葡萄籽原花青素對(duì)腎血管性高血壓大鼠血壓的影響*

吳秀香， 郭榮年， 郭瑞珍， 唐劍濤， 靳俊峰

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)1病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，2計(jì)算機(jī)教研室, 廣東 珠海 519041)

葡萄籽原花青素對(duì)腎血管性高血壓大鼠血壓的影響*

吳秀香1△， 郭榮年1， 郭瑞珍1， 唐劍濤2， 靳俊峰1

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)1病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，2計(jì)算機(jī)教研室, 廣東 珠海 519041)

目的觀察葡萄籽原花青素(GSP)對(duì)腎血管性高血壓(RH)大鼠血壓的影響并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。方法采用兩腎一夾(2K1C)法建立RH大鼠模型，并設(shè)假手術(shù)組(control，n=8)。術(shù)后2周，選取鼠尾動(dòng)脈收縮壓升至130 mmHg以上的大鼠32只為RH大鼠，隨機(jī)分為4組(n=8)：高血壓模型組(RH model)；GSP低劑量治療組(low GSP，50 mg·kg-1· d-1)；GSP高劑量治療組(high GSP，200 mg·kg-1· d-1)和卡托普利陽性對(duì)照治療組(captopril，30 mg·kg-1· d-1)。治療6周后，分別測定大鼠血壓、血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、 丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量，以及總抗氧化能力(T-AOC)；Western blotting法檢測腹主動(dòng)脈中內(nèi)皮素-1(ET-1)的蛋白表達(dá)。結(jié)果治療6周后，與control組相比，RH model組大鼠的尾動(dòng)脈收縮壓明顯升高(P<0.01)；與RH model組相比，GSP能顯著降低RH大鼠的尾動(dòng)脈收縮壓、MDA含量及主動(dòng)脈組織中ET-1的蛋白表達(dá)(high GSP組)，升高大鼠血清中SOD活性、NO含量(high GSP組)和T-AOC。結(jié)論GSP能顯著降低RH大鼠的尾動(dòng)脈收縮壓，其機(jī)制可能與其增強(qiáng)大鼠抗氧化能力，增加NO的產(chǎn)生和釋放，降低血管內(nèi)皮中ET-1的蛋白表達(dá)有關(guān)。

葡萄籽原花青素； 腎血管性高血壓； 內(nèi)皮縮血管肽1; 一氧化氮

高血壓病是目前公認(rèn)的危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，因此如何防治高血壓病一直是心血管領(lǐng)域重要的研究課題[1]。近年來的研究表明，葡萄籽原花青素(grape seed procyanidin，GSP)具有很強(qiáng)的清除自由基和抗氧化[2]、心血管保護(hù)[3,4](包括抗血小板凝聚、抗缺血再灌注損傷、舒張血管等)、減輕水腫和降低毛細(xì)血管通透性[5]等藥理作用，這些作用多數(shù)與高血壓病的發(fā)生機(jī)制(如氧化應(yīng)激[6]、炎癥[7]、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂致舒張血管物質(zhì)產(chǎn)生減少，收縮血管物質(zhì)產(chǎn)生增多[8]等)相關(guān)，因而推測其應(yīng)具有降壓作用，但關(guān)于葡萄籽原花青素是否具有降壓作用及機(jī)制如何，少見報(bào)道。本文擬用腎血管性高血壓(renovascular hypertensive，RH)大鼠模型觀察治療性給予GSP后大鼠血壓的變化，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期為開發(fā)GSP成為治療高血壓病的理想新藥奠定理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(180-200 g)，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002。

1.2藥物 GSP，購自天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司，純度≥95%；卡托普利(captopril)，中美上海施貴寶制藥有限公司產(chǎn)品。

1.3主要試劑和儀器 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malonaldehyde,MDA )、總抗氧化能力(total antioxidant capacity， T-AOC) 和一氧化氮(nitric oxide，NO)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠內(nèi)皮素-1(endothlin-1，ET-1)、辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗(武漢博士德生物工程有限公司)；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(MBI)；蛋白電泳儀(Bio-Rad)；大鼠尾動(dòng)脈壓測定裝置、多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(RM6240型，成都儀器廠)。其余試劑為市售分析純。

2方法

2.1RH大鼠模型復(fù)制 50只SD大鼠稱重、測量基礎(chǔ)尾動(dòng)脈壓，隨機(jī)分為手術(shù)組和假手術(shù)組(control，n=8)。手術(shù)組在乙醚麻醉下行腹部正中切口，鈍性分離出左腎動(dòng)脈，用直徑為0.20 mm的針灸針與腎動(dòng)脈長軸平行放置，與無菌絲線一齊扎緊，然后抽出針灸針，造成左腎動(dòng)脈部分狹窄，右腎保持不動(dòng)，復(fù)制腎血管性高血壓模型。術(shù)后3 d內(nèi)常規(guī)肌注青霉素(4×104U，bid)。Control組手術(shù)步驟同前，但不結(jié)扎腎動(dòng)脈。術(shù)后各組大鼠每周測量大鼠尾動(dòng)脈壓，連續(xù)測量3次，取平均值。術(shù)后2周，選取鼠尾動(dòng)脈壓升至130 mmHg以上的大鼠共32只，為復(fù)制成功的RH大鼠。

2.2動(dòng)物分組及給藥方法 32只RH大鼠隨機(jī)分為4組：高血壓模型組(RH model)；GSP高劑量治療組(high GSP)；GSP低劑量治療組(low GSP)和卡托普利陽性對(duì)照治療組(captopril)，每組8只。于模型復(fù)制成功后，治療組大鼠每天灌胃給藥1次，劑量分別為：GSP，200mg·kg-1· d-1；50 mg·kg-1· d-1；captopril，30 mg·kg-1· d-1。Control組及RH model組每天以相同體積的蒸餾水灌胃。

2.3T-AOC能力、SOD活性、MDA和NO含量的測定 主動(dòng)脈取血，制備血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

2.4主動(dòng)脈組織總蛋白的提取和Western blotting檢測ET-1蛋白表達(dá) 取大鼠腹主動(dòng)脈，按照質(zhì)量體積比1∶9加入勻漿液(含組織蛋白抽提試劑，多種蛋白酶抑制劑cocktail)進(jìn)行勻漿，加入等體積的2×上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白變性， 12 500 r/min 4 ℃離心15 min取上清液，BCA法(武漢博士德)測定樣品的蛋白濃度。用上樣緩沖液調(diào)整蛋白濃度，使各泳道的蛋白上樣體積為10 μL(含蛋白20 μg)。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜(NC膜)上，經(jīng)脫脂奶粉封閉、洗脫后加抗ET-1抗體(1∶200)4 ℃過夜孵育，再加相應(yīng)Ⅱ抗(1∶2 000)孵育2 h。加ECL發(fā)光顯示劑，暗盒壓片、曝光，顯影、定影于膠片。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1GSP對(duì)RH大鼠尾動(dòng)脈收縮壓(systolicbloodpressure,SBP)的影響

灌胃6周后，與control組相比，RH model組大鼠尾動(dòng)脈SBP明顯升高(P<0.01)；與RH model組相比，GSP的2個(gè)劑量治療組能顯著降低高血壓大鼠的尾動(dòng)脈 SBP(P<0.01)，以高劑量組的效果更明顯，見表1 。

2GSP對(duì)RH大鼠血清中MDA含量、SOD活性和T-AOC的影響

灌胃6周后，與control組相比，RH model組大鼠血清中的MDA含量顯著增高(P<0.01)，而SOD活力、T-AOC顯著降低(P<0.05)；與RH model組相比，high、low GSP組大鼠血清中 MDA含量顯著降低(P<0.01)，captopril組的此項(xiàng)指標(biāo)則未見明顯變化；3個(gè)治療組的SOD活性、T-AOC則明顯升高(P<0.01)，見表1。

3GSP對(duì)RH大鼠血清中NO含量的影響

灌胃6周后，與control組相比，RH model組大鼠血清中的NO含量顯著降低(P<0.01)，與RH model組比較，high GSP組大鼠血清中的NO含量顯著增高(P<0.01)，low GSP組、captopril組也有增高，但無顯著差異(P>0.05),見表1。

表1 GSP對(duì)各組大鼠尾動(dòng)脈SBP、血清中MDA含量、SOD活性 、T-AOC和NO水平的影響

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsRH model.

4GSP對(duì)RH大鼠腹主動(dòng)脈組織中ET-1蛋白表達(dá)的影響

RH model組ET-1蛋白表達(dá)明顯增多，各治療組的ET-1蛋白表達(dá)有不同程度的降低，以High GSP組的降低尤為明顯(P<0.01),見圖1。

圖1Westernboltting檢測ET-1蛋白表達(dá)

討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給RH大鼠灌胃高劑量和低劑量的GSP，均能顯著降低RH大鼠的尾動(dòng)脈SBP，其降壓效果與陽性對(duì)照藥captopril的效果相當(dāng)(P>0.05)，證實(shí)了GSP確有明顯的降壓作用，與國外學(xué)者在其它高血壓的動(dòng)物模型上觀察到GSP具有降壓作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[9]。

有研究表明，高血壓病的發(fā)生機(jī)制之一是由于機(jī)體氧自由基產(chǎn)生顯著增多，而內(nèi)源性氧自由基清除劑如SOD等活力明顯降低，從而導(dǎo)致機(jī)體總抗氧化能力減弱，機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[6]。我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與control 組相比，RH model組大鼠血清中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著升高，SOD活性及機(jī)體T-AOC能力明顯降低；而用GSP治療6周后，隨著大鼠血壓的降低，大鼠血清中MDA含量明顯降低，而SOD活性及機(jī)體T-AOC能力顯著升高，提示GSP的降壓機(jī)制與減少氧自由基的生成、提高清除自由基的酶活性進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體總抗氧化能力有關(guān)。

諸多研究[10]以及我們以往的研究[8]發(fā)現(xiàn)，多種類型高血壓可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells， VECs)功能紊亂，表現(xiàn)為NO的合成和釋放減少，ET的合成和釋放量顯著增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RH model組的大鼠血清中NO含量明顯低于control組，而主動(dòng)脈組織中ET-1的蛋白表達(dá)明顯高于control組；應(yīng)用GSP治療后，各治療組大鼠血清中的NO含量和主動(dòng)脈組織中ET-1的蛋白表達(dá)分別高于、低于RH model組，以GSP高劑量組尤為明顯(P<0.01)。此結(jié)果提示，GSP可能通過改善受損的VECs功能而發(fā)揮降壓作用。

綜上所述，GSP能通過抗氧化應(yīng)激、增強(qiáng)機(jī)體總抗氧化能力，同時(shí)促進(jìn)VECs合成和釋放舒張血管物質(zhì)NO，減少收縮血管物質(zhì)ET-1蛋白的表達(dá)而發(fā)揮降壓作用。鑒于目前防治高血壓病的藥物有一些明顯的副作用，而GSP來源廣泛易得，毒副作用低(目前尚未見有毒副作用的報(bào)道)，因此認(rèn)為GSP可作為治療高血壓病的理想藥物的候選者之一。至于GSP的降壓作用是否還涉及其它機(jī)制，尚需進(jìn)一步探討。

[1] 張成喜， 潘思年， 蒙榮森， 等. 二甲雙胍對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠心肌肥厚的影響[J].中國病理生理雜志， 2010, 26(2): 238-244.

[2] Bagchi D，Bagchi M，Stohs SJ，et al.Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract: importance in human health and disease prevention[J].Toxicology,2000，148(2-3)：187-197.

[3] Pataki T，Bak I，Kovacs P，et al. Grape seed procyanidins improved cardiac recovery during reperfusion after ischemia in isolated rat hearts[J]. Am J Clin Nutr，2002，75(5):894-899.

[4] Edirisinghe I, Burton-Freeman B, Tissa Kappagoda C. Mechanism of the endothelium-dependent relaxation evoked by a grape seed extract[J]. Clin Sci (Lond)， 2008，114(4):331-337.

[5] 李文廣，張小郁，吳勇杰，等.葡萄籽中原花青素的抗炎作用和機(jī)制[J].中國藥理學(xué)報(bào)(英文版)，2001，22(12)：1117-1120.

[6] 陳 琦，吳延慶，程曉曙. 氧自由基與高血壓[J]. 實(shí)用臨床醫(yī)學(xué)，2003，4(1):130-133.

[7] Pitsavos C, Chrysohoou C, Panagiotakos DB, et al. Abdominal obesity and inflammation predicts hypertension among prehypertensive men and women: the ATTICA study[J].Heart vessels，2008，23(2):96-103.

[8] 吳秀香,盧曉梅,張海鵬. 腎血管性高血壓大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的變化[J]. 高血壓雜志，2006，14(5):389-392.

[9] Al-Awwadi NA, Araiz C, Bornet A, et al. Extracts enriched in different polyphenolic families normalize increased cardiac NADPH oxidase expression while having differential effects on insulin resistance, hypertension, and cardiac hypertrophy in high-fructose-fed rats[J]. J Agric Food Chem, 2005, 53(1):151-157.

[10]Hirsch AT. Vascular disease, hypertension, and prevention: “from endothelium to clinical events”[J]. Am Coll Cardiol, 2003, 42(2):377-379.

Effectsofgrapeseedprocyanidinonbloodpressureinrenovascularhypertensiverats

WU Xiu-xiang1, GUO Rong-nian1, GUO Rui-zhen1, TANG Jian-tao2, JIN Jun-feng1

(1DepartmentofPathologyandPathophysiology,2DepartmentofComputer,ZhuhaiCampusofZunyiMedicalCollege,Zhuhai519041,China.E-mail:wxx64@sina.com)

AIM: To investigate the effects of grape seed procyanidin (GSP) on the blood pressure in renovascular hypertensive (RH) rats.METHODSThe RH rat model was established by 2K1C method. Two weeks after operation, 32 rats were selected according to the increased tail systolic pressure above 130 mmHg and randomly divided into 4 groups (n=8): renovascular hypertensive model group (RH model); low GSP-treated group (low GSP, 50 mg·kg-1·d-1); high GSP-treated group (high GSP, 200 mg·kg-1·d-1) and captopril-treated group (captopril, 30 mg·kg-1·d-1). Meanwhile, 8 rats with sham operation were served as controls. The tail systolic pressure, the activity of superoxide dismutase (SOD), the content of malonaldehyde (MDA) and nitric oxide (NO) level in serum and total antioxidant capacity (T-AOC) were determined 6 weeks after treatment. Western blotting was performed to detect the expression of endothlin-1 (ET-1) in abdominal aortic tissues.RESULTSCompared with control group, the tail systolic pressure in RH model group was increased significantly. In the RH model rats, treatment with GSP reduced the tail systolic pressure, MDA level and the expressions of ET-1 (only in high GSP group), and increased the activity of SOD, NO level (only in high GSP group) and T-AOC.CONCLUSIONGSP significantly decreases the tail systolic pressure in RH rats by increasing antioxidative ability and NO production, and reducing the expression of ET-1 in aortic endothelium in the rats.

Grape seed procyanidin; Renovascular hypertension; Endothelin-1; Nitric oxide

R544.1； R282.71

A

1000-4718(2011)03-0593-03

2010-08-07

2010-11-10

珠海市科技局資助項(xiàng)目(No.PC20071045)；貴州省科技廳資助項(xiàng)目(No. 黔科合J字[2008]2)；貴州省高層次人才科研條件特助經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(No.TZJF-2008年58號(hào))

△通訊作者 Tel：0756-7623356；E-mail：wxx64@sina.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.034