hPTTG1干擾后c-mycmRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào),hPTTG1干擾組c-mycmRNA表達(dá)量為0.43±0.07,顯著低于空白組(0.78±0.05)和陰性對照組(0.74±0.03),n=3,P<0.05;hPTTG1干擾組c-Myc蛋白表達(dá)量為0.51±0.04,顯著低于空白組(0.83±0.06)和陰性對照組(0.79±0.05),n=3,P<0.05),而陰性對照組和空白組間mRNA和蛋白無顯著差異(n=3,P>0.05),見圖6、7。

    Figure 6. The expression ofc-mycmRNA in A2780 ovarian cancer cells afterhPTTG1 siRNA transfection. M:ФX174 /HaeIII DNA marker; Lane 1:normal; Lane 2: negative siRNA; Lane 3:hPTTG1 siRNA.

    圖6hPTTG1siRNA轉(zhuǎn)染對A2780細(xì)胞內(nèi)c-mycmRNA表達(dá)的影響

    Figure 7. The expression of c-Myc protein in A2780 ovarian cancer cells afterhPTTG1 siRNA transfection.Lane 1:normal;Lane 2: negative siRNA;Lane 3:hPTTG1 siRNA.

    圖7hPTTG1表達(dá)下降對細(xì)胞c-Myc蛋白表達(dá)的影響

    討 論

    hPTTG1定位于5 號染色體長臂5q35.1,在大多數(shù)正常成人組織中只有弱表達(dá)甚至檢測不到,而胚胎肝、睪丸、胸腺中強表達(dá)[1-3]。在多種惡性腫瘤組織及細(xì)胞株中均檢測到hPTTG1異常高表達(dá),其可通過多條途徑參與腫瘤演進(jìn),并與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。hPTTG1表達(dá)呈細(xì)胞周期依賴性,在有絲分裂期達(dá)高峰。hPTTG1蛋白是一種封閉素(securin)蛋白,其過表達(dá)能夠抑制姐妹染色單體分離阻礙有絲分裂,誘導(dǎo)子代細(xì)胞非整倍體化和基因不穩(wěn)定性[7]。作為一種強細(xì)胞轉(zhuǎn)化癌基因,hPTTG1還具有激活增殖功能,在無其它輔助癌基因作用下即可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化[8]。hPTTG1對細(xì)胞凋亡的調(diào)控也具有雙重作用,其過度表達(dá)可引起p53依賴性和p53非依賴性細(xì)胞凋亡,還可通過上調(diào)survivin表達(dá)、抑制p53活性拮抗凋亡[9]。hPTTG1功能的復(fù)雜性可能與該基因表達(dá)的組織特異性、亞細(xì)胞定位、劑量依賴性和蛋白磷酸化狀態(tài)相關(guān)[10]。盡管已有文獻(xiàn)證實卵巢癌組織中hPTTG1高表達(dá),但其與卵巢癌增殖和凋亡的關(guān)系還未見報道。

    RNAi技術(shù)能夠高效、特異地抑制目的基因表達(dá),已成為基因功能研究和基因治療的新手段。siRNA為RNAi產(chǎn)生效應(yīng)的中介分子,目前主要通過化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、長片段dsRNAs降解、表達(dá)載體和PCR制備法獲得siRNA[11],經(jīng)過探索和改進(jìn),化學(xué)合成法已克服價格昂貴的缺點,并且合成周期短,操作簡便,較載體途徑的siRNA更為接近臨床。本實驗將合成的hPTTG1基因siRNA轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞,經(jīng)RT-PCR和Western blotting驗證能夠在細(xì)胞內(nèi)有效實現(xiàn)其基因沉默效應(yīng)。hPTTG1基因下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞生長速度減慢,增殖受抑,48 h抑制效率最高,細(xì)胞凋亡率增加,說明hPTTG1下調(diào)可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡進(jìn)而阻抑細(xì)胞增殖形成。癌基因c-myc位于人染色體8q24,由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成,編碼磷酸化蛋白p62,具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和凋亡的雙重功能,在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12]。hPTTG1可與其它核蛋白組成復(fù)合物,直接與c-myc轉(zhuǎn)錄起始區(qū)結(jié)合,激活c-myc轉(zhuǎn)錄活性,上調(diào)其蛋白表達(dá)刺激細(xì)胞周期進(jìn)程,引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成[13]。

    本研究還發(fā)現(xiàn)hPTTG1干擾后細(xì)胞c-mycmRNA和蛋白表達(dá)下調(diào),從而抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化。由于卵巢癌的發(fā)生發(fā)展是一個多階段逐步演變的過程,涉及多個基因的改變和相互作用,可針對其中起關(guān)鍵作用的基因利用siRNA技術(shù)抑制或下調(diào)靶基因的表達(dá).從而實現(xiàn)基因治療的目的[14]。陳剛等[15]將反義hPTTG1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞系SK-OV-3導(dǎo)致其克隆形成率下降。EI-Naggar等[16]研究證實hPTTG1 siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞增殖能力下降50%,軟瓊脂克隆形成率下降70%,裸鼠成瘤能力受抑,提示hPTTG1可作為卵巢癌基因治療的新靶點,關(guān)于其調(diào)控卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的機制有待進(jìn)一步深入探討。

    [1] Grossman AB. The molecular biology of pituitary tumors: a personal perspective[J].Pituitary,2009,12(3):265-270.

    [2] Kim DS, Franklyn JA, Smith VE, et al. Securin induces genetic instability in colorectal cancer by inhibiting double-stranded DNA repair activity[J]. Carcinogenesis, 2007, 28(3):749-759.

    [3] Tfelt HJ, Kanuparthi D, Chattopadhyay N. The emerging role of pituitary tumor transforming gene in tumorigenesis[J]. Clin Med Res, 2006,4(2):130-137.

    [4] 王言奎,李 軍,崔 娜,等.卵巢上皮性癌組織中PTTG的表達(dá)與微血管密度和bFGF的關(guān)系[J]. 腫瘤防治雜志,2005,12(12):907-912.

    [5] 成夜霞,馮 捷,張辛燕,等.人垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1在卵巢癌組織中的表達(dá)及意義[J]. 癌癥,2004,23(9):1026-1030.

    [6] Panguluri SK, Yeakel C, Kakar SS. PTTG: an important target gene for ovarian cancer therapy[J]. J Ovarian Res, 2008, 1(1):6.

    [7] Bradshaw C, Kakar SS. Pituitary tumor transforming gene: an important gene in normal cellular functions and tumorigenesis [J]. Histol Histopathol, 2007, 22(2):219-226.

    [8] Solbach C, Roller M, Peters S, et al. Pituitary tumor-transforming gene (PTTG): a novel target for anti-tumor therapy[J].Anticancer Res, 2005,25(1A):121-125.

    [9] Salehi F, Kovacs K, Scheithauer BW, et al. Pituitary tumor-transforming gene in endocrine and other neoplasms: a review and update[J]. Endocr Relat Cancer, 2008, 15(3):721-743.

    [10]Hamid T, Kakar SS.PTTG and cancer[J]. Histol Histopathol,2003,18(1):245-251.

    [11]孔祥平,Reneker LW.核糖核酸干擾[J].中國病理生理雜志,2004,20(5):900-903.

    [12]Bapat SA, Krishnan A, Ghanate AD, et al. Gene expression: protein interaction systems network modeling identifies transformation-associated molecules and pathways in ovarian cancer[J].Cancer Res,2010,70(12):4809-4819.

    [13]Pei L. Identification ofc-mycas a down-stream target for pituitary tumor-transforming gene[J].J Biol Chem,2001,276(11):8484-8491.

    [14]Boxer LM, Dang CV. Translocations involvingc-mycandc-mycfunction[J].Oncogene,2001,20(40):5595-5610.

    [15]陳 剛,李 靜,李輔軍,等. 反義PTTG真核表達(dá)載體對人卵巢癌細(xì)胞sk-ov-3惡性表型的抑制作用[J].癌癥,2003,22(10):1009-1013.

    [16]El-Naggar SM, Malik MT, Kakar SS. Small interfering RNA against PTTG: a novel therapy for ovarian cancer[J].Int J Oncol,2007,31(1):137-143.

    EffectofhPTTG1siRNAonproliferationandapoptosisofovariancancercells

    LIU Jie1, SHEN Wen-jing2, LU Yao1, ZHAO Xun1, SONG Min3

    (1ExperimentalTechnologyCenter,2DepartmentofMaternity,TheFirstAffiliatedHospital;3DepartmentofPathology,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.E-mail:lj6152003@163.com)

    AIM: To observe the proliferation and apoptosis of ovarian cancer cells by silencing the expression of human pituitary tumor-transforming gene 1 (hPTTG1) using RNA interference technique.METHODSThe chemically synthesized siRNA targetinghPTTG1 was transfected into ovarian cancer cell line A2780invitro. The expression levels ofhPTTG1 andc-mycwere examined by RT-PCR and Western blotting. Cell proliferation was measured by MTT colorimetric assay and [3H]-TdR incorporation test. Cell apoptosis was detected by flow cytometry with annexin V/PI and TUNEL labeling.RESULTSThe expression ofhPTTG1 at mRNA and protein levels was inhibited after transfection ofhPTTG1 siRNA. The inhibitory efficiency was 70.5%±3.9% and 63.8%±4.5%, respectively. The absorbance began to decrease 24 h after transfection ofhPTTG1 siRNA,and the highest inhibitory rate was 42.9%±5.2% at 48 h post-transfection. Radioactive incorporation of [3H]-TdR inhPTTG1 siRNA group was lower than that in normal and negative groups. The survival rate declined while the apoptotic rate and necrotic rate increased inhPTTG1 siRNA group. Apoptotic index inhPTTG1 siRNA group was higher than that in normal and negative groups. The expression ofc-mycat mRNA and protein levels was down-regulated.CONCLUSIONCell proliferation is inhibited and cell apoptosis is induced byhPTTG1 siRNA through down-regulating the expression ofc-myc.hPTTG1 can be regarded as a candidate gene for ovarian cancer gene therapy.

    Genes,human pituitaty tumor-transforming; Ovarian neoplasms; Cell proliferation; Apoptosis;c-myc

    R737.31

    A

    10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.020

    1000-4718(2011)01-0102-06

    2010-08-16

    2010-11-04

    遼寧省教育廳科研項目(No.L2010681)

    △通訊作者 Tel:024-23256666-5494;E-mail:lj6152003@163.com

    猜你喜歡
    檢測
    QC 檢測
    “不等式”檢測題
    “一元一次不等式”檢測題
    “一元一次不等式組”檢測題
    “幾何圖形”檢測題
    “角”檢測題
    “有理數(shù)的乘除法”檢測題
    “有理數(shù)”檢測題
    “角”檢測題
    “幾何圖形”檢測題
    性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲国产精品专区欧美| 午夜视频国产福利| 亚洲图色成人| 一级二级三级毛片免费看| 精品人妻偷拍中文字幕| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲国产精品sss在线观看| 美女黄网站色视频| 久久久久久久午夜电影| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 能在线免费看毛片的网站| 国产亚洲精品久久久com| 国产亚洲av嫩草精品影院| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久久久网色| 日韩电影二区| 亚洲人成网站在线观看播放| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 成年免费大片在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 18禁动态无遮挡网站| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲精品456在线播放app| 一级av片app| 久久精品国产亚洲网站| 2022亚洲国产成人精品| 中文字幕久久专区| 国产在视频线在精品| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产 一区精品| 久久99热这里只有精品18| 亚洲精品色激情综合| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国精品久久久久久国模美| 久久久久九九精品影院| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 麻豆av噜噜一区二区三区| 中文字幕免费在线视频6| 99热这里只有是精品50| 天堂网av新在线| 国产老妇女一区| 婷婷六月久久综合丁香| 免费观看无遮挡的男女| 国产在线一区二区三区精| 久久久久国产网址| 亚洲综合色惰| 日韩亚洲欧美综合| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲av成人av| 精品人妻熟女av久视频| 久久久欧美国产精品| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲av一区综合| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品酒店卫生间| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 综合色av麻豆| 在线 av 中文字幕| 亚洲欧美成人精品一区二区| 男女啪啪激烈高潮av片| 综合色丁香网| 丝瓜视频免费看黄片| 白带黄色成豆腐渣| 爱豆传媒免费全集在线观看| 水蜜桃什么品种好| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 22中文网久久字幕| 综合色丁香网| 又爽又黄a免费视频| 国产高清不卡午夜福利| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲欧美清纯卡通| 日韩欧美一区视频在线观看 | 人妻系列 视频| 免费av观看视频| 看十八女毛片水多多多| 日日啪夜夜撸| freevideosex欧美| 夫妻性生交免费视频一级片| 精品久久久久久电影网| 国产成人精品婷婷| 免费大片18禁| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 国产老妇女一区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 2018国产大陆天天弄谢| 国产成人a∨麻豆精品| 日韩一区二区三区影片| 午夜精品一区二区三区免费看| 波野结衣二区三区在线| 看非洲黑人一级黄片| 激情 狠狠 欧美| 在线免费十八禁| 免费黄频网站在线观看国产| 日韩成人伦理影院| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲av不卡在线观看| 久久久欧美国产精品| 欧美精品一区二区大全| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产成人aa在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频 | 国产一区二区三区av在线| 国产成人福利小说| 亚洲四区av| 99热这里只有精品一区| 欧美人与善性xxx| 九草在线视频观看| 熟女电影av网| 国产一区二区三区av在线| 2018国产大陆天天弄谢| 性插视频无遮挡在线免费观看| 日韩一区二区三区影片| 联通29元200g的流量卡| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品一及| 综合色丁香网| 成年人午夜在线观看视频 | 伦理电影大哥的女人| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久久久久伊人网av| 嫩草影院精品99| 三级国产精品片| 国产成人精品福利久久| 国产一区亚洲一区在线观看| 三级国产精品片| 精品酒店卫生间| 色吧在线观看| 国产精品一区www在线观看| 中文资源天堂在线| 日日撸夜夜添| 免费黄色在线免费观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲国产精品专区欧美| 秋霞在线观看毛片| 日本熟妇午夜| 99久久精品热视频| 在线免费十八禁| 国产精品不卡视频一区二区| 成人国产麻豆网| 欧美成人一区二区免费高清观看| 天堂网av新在线| 午夜福利在线在线| 一区二区三区免费毛片| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲精品,欧美精品| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产高清国产精品国产三级 | 国产精品一区www在线观看| 亚洲无线观看免费| 久久久久久伊人网av| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美激情久久久久久爽电影| 一级a做视频免费观看| 国产视频内射| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 亚洲精品一二三| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲欧美清纯卡通| 日韩,欧美,国产一区二区三区| av免费在线看不卡| 国产亚洲一区二区精品| 大话2 男鬼变身卡| 两个人视频免费观看高清| 老女人水多毛片| 久久久午夜欧美精品| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 亚洲最大成人手机在线| www.av在线官网国产| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲,欧美,日韩| 99热网站在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 岛国毛片在线播放| or卡值多少钱| 亚洲在线观看片| 只有这里有精品99| 日韩欧美精品免费久久| 久久精品国产亚洲av涩爱| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 成年女人看的毛片在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲av国产av综合av卡| 精品久久久精品久久久| 欧美激情国产日韩精品一区| 一级a做视频免费观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 国内精品美女久久久久久| 深爱激情五月婷婷| 成年免费大片在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲精品日韩av片在线观看| 欧美性感艳星| 国内精品宾馆在线| 亚洲精品色激情综合| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产美女午夜福利| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日本免费在线观看一区| 色吧在线观看| 国产淫片久久久久久久久| 成年女人在线观看亚洲视频 | 在线观看人妻少妇| 97超碰精品成人国产| 一个人看的www免费观看视频| freevideosex欧美| 高清av免费在线| 国内精品宾馆在线| 久久久a久久爽久久v久久| 精品少妇黑人巨大在线播放| 男人舔奶头视频| 麻豆国产97在线/欧美| 一级毛片我不卡| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| av在线老鸭窝| 日日啪夜夜爽| 少妇的逼水好多| 日韩一本色道免费dvd| 在线观看一区二区三区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲熟女精品中文字幕| 大片免费播放器 马上看| 国产在视频线在精品| 寂寞人妻少妇视频99o| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲欧美清纯卡通| 超碰97精品在线观看| 国产成人一区二区在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 成年人午夜在线观看视频 | 国产高清三级在线| 免费大片黄手机在线观看| 色网站视频免费| 精品人妻视频免费看| 午夜激情久久久久久久| 国产成人a∨麻豆精品| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产探花在线观看一区二区| 在线观看av片永久免费下载| 综合色av麻豆| 女人被狂操c到高潮| 天天一区二区日本电影三级| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲天堂国产精品一区在线| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品久久视频播放| 日本一本二区三区精品| 永久网站在线| 有码 亚洲区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产成人freesex在线| 国产精品av视频在线免费观看| av在线播放精品| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 成人国产麻豆网| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产色爽女视频免费观看| 一区二区三区高清视频在线| 精品一区在线观看国产| 美女高潮的动态| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久久午夜欧美精品| a级毛片免费高清观看在线播放| 精品久久久久久久末码| 美女高潮的动态| 久久久欧美国产精品| 欧美日韩在线观看h| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 日本色播在线视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 成年av动漫网址| 亚洲成人av在线免费| 丰满人妻一区二区三区视频av| av女优亚洲男人天堂| 波多野结衣巨乳人妻| 免费观看a级毛片全部| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 久久6这里有精品| 国产综合懂色| 成人毛片a级毛片在线播放| 综合色av麻豆| 午夜精品国产一区二区电影 | 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 男女下面进入的视频免费午夜| 免费观看的影片在线观看| 久久久精品免费免费高清| 婷婷色综合大香蕉| 最近手机中文字幕大全| 看黄色毛片网站| 又大又黄又爽视频免费| 我要看日韩黄色一级片| 一级a做视频免费观看| 午夜福利成人在线免费观看| 色网站视频免费| 欧美性感艳星| 老女人水多毛片| 国产不卡一卡二| 99久国产av精品国产电影| 波多野结衣巨乳人妻| 免费观看a级毛片全部| 国产片特级美女逼逼视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲自偷自拍三级| 中文字幕制服av| 亚洲精品自拍成人| 国精品久久久久久国模美| 成人综合一区亚洲| 神马国产精品三级电影在线观看| 一夜夜www| 极品少妇高潮喷水抽搐| av在线蜜桃| 综合色av麻豆| 别揉我奶头 嗯啊视频| 黄色日韩在线| 成人综合一区亚洲| 看十八女毛片水多多多| 又大又黄又爽视频免费| 男女视频在线观看网站免费| 99久国产av精品| 欧美xxⅹ黑人| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| av黄色大香蕉| 亚洲av国产av综合av卡| 久久韩国三级中文字幕| 午夜精品一区二区三区免费看| 街头女战士在线观看网站| 一本久久精品| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲av成人精品一二三区| 国产淫片久久久久久久久| 看免费成人av毛片| 国产亚洲91精品色在线| 国产v大片淫在线免费观看| 国产有黄有色有爽视频| 国产亚洲精品av在线| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品一区www在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 天堂网av新在线| 中文欧美无线码| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日本-黄色视频高清免费观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日日啪夜夜撸| 午夜免费激情av| kizo精华| 亚洲av免费在线观看| 如何舔出高潮| 亚洲av日韩在线播放| 成人午夜高清在线视频| 赤兔流量卡办理| 一级毛片 在线播放| 如何舔出高潮| 日韩人妻高清精品专区| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲在久久综合| 嫩草影院精品99| 联通29元200g的流量卡| 精品国产三级普通话版| 国产乱来视频区| 夫妻性生交免费视频一级片| av一本久久久久| 99久久人妻综合| 午夜日本视频在线| 日韩欧美精品免费久久| av在线亚洲专区| 高清av免费在线| 久久精品国产亚洲av天美| 国产极品天堂在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产精品.久久久| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产淫语在线视频| 亚洲美女视频黄频| 超碰97精品在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 女人久久www免费人成看片| 欧美一区二区亚洲| 中文字幕av在线有码专区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日韩av不卡免费在线播放| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 人人妻人人看人人澡| 七月丁香在线播放| 日本黄色片子视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 精品久久久久久久末码| 国产午夜精品论理片| 在线免费观看的www视频| 免费看av在线观看网站| 成人毛片60女人毛片免费| 嫩草影院入口| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲图色成人| 91av网一区二区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产午夜福利久久久久久| 国产成人a∨麻豆精品| 伦精品一区二区三区| 亚洲国产欧美人成| 最近最新中文字幕大全电影3| eeuss影院久久| 久久久久性生活片| 国产免费福利视频在线观看| 久久午夜福利片| 免费看光身美女| 久久久精品欧美日韩精品| 国产成人精品一,二区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 91久久精品国产一区二区成人| 大香蕉97超碰在线| 久久精品夜色国产| 在线a可以看的网站| av一本久久久久| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久久成人免费电影| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 黄色日韩在线| 久久99热这里只频精品6学生| 日韩欧美一区视频在线观看 | 午夜精品在线福利| 亚洲成色77777| 久久97久久精品| 高清视频免费观看一区二区 | a级一级毛片免费在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲图色成人| 久久久成人免费电影| 中文字幕久久专区| 亚洲av一区综合| 亚洲经典国产精华液单| 麻豆成人午夜福利视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 欧美丝袜亚洲另类| 日韩中字成人| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲欧洲日产国产| 看免费成人av毛片| 亚洲最大成人手机在线| 免费看a级黄色片| 欧美成人午夜免费资源| 2018国产大陆天天弄谢| 国产成人freesex在线| 午夜老司机福利剧场| 欧美精品一区二区大全| 国产精品久久久久久久久免| 美女国产视频在线观看| 午夜视频国产福利| 色播亚洲综合网| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 国产欧美日韩精品一区二区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 免费黄色在线免费观看| 少妇高潮的动态图| freevideosex欧美| 亚洲国产色片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 天天躁日日操中文字幕| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产精品久久久久久精品电影| 99热6这里只有精品| 亚洲电影在线观看av| 免费观看无遮挡的男女| 尾随美女入室| 我要看日韩黄色一级片| 中文字幕av在线有码专区| 久久久久久久午夜电影| 可以在线观看毛片的网站| 2018国产大陆天天弄谢| 夜夜爽夜夜爽视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲av男天堂| 日韩欧美国产在线观看| 久久精品国产自在天天线| 欧美成人精品欧美一级黄| 日本色播在线视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产成人精品久久久久久| 日韩亚洲欧美综合| 人妻夜夜爽99麻豆av| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲精品视频女| 秋霞在线观看毛片| 亚洲欧美精品专区久久| 国产单亲对白刺激| 亚洲精品成人久久久久久| 久久人人爽人人爽人人片va| 熟妇人妻不卡中文字幕| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产中年淑女户外野战色| 日韩欧美 国产精品| 少妇熟女欧美另类| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲综合色惰| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚州av有码| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 97在线视频观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 色综合站精品国产| 欧美日本视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲成人av在线免费| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日本免费在线观看一区| 久久久色成人| 日韩欧美 国产精品| 国产麻豆成人av免费视频| freevideosex欧美| 女人被狂操c到高潮| 欧美bdsm另类| 亚洲av在线观看美女高潮| 一级毛片 在线播放| 成人综合一区亚洲| 色哟哟·www| 欧美高清成人免费视频www| 天美传媒精品一区二区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| av卡一久久| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 午夜免费激情av| 两个人的视频大全免费| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 久久久午夜欧美精品| 久热久热在线精品观看| 亚洲怡红院男人天堂| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日本免费a在线| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 亚洲精品aⅴ在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产高清不卡午夜福利| 国产乱来视频区| 精品午夜福利在线看| 精品酒店卫生间| 一级黄片播放器| 亚洲av免费在线观看| 岛国毛片在线播放| 一级黄片播放器| 亚洲精品色激情综合| 岛国毛片在线播放| 少妇熟女欧美另类| 国产精品人妻久久久影院| 欧美不卡视频在线免费观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲在久久综合| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 久久久久久久久大av| 伦精品一区二区三区| 简卡轻食公司| 日日撸夜夜添| 看免费成人av毛片| 久久人人爽人人片av| 国产精品一区二区三区四区久久| 看免费成人av毛片| 一级黄片播放器| 亚洲av福利一区| 波野结衣二区三区在线| 超碰97精品在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 99久国产av精品| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产午夜福利久久久久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲国产精品国产精品| 日本av手机在线免费观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲av免费在线观看|