氫氣對慢性低氧高二氧化碳大鼠學習記憶障礙的干預作用*

楊秀艷, 邵蒙蒙, 金 露, 袁 海, 王小同

(溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院腦科，康復中心，浙江 溫州325027)

氫氣對慢性低氧高二氧化碳大鼠學習記憶障礙的干預作用*

楊秀艷, 邵蒙蒙, 金 露, 袁 海, 王小同△

(溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院腦科，康復中心，浙江 溫州325027)

目的觀察氫氣(H2)對慢性低氧(O2)高二氧化碳(CO2)模型大鼠學習記憶的干預作用。方法將通過八臂迷宮訓練的24只清潔級雄性SD大鼠隨機分為常氧對照組(NC)、低O2高CO2+生理鹽水組(MS)、低O2高CO2+H2(MH)，每組8只。NC組于常溫常壓條件下飼養(yǎng)，MS組和MH組置于O2濃度9%-11% 和CO2濃度5%-6%的艙內(nèi)飼養(yǎng)，每天8 h，每周6 d，持續(xù)4周，其余時間飼養(yǎng)條件與NC組相同。每天出艙后，MS組腹腔注射生理鹽水，MH組腹腔注射飽和H2水，劑量均為5 mL/kg。4周后，八臂迷宮測試3組大鼠的學習記憶能力；酶聯(lián)免疫吸附法檢測海馬8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)含量；分光光度計檢測血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量；顯微鏡下觀察3組大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)及神經(jīng)元凋亡小體數(shù)量。結(jié)果(1)與NC組比較，MS組和MH組工作記憶錯誤(WME)次數(shù)增加，海馬8-OHdG和血清MDA含量增加，血清SOD活性降低，海馬部位細胞結(jié)構(gòu)排列紊亂，尼氏體形狀和數(shù)量均有改變，凋亡細胞明顯增多。(2)與MS組相比，MH組WME次數(shù)減少，海馬8-OHdG和血清MDA含量降低，血清SOD活性增加，細胞結(jié)構(gòu)較整齊，尼氏體豐富完整，凋亡神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。結(jié)論H2改善低O2高CO2大鼠學習記憶障礙，可能與減少神經(jīng)元凋亡和氧化應激損傷有關。

氫； 低氧高碳酸血癥； 學習記憶功能； 八臂迷宮； 氧化性應激； 大鼠

慢性阻塞性肺氣腫(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系統(tǒng)的常見病多發(fā)病,嚴重威脅我國人民的身體健康。流行病學調(diào)查顯示,2006年我國40歲以上人群COPD發(fā)病率為8.2%，在我國約有超過3800萬患者。COPD是多因素誘發(fā)的疾病如粉塵、炎癥、氧化應激、缺氧等，低氧(O2)高二氧化碳(CO2)是COPD最重要的病理生理機制[1]，我們課題組用低O2高CO2環(huán)境制作COPD動物模型發(fā)現(xiàn)：慢性低O2高CO2環(huán)境損傷了動物的學習記憶功能[2]，其損傷機制與氧化應激、凋亡、炎癥等因素有關，但未見較有效的干預措施。

氫氣(H2)是一種無色、無嗅、無味的氣體。2007年，Ohsawa等[3]報道2%H2可選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子，顯著改善腦缺血再灌注損傷。Cai等[4]用飽和H2水治療輕中度腦缺血缺氧損傷的新生大鼠，證明H2可明顯改善缺血缺氧模型大鼠的神經(jīng)功能和學習記憶能力。本實驗用慢性低O2高CO2環(huán)境模擬COPD發(fā)病過程，觀察H2對COPD模型大鼠認知功能障礙的干預作用。

材 料 和 方 法

1材料

常壓氧艙及氣體濃度監(jiān)測儀(長沙華曦電子科技有限公司)；壓縮高純度氮氣(N2)，濃度>99．99%(溫州市申鹿氣體公司)；八臂迷宮實驗設備(溫州醫(yī)學院神經(jīng)生物研究所)；全自動酶標分析儀(寶特EL×800)；722可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；H2水(濃度為上海第二軍醫(yī)大學潛水醫(yī)學教研組提供，屬于該單位專利成果)； 8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG) ELISA試劑盒購于R&D公司；尼氏染色液(北京中杉生物科技有限公司)；TUNEL試劑(Roche試劑盒)。

2方法

2.1動物分組及模型制備[5](1)34只清潔級雄性SD大鼠 (溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供)，體重280-310g，6-8月齡，經(jīng)八臂迷宮訓練后淘汰10只。達標的24只大鼠遵循隨機原則分為3組：空白對照組(normal control,NC)；低O2高CO2+生理鹽水組(hypoxia-hypercapnia+saling,MS)、低O2高CO2+H2組(hypoxia-hypercapnia+hydrogen,MH)。(2)將MS組和MH組大鼠置于常壓低O2高CO2氧艙內(nèi)(充入N2和CO2維持艙內(nèi)O2濃度9%-11%，CO2濃度5%-6%，溫度23-26 ℃，濕度50%-70%)，每天8 h，每周6 d,共4周；其余時間同NC組于正常環(huán)境中飼養(yǎng)，動物自由攝食攝水，在動物出艙后，MS組腹腔注射生理鹽水，MH組腹腔注射飽和H2水，劑量均為5 mL/kg(據(jù)體重調(diào)整注射劑量)。

2.2八臂迷宮測試[6]造模前訓練大鼠的記憶能力,訓練前2 d限制大鼠飲食，使其體重降至原來的85%左右，在整個訓練期間限食并維持原來體重的85%左右不變(餌片配方:奶粉6 mg,乳糖23 mg,低取代羥基纖維素 2.5 mg,硬脂酸鎂0.5 mg,滑石粉1 mg,糖粉17 mg。經(jīng)制粒后,壓片機壓成 50 mg /片)。大鼠在迷宮中預適應2 d，每天1次，第1 d在八個臂中均撒上餌片任其自由攝食10 min，第2 d在固定的四臂中放置餌片(1、2、4、7臂)，任其在迷宮中尋找食物10 min。訓練時，固定在1、2、4、7臂中放置餌片不變，將大鼠放于迷宮中央?yún)^(qū)，任其自由攝食。大鼠進入放餌片的臂并攝取食物為1次正確的選擇不做記錄，再次進入放餌片的臂稱為工作記憶錯誤 (working memory error，WME)，進入不放餌片的臂稱為參考記憶錯誤 (reference memory error，RME)，兩者之和為總的記憶錯誤 (total memory error，TE)。訓練成功的標準：連續(xù)5次訓練WME均為零，RME≤1次。記錄參數(shù)為WME、RME及TE。動物常壓低氧氧艙造模4周后，按上述方法對3組大鼠進行測試，記錄參數(shù)同上，記錄的數(shù)據(jù)為實驗結(jié)果。

2.3取材 動物經(jīng)八臂迷宮測試完畢后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取新鮮血，加適量肝素，3 000 r/min離心10 min，取血清測超氫化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量，然后生理鹽水灌注，分離大鼠雙側(cè)海馬組織，一側(cè)常規(guī)脫水石蠟包埋，制作厚度為5 μm石蠟切片；另一側(cè)選取1 mm×1 mm×1 mm固定于戊二醛溶液中用作電鏡觀察，EPON812包埋，LKB-V型超薄切片機切片，鋨酸染色，H-600型透射電鏡觀察腦超微結(jié)構(gòu)改變，剩余部分加適量PBS勻漿，12 000 r/min離心10 min后取上清，酶聯(lián)免疫吸附法測量8-OHdG含量。

2.4血清SOD活性和MDA含量測定 用黃嘌呤氧化酶法測定血清SOD活性(樣本量30 μL)，用硫代巴比妥酸法測定血清MDA含量(樣本量100 μL)。具體操作按試劑盒說明書進行(試劑盒購自南京建成生物工程研究所)。

2.5海馬8-OHdG含量測定 采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 8-OHdG 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 8-OHdG與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠8-OHdG，形成免疫復合物連接在板上。辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450 nm處測A值，8-OHdG濃度與A值成正比，繪制標準曲線即可求出標本中8-OHdG濃度。

2.6尼氏染色 取上述制作好的石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，然后將切片放入尼氏染色液10 min，無水乙醇分化5 s，透明，封片；光鏡下觀察，結(jié)果判讀：尼氏體為核周呈塊狀(形如虎斑)或顆粒狀紫藍色小體，每張切片隨機選取5個高倍視野，統(tǒng)計尼氏體數(shù)量(單位：個/高倍視野)。

2.7TUNEL染色 取上述制作好的石蠟切片，常規(guī)脫蠟水合，PBS液沖洗2次，加入2‰蛋白酶K工作液，37 ℃水浴箱反應半小時，PBS液沖洗2次，隨機選取2張切片設立陽性和陰性對照，其余切片在每個標本滴加50 μL TUNEL反應液，37 ℃水浴箱避光溫浴1 h，后PBS沖洗5次，抗淬滅封片劑封片，避光放置。結(jié)果判讀：將處理好的標本置于熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)波長450 nm，發(fā)射波長550 nm)，陽性細胞為核周染色質(zhì)濃縮呈明亮點狀的黃綠色細胞，每張切片隨機取5個高倍視野，統(tǒng)計陽性細胞個數(shù)(單位：個/高倍視野)。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1H2對低O2高CO2模型大鼠學習記憶的影響

與NC組(WME 0.13±0.12;TE 2.00±0.30)相比，MS和MH組WME(分別為1.88±0.26和0.88±0.29)、TE(4.13±0.25和2.50±0.52)均有增加 (P<0．05)，RME亦增加，但無顯著差異(P>0.05)；與MS組比較，MH組WME和TE均明顯減少，見表1。

表1各組八臂迷宮實驗的結(jié)果

GroupWMERMETENC0．13±0．121．88±0．292．00±0．30MS1．88±0．26◆2．25±0．264．13±0．25◆MH0．88±0．29★1．63±0．252．50±0．52★

◆P<0.05vsNC group；★P<0.05vsMS group.

2海馬8-OHdG、血清MDA含量和血清SOD活性結(jié)果

與NC組相比，MS組8-OHdG含量[(137.369±7.589)μg/L]和MDA含量[(4.613±1.545)μmol/L]明顯增加，SOD活性[(19.803±3.650)×103U/L]降低(P<0.05);與MS組比較，MH組的8-OHdG含量[(123.389±6.041)μg/L]和MDA[(3.165±0.978)μmol/L]含量減少，SOD活性[(28.850±4.900)×103U/L]增強(P<0.05);MH組與NC組相比，8-OHdG和MDA含量增加，SOD活性增強，但無顯著差別，見表2。

表2各組8-OHdG、MDA含量及SOD活性水平

Group8-OHdG(μg/L)MDA(μmol/L)SOD(103U/L)NC113．146±5．9533．068±1．41924．608±3．787MS137．369±7．589★4．613±1．545★19．803±3．650★MH123．389±6．041◇3．165±0．978◇28．850±4．900◇

★P<0.05vsNC group;◇P<0.05vsMS group.

3病理

3.1光鏡觀察 NC組組織結(jié)構(gòu)排列有序,輪廓清晰,結(jié)構(gòu)完整,尼氏體位于核周,數(shù)量豐富，結(jié)構(gòu)完整、染色均勻，著色較深，凋亡細胞偶見；MS組組織結(jié)構(gòu)紊亂,細胞輪廓尚清,尼氏體數(shù)量顯著減少,結(jié)構(gòu)不規(guī)整，凋亡細胞較多見；MH組組織結(jié)構(gòu)排列基本有序,細胞輪廓清晰,染色稍淺，尼氏體數(shù)量MS組較豐富，結(jié)構(gòu)基本完整，個體較小，凋亡細胞數(shù)目較MS組明顯減少 (各組切片平均每高倍視野下尼氏體和凋亡細胞數(shù)見表3、鏡下圖片見圖1、2)。

3.2電鏡觀察 海馬神經(jīng)元細胞核：NC組細胞核呈圓形,核膜光滑，核仁清晰可見,染色質(zhì)呈細顆粒狀，分布均勻；MS組細胞核固縮，外形不規(guī)則，核膜模糊，核仁更加致密； MH組細胞核輕度水腫，呈橢圓形，核膜基本光滑，染色質(zhì)均勻，核仁清晰可見。NC組細胞漿內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器豐富，結(jié)構(gòu)清晰完整；MS組胞漿電子密度增高，細胞器明顯減少，結(jié)構(gòu)模糊，MH組胞漿內(nèi)細胞器豐富，結(jié)構(gòu)完整，電子密度較NC和MS組減低,見圖3。

表3各組尼氏小體和凋亡細胞定量分析

GroupNisslbodyApoptoticcellsNC8．608±2．0870．463±0．132MS5．103±1．650★8．737±1．672★MH9．650±1．912◇3．144±1．014◇

★P<0.05vsNC group;◇P<0.05vsMS group.

Figure 1. The morphology and number of Nissl body in hippocampus tissues with Nissl staining in the three groups( light microscope,×400).

圖1尼氏染色顯示3組大鼠海馬組織尼氏體的形態(tài)和數(shù)目

Figure 2. Neuronal apoptosis(green) in hippocampus tissues detected by TUNEL staining (fluorescence microscope,×400).

圖2TUNEL染色顯示3組大鼠海馬組織凋亡細胞數(shù)量

Figure 3. The nucleus morphology of hippocampus neurons by electron microscopy(×6 000).

圖3電鏡下3組大鼠海馬組織神經(jīng)元細胞核形態(tài)

討 論

慢性低氧可導致大腦的線粒體、溶酶體損傷，進而影響細胞能量代謝，使ATP生成減少；嚴重缺氧時神經(jīng)細胞膜電位降低，神經(jīng)遞質(zhì)合成減少，腦細胞能量代謝障礙，細胞膜通透性增加等上述因素使中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能受損[7]。缺氧可加重大鼠海馬氧化應激損傷，誘導海馬凋亡相關基因表達，促使海馬神經(jīng)元遲發(fā)型死亡，從而加重認知功能損害[8]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)低O2高CO2環(huán)境下大鼠記憶功能受損，腦組織脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA和DNA氧化產(chǎn)物8-OHdG生成增多，超氧化物歧化酶SOD活性降低，海馬組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性破壞，尼氏體減少，凋亡細胞增大，反映了低O2高CO2環(huán)境使大鼠機體氧化應激反應增強，組織結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)元凋亡增加，從而影響其神經(jīng)功能和學習記憶能力。

本實驗給予低O2高CO2模型大鼠腹腔注射飽和H2生理鹽水的方法發(fā)現(xiàn)：H2能夠顯著改善低O2高CO2模型大鼠學習記憶障礙，推測H2的保護作用主要通過以下機制：(1)減輕DNA、脂質(zhì)氧化應激損傷，增強超氧化物歧化酶SOD活性；(2)維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和形態(tài)的穩(wěn)定，減少神經(jīng)元凋亡，從而保證神經(jīng)抗氧化，而且能夠保護腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，減少神經(jīng)元凋亡，從而改善大鼠的學習記憶能力。目前，由于技術(shù)、設備等原因，動物模型尚不能監(jiān)測體內(nèi)H2濃度，這也是我們以后研究H2作用機制必須要攻克的難題。

H2是人體內(nèi)的生理物質(zhì)之一，無毒副反應[9]。將H2在高壓裝置下溶于生理鹽水避免了爆炸的危險，方便運輸和使用。一系列動物實驗證明，H2對結(jié)腸炎[10]、肝炎、缺血再灌注[11]、器官移植后排斥反應[12]等動物模型均有明顯保護作用。本實驗發(fā)現(xiàn)H2可改善低O2高CO2所致的大鼠模型學習記憶障礙，為預防、治療認知障礙提供了新的方法和思路,也為拓展H2的應用領域提供了初步理論依據(jù)。H2改善認知功能障礙的確切機制有待進一步研究。

[1] Zheng GQ, Wang Y,Wang XT. Chronic hypoxia-hypercapnia influences cognitive function: a possible new model of cognitive dysfunction in chronic obstructive pulmonary disease[J]. Med Hypotheses, 2008,71(1):111-113.

[2] 李 勇，鄧小龍，邵勝敏,等.c-Jun氨基末端激酶在慢性低O2高CO2大鼠海馬損傷中的作用[J].中國病理生理雜志,2009,25(5)：914-918.

[3] Ohsawa I, Ishikawa M, Takahashi K,et al. Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals[J]. Nat Med,2007,13(6):673-677.

[4] Cai J，Kang Z，Liu K，et al. Neuroprotective effects of hydrogen saline in neonatal hypoxia-ischemia rat model[J]．Brain Res，2009，1256：129-137.

[5] 胡良岡，龔永生，范小芳,等．常壓低氧高二氧化碳清潔級動物飼養(yǎng)艙的研制[J]. 醫(yī)療衛(wèi)生裝備,2003，24(4)：16-17.

[6] 李 寧,徐漫歡,王小同.施普善對慢性低O2高CO2大鼠空間學習記憶損害的干預作用[J].溫州醫(yī)學院學報,2009，39(3)：197-200.

[7] 吳 彬，金 露，王小同,等. 慢性低氧高二氧化碳對小鼠大腦線粒體功能的影響[J].溫州醫(yī)學院學報，2010,40(2)：115-118.

[8] 王 玲，劉輝國，楊榮時，等.間歇缺氧對血管性癡呆大鼠認知能力的影響及其可能機制[J].中國病理生理雜志,2009,25(10)：1922-1925.

[9] Sun XJ, Zhang JH. Hydrogen- an endogenous antioxidant in the body[J]. 第二軍醫(yī)大學學報,2008,29(3): 233-235.

[10]Kajiya M, Silva MJ, Sato K,et al. Hydrogen mediates suppression of colon inflammation induced by dextran sodium sulfate[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009,386(1):11-15.

[11]Mao YF, Zheng XF, Cai JM, et al. Hydrogen-rich saline reduces lung injury induced by intestinal ischemia/reperfusion in rats[J]. Biochem Biophys Res Commun,2009,381(4):602-605.

[12]Cardinal JS, Zhan J, Wang Y, et al.Oral hydrogen water prevents chronic allograft nephropathy in rats[J]. Kidney Int,2010,77(2):101-109.

Interventionofhydrogenonmemorydamageinducedbychronichypoxia-hypercapniainrats

YANG Xiu-yan, SHAO Meng-meng, JIN Lu, YUAN Hai, WANG Xiao-tong

(CenterofNeurologyandRehabilitation,TheSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325027,China.E-mail:wangxt22@163.com)

AIM: To investigate the effects of hydrogen on the memory damage caused by chronic hypoxia-hypercapnia in rats.METHODSTwenty-four SD rats trained by eight-arm radial maze test were randomly divided into 3 groups:normal control group (NC), hypoxia-hypercapnia+saline group (MS) and hypoxia-hypercapnia+ hydrogen group (MH). The rats in the latter 2 groups were placed in a closed cabin for 8 h/day,6 days/week and lasted for 4 weeks, in which O2was 9%-11% and CO2was 5%-6%. In every time after the animals were out of the cabin, the MS rats were intraperitoneally injected with saline (5 mL/kg) and the MH rats were intraperitoneally injected with hydrogen solution at the same dose. The learning and memory function, the activity of superoxide dismutase (SOD), the content of malondialdehyde (MDA) and 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) were examined after the cabin training. The ultramicrostructures of hippocampus were also observed.RESULTS(1) Compared with NC group, the number of working memory errors, the total errors, the content of hippocampus 8-OHdG and serum MDA in MS and MH groups were higher and the activity of serum SOD was lower (P<0.05). The hippocampus structure was destroyed and some degree of edema and more apoptosis in the neurons were obserued in MS group and MH group. (2) Compared with MS group, the number of working memory errors(WME), the total errors, the content of hippocampus 8-OHdG and serum MDA were lower and the activity of serum SOD was higher in MH group (P<0.05). In MH group, the morphology of hippocampus structures kept nearly normal arrangement and the only mild edema and fewer apoptosis in the neurons were found.CONCLUSIONHydrogen may attenuate chronic hypoxia-hypercapnia-induced memory damage in rats by inhibiting apoptosis of the neurons and decreasing detrimental free radicals reaction.

Hydrogen; Hypoxia hypercapnia; Learning memory function; Eight-arm radial maze; Oxidative stress; Rats

R363

A

1000-4718(2011)03-0566-05

2010-10-27

2010-12-31

浙江省自然科學基金資助項目(No.Y205233); 溫州市科技局資助項目(No.Y2005A001)

△通訊作者 Tel：0577-86699362；E-mail：wangxt22@163.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.028