維甲酸對高氧暴露新生大鼠肺組織角化細胞生長因子及其受體表達的影響*

張亞維， 陳貽驥， 徐雅麗

(重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院新生兒疾病診治中心，重慶 400014)

維甲酸對高氧暴露新生大鼠肺組織角化細胞生長因子及其受體表達的影響*

張亞維， 陳貽驥△， 徐雅麗

(重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院新生兒疾病診治中心，重慶 400014)

目的探討高氧暴露新生大鼠肺組織結構的變化和角化細胞生長因子(KGF)及其受體(KGFR)的表達情況及維甲酸(RA)對其的影響。方法將出生24 h內SD大鼠90只隨機分為3組，Ⅰ組：空氣+生理鹽水(NS)；Ⅱ組：高氧+NS；Ⅲ組：高氧+RA。Ⅱ、Ⅲ組持續(xù)暴露于85% O2中，Ⅰ組置于空氣中；Ⅲ組每天腹腔注射RA，Ⅰ、Ⅱ組每天腹腔注射NS。分別于生后3、7、14 d取肺標本，用HE染色法觀察肺組織結構變化及輻射狀肺泡計數(shù)(RAC)；RT-PCR檢測KGF和KGFR mRNA表達強度和免疫組織化學法檢測KGF蛋白表達水平。結果(1)生后第14 d，Ⅱ、Ⅲ組較Ⅰ組RAC值顯著減少(P<0.05)，但Ⅲ組較Ⅱ組明顯增高(P<0.05)。(2)與Ⅰ組相比，Ⅱ組3 d時，KGF mRNA表達明顯增強(P<0.05)；其后開始下降，7 d仍高于Ⅰ組(P<0.05)；14 d時較Ⅰ組有所降低(P<0.05)；Ⅲ組各時點表達量均高于同期Ⅱ組(P<0.05)。3 d時，各組KGFR mRNA表達量無明顯差異；7 d、14 d時，Ⅱ、Ⅲ組表達量明顯低于Ⅰ組(均P<0.05)，且Ⅱ組和Ⅲ組之間無顯著差異(P>0.05)。(3)KGF陽性細胞主要分布在部分肺泡壁及肺泡周圍血管內皮細胞和間質細胞。KGF蛋白表達強度與其mRNA表達變化相似。結論RA可促進肺組織KGF表達，改善高氧所致肺發(fā)育受阻。對未成熟肺高氧損傷有一定的保護作用。

高氧； 維甲酸； 肺損傷； 角蛋白細胞生長因子； 大鼠

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是新生兒，特別是早產(chǎn)兒高氧、機械通氣治療最常見的并發(fā)癥，嚴重影響存活兒的生長發(fā)育和生存質量。肺損傷后修復過程受肺泡Ⅱ型上皮細胞(alveolar epithelial type 2 cell，AEC Ⅱ)增殖及轉化成AEC Ⅰ的能力的控制[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在此修復和重建過程中，角化細胞生長因子(keratinocyte growth factor，KGF)-角化細胞生長因子受體(keratinocyte growth factor receptor，KGFR)信號通路和維甲酸(retinoic acid，RA)都發(fā)揮著重要作用。有體外實驗證實，RA的調節(jié)作用可能與KGF-KGFR信號通路有關，但活體動物模型研究較少。因此，本研究采用新生大鼠為對象，建立85%O2長期暴露肺損傷模型，探討RA對KGF、KGFR表達的影響，旨在進一步探討高氧肺損傷的發(fā)病機制及其可能的防治途徑。

材 料 和 方 法

1主要試劑

維甲酸購自山東良福制藥有限公司；CYS. 1型便攜式數(shù)字測氧儀購自上海嘉定電子儀器廠；Trizol RNA 提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；RT試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；Mix購自北京康為世紀生物技術有限公司；KGF、KGFR、β-actin引物由北京三博遠志生物技術有限公司合成；兔抗大鼠KGF多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，工作濃度1∶200；免疫組化抗兔SP試劑盒和DAB試劑盒均購自北京康為世紀生物技術有限公司。

2動物和分組

2.1動物 生長條件相同的足月新生SD大鼠90只，體重為6 g左右，不限性別。由重慶醫(yī)科大學動物中心提供。于生后24 h內將實驗動物隨機分為3組：Ⅰ組：空氣+生理鹽水(normal saline，NS)；Ⅱ組：高氧+NS；Ⅲ組：高氧+RA，各組再分為3 d、7 d、14 d等亞組，每組10只。

2.2動物模型制備 參照相關文獻[2]自制氧箱(55 cm×35 cm×30 cm)，Ⅱ組和Ⅲ組置于氧箱內，使氧濃度維持在850 mL/L，以測氧儀控制氧體積分數(shù),用鈣石灰以吸附CO2，溫度25-26 ℃，濕度60%-70%，每天開箱1 h，清潔氧箱,更換敷料,添加飼料及飲水，稱重，與對照組互換母鼠以避免母鼠因氧中毒而護理能力降低;Ⅰ組置于同一室內空氣中(氧濃度21%)。Ⅲ組從第1 d起每天腹腔注射RA 500 μg/kg，連續(xù)14 d；Ⅰ、Ⅱ組注射等體積NS。

2.3標本收集 生后3 d、7 d及14 d分別從各組中隨機抽取8只,腹腔注射100 g/L水合氯醛(3 mL/kg)麻醉。于心臟搏動最強處穿刺,用NS充分灌注直至肺成白色。迅速切取右肺,用生理鹽水洗凈殘血,吸干水分,放于凍存管中液氮速凍后存于-80℃冰箱，以備RT-PCR之用。取左肺,用4%多聚甲醛固定24 h,石蠟包埋, 5 μm切片,蘇木精-伊紅染色(HE染色),光鏡下檢查肺組織病理變化，同時行免疫組化檢測肺組織KGF表達。

3方法

3.1輻射狀肺泡計數(shù)(radial alveolar counts,RAC) RAC是指從終末細支氣管中心至最近纖維隔引垂直線，該直線上的肺泡數(shù)。選取各組生后第14 d大鼠肺組織石蠟切片行HE染色，光鏡下觀察組織病理改變，并在100倍光鏡下以雙盲的方式行RAC，每張切片計數(shù)5次，取平均值。

3.2RT-PCR檢測KGF、KGFR mRNA水平 KGF上游引物 5′-GAG CGA CAC ACG AGA AGT TAT GAC-3′，下游引物 5′-CAT TTA GCT GAT GCA GAG GTG TTG-3′，產(chǎn)物長度320 bp。KGFR上游引物 5′-GCA TGG TTG ACA GTT CTG CCA G-3′，下游引物 5′-GCT TCA GCC ATG ACT ACT TG C-3′，產(chǎn)物長度437 bp。 β-actin上游引物 5′-CAC CCG CGA GTA CAA CCT TC-3′，下游引物 5′-CCC ATA CCC ACC ATC ACA CC-3′，產(chǎn)物長度206 bp。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察并拍照，每組實驗至少重復3次，條帶采用Syngen公司的Gene Tools圖像分析軟件進行分析，比較KGF和KGFR與β-actin擴增條帶灰度比(AKGF/Aβ-actin、AKGFR/Aβ-actin)。

3.3免疫組化檢測肺組織KGF表達 石蠟包埋后的組織標本連續(xù)切片5 μm，常規(guī)脫蠟脫水；置10 mmoL/L檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中加熱修復抗原，冷卻至室溫，PBS沖洗5 min，3次；3%H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗5 min，3次；滴加正常山羊血清封閉非特異性抗原，37 ℃、30 min，傾去；滴加1∶200稀釋的兔抗大鼠KGF多克隆抗體，4 ℃過夜，PBS沖洗5 min，3次；滴加生物素標記山羊抗兔IgG抗體，37 ℃、30 min，PBS沖洗5 min，3次。滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液，37 ℃、30 min，PBS沖洗5 min，3次；DAB顯色1 min，蘇木素復染后中性樹脂封片。用PBS代替Ⅰ抗作陰性對照，KGF以細胞質出現(xiàn)棕黃色為陽性表達，每張切片在高倍鏡下隨機選取5個視野，采用Image Pro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)計算平均累積吸光度值(IA)，取平均值，檢測KGF的表達情況。

4統(tǒng)計學處理

結 果

1肺組織病理學改變

Ⅰ組在生后3、7和14 d肺部組織未見明顯病理變化。Ⅱ、Ⅲ組3d時肺間質增厚，可見有小血管充血擴張，炎癥細胞浸潤；7 d時，肺泡上皮細胞增生、腫脹，間質內細胞增多；14 d時肺泡增大，間質增厚更加明顯，肺組織結構顯示肺泡結構簡單化和囊泡化，肺泡形成明顯滯后。而Ⅲ組與Ⅱ組相比，病理改變明顯減輕，肺泡毛細血管豐富，肺泡直徑較小，數(shù)量增加，間隔增厚不明顯，見圖1。

Figure 1. Lung histological changes in different groups. A：3 d; B:：7 d; C：14 d. 1：group Ⅰ；2：group Ⅲ；3：group Ⅱ(HE，×200).

圖1各組肺組織病理變化

2肺RAC結果

RAC值反映終末呼吸單位含肺泡數(shù)的多少，可用以評價肺泡化水平。生后第14 d，Ⅰ-Ⅲ組RAC值分別為(10.68±0.10)個、(6.61±0.18)個、(8.58±0.23)個。Ⅱ、Ⅲ組較Ⅰ組RAC值顯著減少(P<0.05)，但Ⅲ組較Ⅱ組明顯增高(P<0.05)。

3KGF、KGFRmRNA表達強度

3.1高氧、RA對新生大鼠KGF mRNA表達的影響 與Ⅰ組相比，Ⅱ組3 d時，KGF mRNA表達明顯增強(P<0.05)；其后開始下降，7 d仍較Ⅰ組增加(P<0.05)；14 d時有所降低(P<0.05)；Ⅲ組各時點表達量均高于同期Ⅱ組，其差異顯著(P<0.05)，見表1、圖2。

Figure 2. Electropherogram of RT-PCR products on the 3rd(A),7th(B) and 14th(C) days in different groups. M: marker; a: KGF; b: β-actin; c: KGFR; 1：group Ⅰ；2：group Ⅲ；3：group Ⅱ.

圖2各組3、7和14dKGF、KGFR的RT-PCR電泳圖

表1各組不同時點肺組織KGFmRNA表達水平變化

Group3d7d14dⅠ0.45±0.030.43±0.030.44±0.03Ⅱ1.06±0.03*0.60±0.05*0.28±0.05*Ⅲ1.18±0.04#0.66±0.06#0.41±0.03#

*P<0.05vsthe corresponding group Ⅰ；#P<0.05vsthe corresponding group Ⅱ. Group Ⅰ:air+normal saline(NS); group Ⅱ:85% O2+NS; group Ⅲ:85%O2+retinoic acid.

3.2高氧、RA對新生大鼠KGFR mRNA表達的影響 3 d時，各組KGFR mRNA表達量無明顯差異；7 d、14 d時，Ⅱ、Ⅲ組表達量明顯低于Ⅰ組(均P<0.05)，且 Ⅱ 組和 Ⅱ 組之間無顯著差異(P>0.05)，見表2、圖2。

4肺組織KGF蛋白表達的變化

KGF陽性細胞顯色部位在胞漿，呈棕黃色。陽性細胞主要分布在部分肺泡壁及肺泡周圍血管內皮細胞和間質細胞。與Ⅰ組相比，Ⅱ組3 d時，KGF蛋白表達明顯增強(P<0.05)；其后開始下降，7 d仍較Ⅰ組增加(P<0.05)；14 d時較Ⅰ組有所降低(P<0.05)；Ⅲ組各時點表達量均高于同期Ⅱ組，其差異顯著(P<0.05)，見表3、圖3。

Figure 3. Lung KGF immunohistochemical results in different groups. A：3 d; B：7 d; C：14 d. 1：group Ⅰ；2：group Ⅲ；3：group Ⅱ(SP，×400).

圖3各組肺組織KGF表達

表2各組不同時點肺組織KGFRmRNA表達水平變化

Group3d7d14dⅠ1.48±0.051.47±0.051.50±0.05Ⅱ1.48±0.041.31±0.05*1.32±0.04*Ⅲ1.49±0.041.30±0.061.29±0.05

*P<0.05vsthe corresponding group Ⅰ.

表3各組不同時點肺組織KGF蛋白表達水平變化

Group3d7d14dⅠ478.16±131.88508.86±85.49548.96±71.12Ⅱ959.49±194.69*695.86±48.21*325.57±35.70*Ⅲ1169.76±172.04#852.49±131.97#543.13±88.82#

*P<0.05vsthe corresponding Ⅰ group；#P<0.05vsthe corresponding Ⅱ group.

討 論

隨著新生兒搶救技術的發(fā)展和肺表面活性物質的普及應用，新生兒呼吸窘迫綜合征的病死率明顯下降，但是BPD的發(fā)病率卻逐年增加。BPD病因和發(fā)病機制十分復雜，為多因素所致[3]。近年認為，高氧導致肺發(fā)育受阻可能是主要原因[3]。正常肺功能的維持有賴于完整的肺泡上皮屏障，肺泡上皮主要由AEC Ⅰ和AEC Ⅱ組成。正常情況下，只有極少量的AEC Ⅱ增殖分化為AEC Ⅰ。高氧肺損傷時，由于大量AEC Ⅰ被破壞，需要相對能耐受高氧的AEC Ⅱ增殖分化為AEC Ⅰ以修復受損的肺泡結構，因此AEC Ⅱ的增殖、移行以及向AEC Ⅰ的分化在高氧肺損傷修復過程中發(fā)揮關鍵性作用[4]。

1RA對高氧肺損傷的影響

RA是維生素A的活性代謝產(chǎn)物，在體內可改變多種物質的生物學活性，在肺發(fā)育、成熟與損失后修復發(fā)揮重要作用[5，6]，如：RA缺乏可引起肺成熟受阻導致BPD[7]，而補充外源性RA可促進肺泡隔的生成，促進肺成熟；嚙齒類自發(fā)性分隔期間，給RA后可誘導隔的形成；用地塞米松后抑制肺泡化進程，同時應用RA可預防這種抑制作用；補充RA可降低BPD的發(fā)病率、減輕嚴重性。本實驗結果顯示，高氧組較空氣組RAC值明顯減少，提示高氧暴露明顯抑制肺泡形成，阻礙了肺發(fā)育；而RA組RAC值較高氧組明顯增加，提示維甲酸治療可增加肺泡數(shù)目，部分逆轉這種由高氧引發(fā)的肺發(fā)育受阻。

2RA對KGF、KGFR表達的影響及其抗損傷作用機制

據(jù)文獻報道，KGF是成纖維細胞生長因子家族成員之一，KGF mRNA由間質細胞產(chǎn)生并翻譯成蛋白，而KGF則是通過旁分泌作用于表達有其受體的上皮細胞，主要調控上皮細胞生長分化與增殖[8]。KGF在免疫組化中出現(xiàn)的這種與其mRNA表達部位不一致現(xiàn)象可能是由于其被分泌后即與上皮表面表達的受體通過包含有蛋白聚糖的硫酸乙酰肝素結合形成的[9]，這與本實驗免疫組化所觀察到的結果一致。KGF在炎癥反應和損傷修復中起重要作用，高氧及其它多種肺損傷模型研究表明，KGF通過直接的上皮細胞、內皮細胞保護和T-細胞介導損傷保護等多種保護作用，減輕或避免肺組織損傷，提高存活率[10，11]。

近年來，KGF對高氧肺損傷的保護作用受到較廣泛關注。Barazzone等[12]在研究KGF對高氧誘導的急性肺損傷的保護作用時，發(fā)現(xiàn)KGF可阻止高氧誘導p53、bax和bcl-x基因mRNA表達，也能抑制血纖維蛋白溶解酶原激活劑的抑制劑-1(PAI-1)mRNA和相關蛋白質表達，從而抑制高氧肺損傷大鼠肺泡纖維化活性。研究表明，KGF能明顯抑制高氧誘導的AEC Ⅱ凋亡，促進AEC Ⅱ增殖、遷移和分化，從而提高實驗動物和細胞對高氧的耐受性[10,13]。RA逆轉肺發(fā)育阻滯及抑制肺損傷的具體機制不清。有研究發(fā)現(xiàn)RA主要參與對AECⅡ的增殖及轉化的調控。有文獻報道，在RA缺乏的血漿中培養(yǎng)的成纖維細胞中，KGF表達降低。而添加RA后，KGF表達水平隨之升高[14]。從RA和KGF相似的促進AECⅡ增殖和分化作用，作者推測RA可能通過調控KGF及其受體表達而發(fā)揮高氧肺損傷的保護作用。

本研究結果顯示，與Ⅰ組相比，Ⅱ組3 d時，肺組織KGF表達量明顯增加；其后開始下降，7 d仍高于Ⅰ組；14 d時較Ⅰ組降低，提示機體存在一定的自我保護性機制以拮抗高氧所產(chǎn)生的損害，但是這種內源性KGF作用是有限的。Ⅲ組各時點表達量均高于同期Ⅱ組，提示高氧肺損傷過程中給予RA治療增加肺組織KGF表達，這可能是RA發(fā)揮保護性作用的重要機制之一。本研究還發(fā)現(xiàn)，RA對肺組織KGFR表達無影響。

綜上所述，RA能夠減輕高氧肺損傷病理改變，緩解肺泡發(fā)育阻滯，上調高氧暴露肺組織KGF表達，對高氧肺損傷有一定保護和預防作用。高氧肺損傷發(fā)生機制復雜，RA對高氧下KGF進行調控的機制有待進一步探討。進一步的研究將對臨床治療高氧肺損傷和BPD提供實驗依據(jù)和更廣闊的思路。

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Effectofretinoicacidonexpressionofkeratinocytegrowthfactorandkeratinocytegrowthfactorreceptorininjuredlungtissuesofneonatalratsexposedtohyperoxia

ZHANG Ya-wei, CHEN Yi-ji, XU Ya-li

(NeonatalDiagnosisandTreatmentCentre,Children’sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China.E-mail:chenyiji55@yahoo.com.cn)

AIM: To observe the influence of retinoic acid (RA) on the lung damage, and the expression of keratinocyte growth factor (KGF) and keratinocyte growth factor receptor (KGFR) in neonatal rats exposed to hyperoxia.METHODSNinety full-term neonatal Sprague Dawley (SD) rats were randomly divided into 3 groups within 24 h after birth. Group Ⅰ: air+ normal saline (NS) group; group Ⅱ: hyperoxia (85%O2)+NS group; group Ⅲ: hyperoxia (85%O2)+ RA group. RA was injected to the animals in group Ⅲ intraperitoneally (500 μg/kg) everyday after birth, while NS was given with group Ⅰ and Ⅱ daily at the same time as group Ⅲ. On day 3, 7 and 14 after birth, 8 rats in each group were killed. Lung radial alveolar counts (RAC) were examined. The mRNA levels of KGF and KGFR were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The protein expression of KGF in the lung tissues was measured by immunohistochemical method.RESULTS(1) Compared with group Ⅰ, RACs in group Ⅱ and Ⅲ were significantly decreased (P<0.05) after 14 days, but those in group Ⅲ were significantly higher than those in group Ⅱ (P<0.05). (2) The mRNA expression of KGF was significantly increased after 3 days of hyperoxia as compared to the air-breathing control rats (P<0.05) and then descend after that. The expression was still higher on day 7 (P<0.05) than that in group Ⅰ and decreased significantly after 14 days of hyperoxia exposure (P<0.05). On the 3rd, 7th and 14th day, the mRNA expression of KGF in groupⅢ all obviously increased as compared to that at the corresponding time points in groupⅡ (P<0.05). No significantly difference of the mRNA expression of KGFR among the 3 groups on the 3rd day (P>0.05) was observed. Compared with group Ⅰ, the mRNA level of KGFR decreased significantly after hyperoxia on the 7th and 14th day (P<0.05). RA had no effect on the mRNA expression of KGFR. (3) The expression of KGF protein detected by immunohistochemistry was seen primarily in some alveolus, microvascular endothelia cells and interstitial cells. The protein levels of KGF were similar to those of KGF mRNA expression in all 3 groups.CONCLUSIONRA may facilitate the expression of KGF in the lung, ameliorate the impaired lung development resulting from hyperoxia, and play a protective role in lung development against hyperoxia-induced inhibition.

Hyperoxia; Retinoic acid; Lung injury; Keratinocyte growth factor; Rats

R722

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.005

1000-4718(2011)01-0027-06

2010-08-02

2010-10-18

重慶市衛(wèi)生局科研資助項目(No.渝衛(wèi)科教[2005]31-05-2-81)

△通訊作者 Tel: 023-63632135; E-mail： chenyiji55@yahoo.com.cn