C反應(yīng)蛋白對人外周血CD14+單核細(xì)胞TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響*

彭 隆， 羅艷婷， 劉金來

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510630)

C反應(yīng)蛋白對人外周血CD14+單核細(xì)胞TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響*

彭 隆， 羅艷婷， 劉金來△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510630)

目的觀察C反應(yīng)蛋白(CRP)對CD14+單核細(xì)胞Toll樣受體4(TLR4)表達(dá)的影響，以探討CRP在急性冠脈綜合征(ACS)致炎機(jī)制中的作用。方法不同濃度(5、25、50、100 mg/L)和不同作用時間(6、12、24、48 h)的CRP刺激正常人外周血CD14+單核細(xì)胞，或者不同濃度TLR4抑制劑預(yù)先干預(yù)CD14+單核細(xì)胞后，再給予CRP刺激。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面TLR4蛋白的表達(dá)，定量PCR方法檢測TLR4 mRNA和髓樣分化蛋白2(MD-2)mRNA表達(dá)，ELISA檢測刺激前后細(xì)胞上清液腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、金屬蛋白酶9(MMP-9)水平。結(jié)果CRP可劑量依賴和時間依賴地增加CD14+單核細(xì)胞表達(dá)TLR4和MD-2，高濃度TLR4抑制劑可完全阻斷CRP對TLR4、MD-2的影響。TNF-α、IL-6、MMP-9與TLR4、MD-2也呈現(xiàn)相同的變化。結(jié)論CRP可激活正常人CD14+單核細(xì)胞TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α、IL-6、MMP-9，提示CRP可作為病原相關(guān)分子模式(PAMP)，通過TLR4模式受體介導(dǎo)而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，參與動脈粥樣硬化形成，促進(jìn)ACS炎癥的發(fā)展。

C-反應(yīng)蛋白質(zhì)； 受體，Toll樣； 單核細(xì)胞； 急性冠脈綜合征

研究表明C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)不但是機(jī)體的一種炎癥標(biāo)志物，同時還參與了炎癥反應(yīng)。大量證據(jù)顯示，CRP參與了動脈粥樣硬化的形成，與急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS)關(guān)系密切，是心血管事件強有力的預(yù)測因子[1]。CRP在粥樣斑塊區(qū)聚集，誘導(dǎo)炎癥因子、金屬蛋白酶及組織因子的表達(dá)[2, 3]，導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定[4]。但目前尚不清楚CRP是怎樣在易損斑塊及斑塊破裂的炎癥機(jī)制起作用。Toll樣受體是一類介導(dǎo)天然免疫，識別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP)的信號傳遞受體家族，在免疫防御反應(yīng)中起著重要的作用。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)是機(jī)體識別細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[5]，能激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)、活化蛋白1(activating protein 1,AP-1)，引起炎癥因子的大量釋放，存在于內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及心肌細(xì)胞中。多項研究證明：TLR4在動脈粥樣硬化斑塊中高表達(dá)，參與其炎癥的發(fā)生與發(fā)展。本文主要探討CRP是否作為一種PAMP通過TLR4模式受體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與動脈粥樣硬化斑塊炎癥的發(fā)生發(fā)展。

材 料 和 方 法

1材料

CRP購自Calbiochem；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)購自Sigma；藻紅蛋白(phycoerythrin，PE) mouse IgG2a K isotype control、PE anti-human Toll-like receptor 4 (CD284)和藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin,APC) anti-human CD14均購于eBioscience；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Fermentas；熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa；胎牛血清來自Hyclone、RPMI-1640培養(yǎng)基購于Gibco；Trizol試劑為Invitrogen產(chǎn)品；淋巴細(xì)胞分離液來自GE Healthcare；ELISA試劑盒為R&D產(chǎn)品。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 收集健康志愿者外周靜脈血，用PBS緩沖液1∶1稀釋。用尖頭吸輕鋪于比重1.077淋巴細(xì)胞分離液表面，稀釋血與淋巴細(xì)胞分離液體積比為1∶1，形成清晰界面。2 000 r/min離心20 min，用吸管輕輕將處于分層液面白膜狀的單個核細(xì)胞吸入另一管內(nèi)，PBS清洗2次。將細(xì)胞重懸于RPMI-1640培養(yǎng)基 (含25 mmol/L HEPES、1 nmol/L谷氨酰胺、10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)。臺盼藍(lán)拒染實驗發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞>95%。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿24 h后，第2 d用培養(yǎng)基輕輕清洗2次，將未貼壁細(xì)胞洗脫，用0.5%的胰酶消化貼壁細(xì)胞，以FITC-反義-人-CD14標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測鑒定單核細(xì)胞陽性率約80%。調(diào)整細(xì)胞密度為1×109cells/L，并接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 mL。

2.2細(xì)胞分組處理 實驗分為3組進(jìn)行。CRP量效組：將CRP 5、25、50、100 mg/L，分別與CD14+單核細(xì)胞孵育24 h，空白對照不加任何試劑，陽性對照加入LPS 10 mg/L。CRP時效組：將CRP 50 mg/L分別與CD14+單核細(xì)胞孵育6、12、24、48 h。TLR4阻斷劑干預(yù)組：將PE anti-human TLR4配成5 mg/L、20 mg/L和30 mg/L 3個濃度分別與CD14+單核細(xì)胞孵育2 h，再加入CRP 50 mg/L孵育24 h。

2.3流式細(xì)胞儀檢測CD14+單核細(xì)胞上TLR4蛋白表達(dá) 收集不同處理的單核細(xì)胞400 μL，PBS緩沖液沖洗2次，加APC anti-human CD14 20μL及PE anti-human Toll-like receptor 4 20 μL，室溫避光孵育15 min，PBS緩沖液沖洗2次后，500 μL PBS緩沖液重懸，移入測定管。陰性對照標(biāo)本不加以上單克隆抗體，而加入PE mouse IgG2a K isotype control。流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞10 000個，檢測TLR4蛋白表達(dá)的陽性率。

2.4RT-PCR測定CD14+單核細(xì)胞TLR4 mRNA及髓樣分化蛋白2(myeloid differentiation protein 2,MD-2) mRNA的表達(dá) 分別收集每孔細(xì)胞，1 500 r/min離心10 min，去上清。每管加入1 mL Trizol，按照 Trizol說明書提取各組細(xì)胞的總 RNA后，1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定 RNA的完整性，微量分光光度計檢測 RNA的純度及含量，而后在 37 ℃、Olig (dt) 作為引物，將 RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA, cDNA逆轉(zhuǎn)錄按試劑盒說明書進(jìn)行。PCR引物設(shè)計參考文獻(xiàn)，由上海英駿公司合成。TLR4正義序列為5’-AGATGGGGCATATCAGAGC3’，反義序列為5’-CCAGAACCAAACGATGGAC-3’，產(chǎn)物長度500 bp；MD-2正義序列為5’-ATTGGGTCTGCAACTCATCC-3’，反義序列為5’-ATTGGGTCTGCAACTCATCC-3’，產(chǎn)物長度234 bp；內(nèi)參照β-actin正義序列為5’-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3’，反義序列為5’-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3’，產(chǎn)物長度359 bp。

PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 45 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共 35個循環(huán)，最后72 ℃10 min。產(chǎn)物用2%的瓊脂糖膠進(jìn)行檢測。用數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)作條帶密度掃描，結(jié)果以目的條帶與對應(yīng)的β-actin吸光度值表示。

2.5熒光定量PCR 用上述逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，使用SYBR?Green I嵌合熒光法，按試劑盒進(jìn)行操作。95 ℃ 30 s 預(yù)變性后， 95 ℃ 30 s， 60 ℃ 31 s， 40個循環(huán)，最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s溶解。根據(jù)2-△△Ct值計算mRNA表達(dá)的相對量。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參照，正義鏈為5’-AGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAAA-3’，反義鏈為5’-CATATTGGAACATGTAAACCATGTAGTTG-3’，產(chǎn)物大小91 bp。

2.6ELISA檢測 細(xì)胞經(jīng)分組處理培養(yǎng)后收集上清液，步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行，分別檢測細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素 6(interleuki 6,IL-6)、金屬蛋白酶 9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)水平。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1CRP誘導(dǎo)人外周血CD14+單核細(xì)胞TLR4蛋白的表達(dá)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD14+單核細(xì)胞經(jīng)不同濃度、不同時間的CRP刺激后細(xì)胞表面TLR4表達(dá)變化。CD14+單核細(xì)胞在CRP濃度為5、25、50、100 mg/L培養(yǎng)24 h，細(xì)胞表面TLR4蛋白表達(dá)分別為(32.22±2.80)%、(49.94±5.58)%、(74.82±3.24)%和(90.82±2.88)%。當(dāng)細(xì)胞在5 mg/L CRP培養(yǎng)24 h后，TLR4陽性細(xì)胞數(shù)開始增加，隨著CRP濃度的增加，TLR4陽性細(xì)胞呈現(xiàn)增長趨勢，并在CRP 100 mg/L時，TLR4陽性細(xì)胞百分比達(dá)到高峰。陽性對照組LPS 10 mg/L組為(98.91±0.74)%，P<0.01，見圖1。當(dāng)單核細(xì)胞在CRP 50 mg/L刺激下，隨著孵育時間的增加， TLR4陽性細(xì)胞百分比逐漸增加，24 h時TLR4表達(dá)達(dá)高峰[(81.71±2.92)%]后，TLR4表達(dá)緩慢下降，48 h時TLR4陽性細(xì)胞百分比為(50.57±3.34)%，P<0.01，見圖2。

圖1不同劑量CRP對CD14+單核細(xì)胞表達(dá)TLR4蛋白的影響

圖250mg/LCRP不同時間刺激CD14+單核細(xì)胞后TLR4的表達(dá)

2CRP對外周血CD14+單核細(xì)胞TLR4及MD-2mRNA表達(dá)的影響

采用熒光定量PCR技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)TLR4和MD-2 mRNA表達(dá)，經(jīng)過GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化后，單核細(xì)胞分別在CRP濃度為5、25、50、100 mg/L培養(yǎng)24 h，TLR4 mRNA表達(dá)增加達(dá)159%、211%、320%和390%，MD-2 mRNA表達(dá)增加達(dá)146%、236%、311%和416%。單核細(xì)胞在CRP 50 mg/L培養(yǎng)6、12、24、48h，TLR4 mRNA表達(dá)增加162%、264%、354%和208%，MD-2 mRNA表達(dá)增長147%、241%、311%和190%。TLR4及MD-2 mRNA在CRP 50 mg/L孵育24 h時達(dá)高峰，之后逐漸降低,P<0.01，見圖3、4。

圖3不同劑量CRP對CD14+單核細(xì)胞表達(dá)TLR4及MD-2mRNA的影響

圖4不同時間CRP對CD14+單核細(xì)胞表達(dá)TLR4及MD-2mRNA的影響

3細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、MMP-9的變化

ELISA法測定不同濃度CRP刺激CD14+單核細(xì)胞后TNF-α、IL-6和MMP-9的結(jié)果見表1。隨著CRP濃度的增加，單核細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6和MMP-9含量逐漸增加，當(dāng)CRP 100 mg/L時，TNF-α、IL-6和MMP-9含量均較空白對照組升高，差異顯著(P<0.01)；而作為陽性對照組，單核細(xì)胞經(jīng)LPS 10 mg/L刺激后，TNF-α、IL-6和MMP-9含量分別增加10.1倍、31.5倍和5.1倍，見表1。

觀察50 mg/L CRP通過不同時間刺激CD14+單核細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：IL-6、TNF-α和MMP-9表達(dá)量均受CRP孵育時間延長而增加，IL-6于48 h達(dá)峰值；而 TNF-α和MMP-9峰值出現(xiàn)在24 h，較空白對照組分別增加8.1倍和2.8倍，然而繼續(xù)孵育至48 h時，兩者表達(dá)有所下降，見表2。

為了解CRP刺激TNF-α、IL-6和MMP-9表達(dá)是否受TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，采用不同濃度TLR4抑制劑與50 mg/L CRP共孵育CD14+單核細(xì)胞。與50 mg/L CRP刺激而未加TLR4抑制劑的單核細(xì)胞相比，當(dāng)TLR4抑制劑濃度為20 mg/L時，單核細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6和MMP-9開始顯著減少(均P<0.01)；當(dāng)TLR4抑制劑濃度為30 mg/L時，TNF-α、IL-6和MMP-9含量分別減少88.9%、89.1%和74.4%，見表3。

表1 不同濃度CRP刺激CD14+單核細(xì)胞后TNF-α、IL-6和MMP-9的變化

**P<0.01vscontrol.

表250mg/LCRP不同時間刺激CD14+單核細(xì)胞后TNF-α、IL-6和MMP-9的變化

CRP50mg/L0h6h12h24h48hTNF-α(ng/L)12.8±2.432.6±3.3**60.5±0.9**98.3±8.3**86.5±2.9**IL-6(ng/L)107.4±30.0172.0±45.4**312.0±32.7**511.3±76.2**511.8±46.5**MMP-9(μg/L)141±12193±12314±14**406±30**360±18**

**P<0.01vs0 h.

表3TLR4抑制劑對50mg/LCRP刺激CD14+單核細(xì)胞后TNF-α、IL-6和MMP-9的影響

TLR4inhibitor(mg/L)052030TNF-α(ng/L)96.1±6.080.5±7.933.9±3.2**10.6±2.7**IL-6(ng/L)537.6±26.2433.8±18.2173.8±59.6**58.5±25.0**MMP-9(μg/L)466±45362±28210±23**119±38**

**P<0.01vs0 mg/L TLR4 inhibitor.

討 論

炎癥貫穿動脈粥樣硬化過程的始終。易損斑塊與斑塊破裂、繼發(fā)血栓形成是ACS主要的發(fā)病機(jī)制[6]?；顒有匝装Y為判斷易損斑塊的主要標(biāo)準(zhǔn)之一[4]。各種危險因素引起斑塊局部炎癥，巨噬細(xì)胞浸潤、吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞引起脂質(zhì)核心的擴(kuò)大[7]；炎癥因子刺激單核/巨噬細(xì)胞分泌大量的MMP-9，降解纖維帽內(nèi)膠原，導(dǎo)致纖維帽變薄，斑塊極不穩(wěn)定、容易破裂而引起急性冠脈事件的發(fā)生[8]。

TLR是一類介導(dǎo)天然免疫的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體家族，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以通過核因子кB(NF-кB)激活細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄，是炎癥信號傳遞的門戶蛋白，在免疫防御反應(yīng)中起重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死患者外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)及其下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)顯著高于正常人和穩(wěn)定型心絞痛[9]，且在動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上TLR4表達(dá)增加，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)能上調(diào)巨噬細(xì)胞TLR4的表達(dá)[10]。LPS是TLR4外源性配體[11]，在MD-2協(xié)助下與TLR4結(jié)合，通過髓樣分化因子88(MyD88)介導(dǎo)下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活NF-κB，誘導(dǎo)細(xì)胞因子及前炎癥因子如TNF-α、IL-6的產(chǎn)生。MD-2是結(jié)合在TLR4胞外區(qū)的一種髓樣分化蛋白，它直接與LPS結(jié)合而將LPS信號傳至TLR4，可增強單核細(xì)胞經(jīng)TLR4對LPS的反應(yīng)，實現(xiàn)LPS信號的胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。王紅艷等[12]研究表明TLR4經(jīng)LPS激動后，可增加單核細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞上黏附因子氧化低密度脂蛋白受體(LOX-1)的表達(dá)，介導(dǎo)ox- LDL促動脈粥樣硬化作用。以上證據(jù)說明TLR4介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此，尋找TLR4內(nèi)源性配體，以及阻斷TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)則顯得尤為重要。

Tanaka等[13]報道高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平與斑塊破裂數(shù)目呈正相關(guān)，提出CRP在斑塊破裂及繼發(fā)血栓的形成中起關(guān)鍵作用。大劑量的CRP能抑制過氧化物酶體增生物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)[14]，此受體具有抗血管炎癥反應(yīng)的作用，促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運，升高循環(huán)中的高密度脂蛋白(HDL)水平，反映出CRP在動脈粥樣硬化斑塊形成過程的重要作用。Nomoto等[15]研究發(fā)現(xiàn)，hs-CRP水平在ACS組較穩(wěn)定型心絞痛和對照組顯著增高(分別為44.5 mg/L、2.1 mg/L和0.6 mg/L)。Pasceri等[16]用CRP 10 mg/L處理培養(yǎng)的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)，血管細(xì)胞黏附因子(VCAM-1)及E-選擇素表達(dá)增加，從而證實在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，CRP濃度的增加可促進(jìn)巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞向血管壁遷移。

研究發(fā)現(xiàn)CPR能以劑量依賴性增加肺動脈平滑肌上NF-κB 表達(dá)，而NF-κB 作為TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的媒介因子，勢必將會引起TLR4信號通路激活[17]。我們的研究直接證明：CRP可劑量依賴和時間依賴地誘導(dǎo)CD14+單核細(xì)胞表達(dá)TLR4和MD-2。CRP在濃度為5 mg/L時，即對TLR4表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用，隨著劑量增加效應(yīng)增強，100 mg/L時達(dá)最大效應(yīng)。CRP 50 mg/L在作用24 h時達(dá)峰值，隨后逐漸下降，我們推測由于CRP的半衰期為19 h，CRP逐漸降解或被受體介導(dǎo)清除，其誘導(dǎo)TLR4表達(dá)的作用降低。

TNF-α、IL-6是重要的炎癥細(xì)胞因子，與機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，均參與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。我們的研究證明：外周血單核細(xì)胞在不同濃度CRP蛋白刺激24h后，TNF-α、IL-6在CRP濃度為5 mg/L時便隨之升高，并在CRP達(dá)100 mg/L 時分別增加8.37倍和19.9倍。在50 mg/L CRP條件下培養(yǎng)6 h、12 h、24 h和48 h，TNF-α于24 h內(nèi)均隨著培養(yǎng)時間越長，表達(dá)量越高，而在48 h時，表達(dá)量降低；而IL-6在48 h達(dá)到峰值。應(yīng)用TLR4特異性阻斷劑后，TNF-α、IL-6表達(dá)量則顯著減少，甚至降至基礎(chǔ)水平。由此可見，CRP可以通過上調(diào)TLR4的表達(dá)，激活TLR4介導(dǎo)的固有免疫，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子基因的表達(dá)，促進(jìn)ACS發(fā)生及發(fā)展。

CRP還能通過TLR4信號傳導(dǎo)途徑呈劑量和時間依賴性增加MMP-9的釋放，MMP-9在受CRP 25 mg/L刺激時逐漸升高，當(dāng)CRP濃度增加到50 mg/L以上時，MMP-9增加非常顯著；在50 mg/L CRP濃度下培養(yǎng)6 h、12 h、24 h后，MMP-9均隨著培養(yǎng)時間越長，表達(dá)量越高，但培養(yǎng)48 h，MMP-9水平反而呈下降趨勢。Inokubo等[18]、劉金來等[19]均有研究結(jié)果證實：ACS患者M(jìn)MP-9血漿水平較正常對照組顯著升高。MMP-9是動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞分泌的主要基質(zhì)金屬蛋白酶，可以降解粥樣斑塊內(nèi)細(xì)胞外各型膠原及明膠，是動脈粥樣硬化形成和粥樣斑塊破裂的重要促進(jìn)因素。

總之，我們的研究證實：CRP能激活正常人單核細(xì)胞TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并誘導(dǎo)TNF-α、IL-6及MMP-9的產(chǎn)生，提示CRP可作為病原相關(guān)分子模式(PAMP)，通過TLR4模式受體介導(dǎo)而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，在易損斑塊形成和發(fā)展過程中起重要作用，從而促進(jìn)ACS的進(jìn)展。

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EffectsofC-reactiveproteinonsignaltransductionofToll-likereceptor4inCD14+monocytes

PENG Long, LUO Yan-ting, LIU Jin-lai

(DepartmentofCardiology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:lj.lai@medmail.com.cn)

AIM: To observe the influence of C-reactive protein (CRP) on Toll-like receptor 4 (TLR4) expression in CD14+monocytes, and to investigate the role of CRP in the inflammatory mechanism of acute coronary syndrome (ACS).METHODSMonocytes were isolated from peripheral blood of healthy volunteers by Ficoll density gradient centrifugation. The cells were stimulated with CRP at different doses (5, 25, 50, 100 mg/L) and different exposure time (6 h, 12 h, 24 h or 48 h). TLR4 inhibitor at different doses was co-incubated with the cells in the presence of CRP. The protein expression of TLR4 was measured by flow cytometry, and the mRNA expression of TLR4 and MD-2 was determined by quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR). The levels of tumor necrosis factor α(TNF-α), interleukin 6(IL-6) and matrix metalloproteinase 9(MMP-9) in the supernatants of cultured medium were measured by ELISA.RESULTSCRP increased the proteins of TLR4 and MD-2 in CD14+monocytes in dose-dependent and time-dependent manners. TLR4 inhibitor at high dose completely blocked the up-regulation of TLR4 and MD-2 induced by CRP. The same changes were found in the levels of TNF-α, IL-6 and MMP-9.CONCLUSIONCRP activates the signal transduction of TLR4 on CD14+monocytes, and induces the production of TNF-α, IL-6 and MMP-9, indicating that CRP may be as a pathogen associated molecular pattern (PAMP) to induce the inflammatory response via TLR4, and may contribute to the plaque vulnerability in atherosclerosis.

C-reactive protein; Receptors,Toll-like; Monocytes; Acute coronary syndrome

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.011

1000-4718(2011)01-0056-06

2010-08-06

2010-10-21

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No.07001556)

△通訊作者 Tel：020-85252168；E-mail：lj.lai@medmail.com.cn