廣東人群PVRL1的多態(tài)性與NSCL/P的相關(guān)性分析*

舒申友， 程紅球， 唐世杰， 陳偉練， 吳燊榮

(汕頭大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院唇腭裂治療中心， 廣東 汕頭 515041)

廣東人群PVRL1的多態(tài)性與NSCL/P的相關(guān)性分析*

舒申友△， 程紅球， 唐世杰， 陳偉練， 吳燊榮

(汕頭大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院唇腭裂治療中心， 廣東 汕頭 515041)

目的探討脊髓灰質(zhì)炎病毒受體相關(guān)基因(PVRL1)的多態(tài)性與廣東人群中非綜合征型唇腭裂(NSCL/P，MIM 119530)的相關(guān)性。方法應用聚合酶鏈式反應和直接測序的方法對71例廣東人群NSCL/P患者和100個健康志愿者的PVRL1 exon 2和exon 5的多態(tài)性進行檢測；應用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析的方法對100例廣東人群NSCL/P患者和100個健康志愿者的PVRL1 α亞型的334、391、1 183位點和β亞型的1082位點進行突變檢測。結(jié)果PVRL1的exon 2和exon 5未發(fā)現(xiàn)有突變位點；質(zhì)譜分析沒有發(fā)現(xiàn)PVRL1 α亞型的334、391、1 183位點和β亞型的1 082位點相關(guān)的S112A、T131A、G361V、V395M突變。結(jié)論PVRL1的exon 2、exon 5，α亞型334T>A、391A>T、1 183G>A，及β亞型1 082G>T的突變并不參與所研究的廣東人群非綜合征型唇腭裂的發(fā)生。

非綜合征型唇腭裂； 脊髓灰質(zhì)炎病毒受體相關(guān)基因； 多態(tài)性

非綜合征型唇腭裂(non-syndromic cleft lip and/or palate，NSCL/P)的發(fā)生占唇腭裂發(fā)生率的70%以上，它的病因包括了環(huán)境因素和遺傳因素，尚未發(fā)現(xiàn)單獨的一種因素可以引發(fā)非綜合征型唇腭裂[1]。研究表明，一些與綜合征型唇腭裂發(fā)病相關(guān)的基因也與NSCL/P的發(fā)生相關(guān)，如IRF6(interferon regulatory factor 6)、MSX1(muscle segment homeobox gene 1)、TBX22(T-box transcription factor 22)和脊髓灰質(zhì)炎病毒受體相關(guān)基因(poliovirus receptor-like 1，PVRL1)[2-5]。PVRL1蛋白是黏附素中的一員，是一種擁有免疫球蛋白樣細胞外區(qū)域結(jié)構(gòu)的受體樣蛋白，它的主要作用是協(xié)同鈣黏素調(diào)整上皮黏著連接形成的速度，并影響上皮細胞之間緊密連接的形成[6]，與外胚層發(fā)育不良綜合征(cleft lip and palate/ectodermal dysplasia 1,CLPED 1，OMIM 225000)顯著相關(guān)[7]。PVRL1有α、β和γ3種亞型。

本研究采用聚合酶鏈式反應和直接測序的方法對廣東人群的PVRL1 exon 2和exon 5的多態(tài)性進行檢測，及采用引物單堿基延伸與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜的方法在廣東人群中對亞洲地區(qū)報道過的α亞型的334、391、1 183位點和β亞型的1 082位點進行檢測，探討這個基因及相關(guān)突變位點與廣東人群NSCL/P的相關(guān)性。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑 實驗采用大連寶生物公司生產(chǎn)的全血基因組DNA提取試劑盒D9081和北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的血液基因組提取試劑盒DP318-03來提取血樣基因組DNA。PCR引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，PCR反應物購自大連寶生物公司生產(chǎn)的TaKaRa Ex TaqTM。

1.2病人資料 抽取2009年2月至2009年10月在我科住院治療的171個唇腭裂病人和100個健康志愿者的靜脈全血200 μL，血樣用2%EDTA抗凝凍存管-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，分組情況見表1。所有納入研究的唇腭裂病人及健康志愿者均已簽署唇腭裂易感基因研究知情同意書，納入研究的病人由我中心的唇腭裂治療醫(yī)師和汕頭大學醫(yī)學院遺傳學專家診斷為非綜合征型唇腭裂(生長發(fā)育正常，沒有其它明顯的畸形，沒有視覺和聽覺上的障礙)。

表1 標本分組

2方法

實驗分成2組，測序組包括71個患者和100個健康志愿者，進行PVRL1的exon 2和exon 5的測序；質(zhì)譜分析組包括100個患者和100個健康志愿者，進行飛行時間質(zhì)譜分析檢測α亞型的334、391、1 183位點和β亞型的1 082位點。100個健康志愿者的血樣基因組DNA分成2份分別作為2組實驗的對照組。

2.1測序組

① 基因組DNA的提取 采用TaKaRa公司生產(chǎn)的全血基因組DNA提取試劑盒D9081(大連寶生物公司)提取病人血樣的基因組DNA，提取的基因組DNA溶于TE液(pH8.0)-20 ℃保存。

② PCR擴增 PCR擴增PVRL1的exon 2 和exon 5，引物根據(jù)NCBI基因庫中公布的PVRL1基因序列，通過Premier 5.0 軟件設計，由上海生工生物技術(shù)公司合成，引物見表2。PCR反應物用TaKaRa Ex TaqTM(大連寶生物公司)，每個反應管加入TaKaRa Ex Taq(5×106U/L)0.25 μL，10×Ex Taq buffer(Mg2+free)5 μL，MgCl2(25 mmol/L)4 μL，dNTP mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，基因組DNA 0.5 μg，上游引物(20μmol/L)1 μL，下游引物(20 μmol/L)1 μL，加蒸餾水至總體積50 μL。Exon 2 的反應條件：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35個循環(huán)。Exon 5 反應條件：94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35個循環(huán)。反應由MiniCyclerTM(MJ Research)儀器完成。取PCR產(chǎn)物5 μL行3%瓊脂糖凝膠電泳，以DNA marker DL500(寶生物公司)為對照，電泳圖見圖1、2。

表2 用于測序的PVRL1聚合酶鏈反應引物

③ DNA序列檢測 將71管PCR產(chǎn)物原液送公司測序(上海英駿生物技術(shù)有限公司，廣州測序部)。用 Chromas 軟件對測序鋒圖進行分析，DNASTAR軟件將測得的序列與對照組的序列相比對。

2.2質(zhì)譜分析組

① 基因組DNA的提取 采用血液基因組提取試劑盒DP318-03(北京天根生化科技有限公司)提取病人血樣的基因組DNA，紫外分光光度檢測A260/A280在1.6-1.9之間，提取的基因組DNA在-20℃冰箱保存。

② 質(zhì)譜分析 100個樣本基因組DNA送公司(上海邃志生物科技有限公司)行飛行時間質(zhì)譜分析檢測，進行SNP分型，該技術(shù)將引物單堿基延伸與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析的方法結(jié)合起來，利用MassARRAY系統(tǒng)(Sequenom)完成高通量檢測，其反應體系為非雜交依賴性，不存在潛在的雜交錯配干擾，也不需要引入各種標記物，準確度高。

Figure 1. The agarose electrophoretogram of exon 2 by PCR. M0: marker; M1-3: exon 2 PCR products(441 bp).

圖1Exon2PCR反應液電泳圖

Figure 2. The agarose electrophoretogram of exon 5 by PCR. M0: marker; M1-2: exon 5 PCR products(210 bp).

圖2Exon5PCR反應液電泳圖

表3 用于質(zhì)譜分析的PVRL1聚合酶鏈反應引物

PCR反應條件：94 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共45個循環(huán)；最后72 ℃ 3 min。PCR引物見表3。擴增特異DNA片段后，剩余的dNTP用磷酸消化掉，反應體系包括1.53 μL 水、0.17 μL SAP緩沖液、0.3單位堿性磷酸酶(Sequenom)。該反應先37 ℃ 40 min，然后85 ℃ 5 min使酶失活。堿性磷酸酶處理后，取該位點前20-25個堿基序列為引物，針對SNP的單堿基延伸引物在下列反應體系中進行：10X iPLEX緩沖液0.2 μL，iPLEX酶 (Sequenom) 0.041 μL，延伸引物(10 μmol/L)0.804 μL，終止混合物0.2 μL，加水至總體積2 μL，單堿基延伸反應在下列條件下進行：94 ℃ 30 s； 94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s 5個循環(huán)，共40個循環(huán)，最后72 ℃ 3 min，在終止反應物中加入6 mg陽離子交換樹脂(Sequenom)脫鹽，混合后加入25 μL水懸浮。使用MassARRAY Nanodispenser (Sequenom) 將最終的分型產(chǎn)物點樣到一塊384 孔的spectroCHIP (Sequenom)上，MALDI-TOF質(zhì)譜進行分析。檢測結(jié)果與對照組的序列及亞洲地區(qū)報道的相關(guān)位點數(shù)據(jù)相比對。

2.3對照組 采用與實驗組A組相同的DNA提取方法及PCR擴增方法，將100管PCR產(chǎn)物原液送公司測序(上海英駿公司)，將100份基因組DNA送公司(上海邃志生物科技有限公司)行飛行時間質(zhì)譜分析檢測，進行SNP分型，方法同上。

結(jié) 果

1測序組

Chromas 軟件對測序鋒圖進行分析，DNASTAR軟件將測得的A組序列與對照組序列相比對，未發(fā)現(xiàn)有PVRL1 exon 2和exon 5的相關(guān)突變位點,見圖3-5。

Figure 3. No mutation of GGT>GGTT at exon 5.

圖3Exon5中沒有發(fā)現(xiàn)GGT>GGTT的突變

Figure 4. No mutation of S112T(TCC>ACC) at exon 2.

圖4Exon2中沒有發(fā)現(xiàn)S112T(TCC>ACC)的突變

Figure 5. No mutation of T131A(ACG>GCG) at exon 2.

圖5Exon2中沒有發(fā)現(xiàn)T131A(ACG>GCG)的突變

2質(zhì)譜分析組

MALDI-TOF質(zhì)譜分析結(jié)果顯示相應的α亞型的334、391、1 183位點和β亞型的1 082位點分型情況，相關(guān)數(shù)據(jù)見表4，與對照組序列相比對，及與國外報道的突變位點相比對，并無國外報道的陽性突變。質(zhì)譜分析圖見圖6-9。

表4 SNP分型結(jié)果

Figure 6. No mutation of T>A at position 112 of α subtype.

圖6α亞型112位氨基酸無T>A的突變

Figure 7. No mutation of A>G at position 131 of α subtype.

圖7α亞型131位氨基酸無A>G的突變

Figure 8. No mutation of G>A at position 361 of β subtype.

圖8β亞型361位氨基酸無G>A的突變

Figure 9. No mutation of G>A at position 395 of α subtype.

圖9α亞型395位氨基酸無G>A的突變

討 論

本研究在前人工作的基礎(chǔ)上，致力于尋找和驗證PVRL1基因相關(guān)區(qū)域的突變情況與廣東人群NSCL/P的相互關(guān)系。

唇腭裂是常見的先天性疾病之一，國外唇腭裂的發(fā)病率為0.4‰-2.0‰[8]，亞洲(2.6‰)和美洲(3.6‰)發(fā)病率較高，歐洲居中，非洲最低。我國南方統(tǒng)計的發(fā)病率約為1.25‰[9]。NSCL/P占唇腭裂發(fā)病人數(shù)的70%以上，其病因?qū)W至今沒有定論，現(xiàn)普遍認為是多基因與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。

PVRL1位于11號染色體q23.2區(qū)域，是免疫球蛋白超家族中的一員，編碼細胞-細胞黏附受體，對上皮黏附的發(fā)生和維持起重要作用。Suzuki等[10]在CLPED 1的患者中發(fā)現(xiàn)了PVRL1編碼的185(TGG→T-G)和323(GGT→GGTT)位氨基酸的突變，此后，他們在北部委內(nèi)瑞拉NSCL/P患者中也發(fā)現(xiàn)了編碼185(TGG→T-G)位氨基酸的突變，這種無意義突變株的雜合頻率顯著高于正常人(P<0.01)[6]，導致PVRL1編碼的肽鏈長度縮短。

目前PVRL1的研究工作大都是其與NSCL/P的相關(guān)性，包括了基因與環(huán)境相互作用、基因與基因相互作用等。Scapoli等[11,12]在意大利人群中沒有發(fā)現(xiàn)W185X的突變，但是他們發(fā)現(xiàn)了R199Q、R210H、 R212H的突變，正常人這3個氨基酸均為保守序列，Avila等[13]在挪威、菲律賓、南美人群中共發(fā)現(xiàn)了23個與NSCL/P相關(guān)的突變位點，其中11個突變位點位于編碼區(qū)，7個突變位點位于內(nèi)含子，另外7個突變位點位于CpG島。Turhani等[14]在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)CLPTM1基因的內(nèi)含子 IVS7-10G/A、外顯子Gly331Gly、Ala88Ala 和Pro309Pro的突變聯(lián)合PVRL1 基因的Glu441-Gly442插入Glu 突變同時發(fā)生的話可能是NSCL/P的遺傳因素。

亞洲人群報道的關(guān)于PVRL1的突變位點較少，亞洲地區(qū)關(guān)于PVRL1基因的研究見表4，中國大陸對PVRL1的研究尚少。Marazita等[15]提出大部分在歐美國家報道過的有陽性結(jié)果的基因區(qū)域在中國人群中并沒有呈現(xiàn)同樣的結(jié)果。因此本研究的另一個內(nèi)容是在廣東人群中檢測僅在亞洲人群中報道過的突變位點。Tongkobpetch等[16]在泰國NSCL/P患者中發(fā)現(xiàn)了V395M的突變，Avila等[13]在菲律賓NSCL/P患者中發(fā)現(xiàn)S112T、T131A、G361V的突變，而中國臺灣(exon 2和exon 5)、大陸江浙地區(qū)(exon3)和日本(9個SNP位點)的研究并沒有發(fā)現(xiàn)有意義的結(jié)果。S112T和T131A均出現(xiàn)在PVRL1 V區(qū)關(guān)鍵氨基酸附近，這個區(qū)域之前已經(jīng)證明是介導細胞-細胞黏附和細胞-病毒黏附的區(qū)域[19]，而G361V出現(xiàn)在跨膜區(qū)，被認為可能影響PVRL1的結(jié)構(gòu)，V395M則編碼膜內(nèi)區(qū)域蛋白。

表5 亞洲地區(qū)PVRL1基因研究結(jié)果

為了擴大研究PVRL1突變情況與中國大陸NSCL/P患者的相關(guān)性，本文將171個廣東人群NSCL/P 患者分成兩組，一組71人，對PVRL1的exon 2和exon 5進行PCR和直接測序檢測突變，另外一組100人，其中有38人有唇腭裂家族史，通過飛行時間質(zhì)譜分析的方法對亞洲人群報道過的突變位點S112T、T131A、G361V、V395M進行檢測，結(jié)果與100個對照組志愿者相比對，均沒有發(fā)現(xiàn)突變。這一結(jié)果與國外的研究結(jié)果不盡相同，但與中國臺灣和中國大陸江浙一帶的相關(guān)研究結(jié)果相符合，因此PVRL1的exon 2和exon 5，及相應的編碼112位、131位、361位、395位氨基酸的突變可能跟中國人群無關(guān)。

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RelationshipbetweenPVRL1genepolymorphismsandnon-syndromiccleftlipwithorwithoutcleftpalateinGuangdongpatients

SHU Shen-you, CHENG Hong-qiu, TANG Shi-jie, CHEN Wei-lian, WU Shen-rong

(CleftLipandPalateTreatmentCenter,TheSecondAffiliatedHospitalofShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,China.E-mail:shengyoushu2004@163.com)

AIM: To explore the relationship between non-syndromic cleft lip and/or palate (NSCL/P, MIM 119530) and the polymorphisms of poliovirus receptor-like 1 (PVRL1) in Guangdong patients.METHODSThe polymorphisms ofPVRL1 in exon 2 and exon 5 were detected using the techniques of polymerase chain reaction and direct sequencing in 71 NSCL/P patients and 100 volunteers in Guangdong province. Amino acid mutations were detected at alpha spliced transcript codons 112, 131, 395 and beta spliced transcript codon 361 using the technique of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry analysis in 100 NSCL/P patients and 100 volunteers in this region.RESULTSNeither mutations in thePVRL1 exon 2 and exon 5 in 71 NSCL/P patients and 100 volunteers were found, nor mutations of alpha spliced transcript codons 112, 131, 395 and beta spliced transcript codon 361 were detected for any of the 100 NSCL/P patients and 100 volunteers.CONCLUSIONMutations ofPVRL1exon 2 and exon 5, and mutations of alpha spliced transcript 334 T>A, 391 A>T, 1 183G>A and beta spliced transcript 1 082 G>T don’t participate in the formation of NSCL/P within the Guangdong patients examined.

Non-syndromic cleft lip/palate; Poliovirus receptor-related gene; Polymorphism

R782

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.017

1000-4718(2011)01-0086-06

2010-03-22

2010-05-17

廣東省自然科學基金資助項目(No.9151503104000001)

△通訊作者 Tel：0754-88915876； E-mail：shengyoushu2004@163.com