坎地沙坦阻斷血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的原代急性髓樣白血病細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制*

童秀珍， 陳自仁， 梁 瑋， 梁 樹， 李 娟， 羅紹凱， 陳運(yùn)賢

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科， 廣東 廣州 510080)

坎地沙坦阻斷血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的原代急性髓樣白血病細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制*

童秀珍△， 陳自仁， 梁 瑋， 梁 樹， 李 娟， 羅紹凱， 陳運(yùn)賢

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科， 廣東 廣州 510080)

目的觀察血管緊張素Ⅱ 1型受體(AT1R)拮抗劑坎地沙坦抑制血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)介導(dǎo)的原代急性髓樣白血病(AML)細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制。方法MTT法觀察Ang Ⅱ?qū)υ鶤ML細(xì)胞、正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖的影響以及坎地沙坦和AT2R拮抗劑 PD123319對(duì)AngII促原代AML細(xì)胞增殖的拮抗作用； Western blotting法觀察坎地沙坦和PI3K抑制劑對(duì)原代AML細(xì)胞Akt磷酸化的影響。結(jié)果AngII能劑量和時(shí)間依賴性促進(jìn)原代AML細(xì)胞增殖(P<0.05)，而對(duì)正常骨髓無此作用?？驳厣程闺S濃度和時(shí)間依賴性阻斷Ang II作用下白血病細(xì)胞增殖(P<0.05)。PI3K抑制劑可抑制Ang II促進(jìn)原代AML細(xì)胞的增殖(P<0.05)，坎地沙坦能明顯下調(diào)Ang II增加原代AML細(xì)胞Akt的磷酸化水平(P<0.05)。結(jié)論坎地沙坦通過抑制PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制Ang II/AT1R介導(dǎo)的白血病細(xì)胞增殖。

白血病髓樣,急性； 血管緊張素Ⅱ； 坎地沙坦； PI3K/Akt信號(hào)通路

血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的主要效應(yīng)物質(zhì)，通過與血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensinⅡtype 1 receptor，AT1R)結(jié)合而影響機(jī)體的血壓和水電解質(zhì)平衡,也會(huì)加速動(dòng)脈硬化形成[1]。近年多項(xiàng)研究證實(shí)Ang Ⅱ在乳腺癌、膀胱癌等實(shí)體瘤細(xì)胞株、實(shí)體標(biāo)本及動(dòng)物模型中均顯示促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，AT1R拮抗劑坎地沙坦在膀胱癌動(dòng)物模型中具有抗腫瘤作用[2,3]。有報(bào)道急性髓樣白血病患者骨髓中存在腎素、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶及Ang Ⅱ及AT1R的過表達(dá)[4]。因此本研究旨在探討Ang II對(duì)原代急性髓樣白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者白血病細(xì)胞增殖的影響和AT1R拮抗劑坎地沙坦(candesartan)能否阻斷這種作用及機(jī)制，為將來進(jìn)一步可能的臨床用藥提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1研究對(duì)象

32例除M3外成人AML骨髓標(biāo)本來自2009年2月至2010年2月我院住院及門診初診AML患者，其中男性18例，女性14例，中位年齡43(11-82)歲。按FAB分型標(biāo)準(zhǔn)，其中M2 6例， M4 10例，M5 15例，M6 1例。26例非惡性血液病患者正常骨髓像的骨髓為對(duì)照組，男性14例，女性12例。

2方法

2.1MTT法測(cè)定細(xì)胞生長率 淋巴細(xì)胞分離液分離AML患者及正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞，將細(xì)胞調(diào)至2×108cells/L,取0.1 mL加入96孔板，分別加入不同濃度(使其終濃度分別為10-9、10-8、10-7mol/L)的Ang II、AT1R拮抗劑坎地沙坦(1 μmol/L、10 μmol/L)、AT2R拮抗劑PD123319 (1 μmol/L、10 μmol/L)和PI3K/Akt抑制劑(LY294002, 20 μmol/L、40 μmol/L),實(shí)驗(yàn)分組：Ang II單獨(dú)組、candesartan單獨(dú)組、PD123319單獨(dú)組、Ang II(10-7mol/L)+candesartan組和Ang II(10-7mol/L)+PD123319組、AngII(10-7mol/L)+ PI3K/Akt抑制劑(LY294002)組, 余加入含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，對(duì)照組為RPMI-1640培養(yǎng)基, 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別培養(yǎng)時(shí)間6 h、12 h、24 h、48 h后,加入20 μL 5 g/L的MTT再培養(yǎng)4 h，然后離心棄培養(yǎng)液每孔加入100 μL的DMSO，搖床混勻10 min后，在酶標(biāo)儀上用波長為570 nm測(cè)定A值，每組采用3個(gè)平行孔，并計(jì)算細(xì)胞增殖率和細(xì)胞抑制率(1-細(xì)胞增殖率)。

2.2Western blotting法檢測(cè)坎地沙坦對(duì)原代AML白血病細(xì)胞磷酸化Akt(p-Akt)的影響 分別收集candesartan(1 μmol/L,10 μmol/L)、LY294002(20 μmol/L,40 μmol/L)及Ang II(10-7mol/L)不同組合處理24 h后的細(xì)胞，冰凍PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液(1×PBS,1%Nonidet P-40,0.5%sodium deoxycholate，0.1%SDS,100 mg/L phenylmethylsul-fonyl fluoride，10 mg/L aprotinin，10 mg/L leupeptin)振蕩30 min，待裂解液澄清后離心(12 000×g，離心15 min，4 ℃)，取100 μg蛋白細(xì)胞裂解液，煮沸20 min，8% SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST[10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),150 mmol/L NaCl,0.1%Tween]室溫封閉2 h，再分別加入單克隆抗體4 ℃下過夜，然后用TBST洗膜3次，再用1∶5 000稀釋的HRP-Ⅱ抗交聯(lián)物室溫下孵育2 h，最后再次用TBST洗3次，化學(xué)發(fā)光法X線下曝光顯影。用TINA軟件 2.10e對(duì)各組p-Akt蛋白結(jié)果的灰度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算公式為：(p-Akt蛋白灰度吸收值-背景灰度吸收值)/(內(nèi)參蛋白GAPDH-灰度吸收值-背景灰度吸收值)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1AngII對(duì)原代AML細(xì)胞及正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖的影響

從圖1可見，當(dāng)Ang II濃度為10-9mol/L并作用6 h時(shí),即對(duì)原代AML細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用，與對(duì)照組(不加藥)比較差異顯著,P<0.05，隨劑量增加，這種促進(jìn)作用進(jìn)一步增強(qiáng)，不同濃度組比較，差異顯著,P<0.05；隨著作用時(shí)間延長，Ang II對(duì)原代AML細(xì)胞增殖率明顯增加，不同作用時(shí)間的比較，P<0.05。Ang II對(duì)正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖的影響見圖2，不同濃度Ang II對(duì)正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖無明顯影響(P>0.05)。

圖1AngII促進(jìn)原代AML細(xì)胞增殖曲線

圖2AngII對(duì)正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖的影響

2坎地沙坦拮抗AngII作用下原代AML細(xì)胞增殖

表1可見,(1)培養(yǎng)12 h，分別加入1 μmol/L和10 μmol/L candesartan,細(xì)胞增殖率明顯減低，與對(duì)照組(Ang ll組)比較差異顯著，P<0.05。(2)培養(yǎng)24 h，對(duì)照組細(xì)胞增殖率為1.453±0.170，分別加入1 μmol/L和10 μmol/L 坎地沙坦，白血病細(xì)胞增殖率也明顯減低,分別為1.027±0.130和0.627±0.070,與對(duì)照組比較差異顯著，P<0.05，表明坎地沙坦能隨劑量和時(shí)間依賴性阻斷Ang II作用下白血病細(xì)胞增殖，AT2R拮抗劑PD12331未能阻斷Ang II作用下白血病細(xì)胞增殖，不呈劑量及時(shí)間依賴。

表1坎地沙坦對(duì)AngII作用下原代AML細(xì)胞增殖的影響

Group12h(A)24h(A)Control(AngII10-7mol/L)0．957±0．0901．453±0．170AngII+candesartan(1μmol/L)0．733±0．070?1．027±0．130?AngII+candesartan(10μmol/L)0．635±0．110?#0．627±0．070?#AngII+PD123319(1μmol/L)0．955±0．0801．443±0．120AngII+PD123319(10μmol/L)0．951±0．1101．459±0．070

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vs1 μmol/L candesartan group.

3坎地沙坦、PI3K抑制劑對(duì)AngII作用下原代AML細(xì)胞p-Akt的影響

從圖3可見，10-7mol/L AngⅡ促進(jìn)AML細(xì)胞增殖，加入40 μmol/L PI3K 抑制劑LY294002可阻斷白血病細(xì)胞的增殖，坎地沙坦有類似PI3K 抑制劑LY294002的作用。

Western blotting法檢測(cè)各組p-Akt蛋白的水平，10-7mol/L Ang II組p-Akt蛋白灰度值明顯高于空白對(duì)照組(2.32±0.20vs0.25±0.10,P<0.05),加入10 μmol/L坎地沙坦處理后p-Akt蛋白灰度值明顯降低(0.57±0.10vs2.32±0.20，P<0.01)，說明Ang II與AT1R結(jié)合經(jīng)PI3K/Akt信號(hào)途徑促進(jìn)原代AML細(xì)胞增殖，坎地沙坦通過下調(diào)白血病細(xì)胞Akt蛋白磷酸化途徑抑制細(xì)胞增殖，見圖4。

圖3坎地沙坦及PI3K抑制劑對(duì)AngII作用下原代AML細(xì)胞增殖的影響

圖4坎地沙坦對(duì)AngII作用下原代AML細(xì)胞Akt磷酸化的影響

討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)RAS在胃癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、絨癌等實(shí)體腫瘤中存在過表達(dá)，AT1R拮抗劑能抑制這些腫瘤細(xì)胞的生長[2,3,8]。RAS系統(tǒng)也參與造血調(diào)控，有研究報(bào)道AngⅡ作用于AT1R促進(jìn)紅系分化、促進(jìn)造血祖細(xì)胞增殖，氯沙坦可阻斷增殖效應(yīng)[5]，RAS 在急性白血病中也起重要作用， Koca等[6]報(bào)道白血病K562細(xì)胞株過表達(dá)腎素、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、血管緊張素原及AT1R和AT2R。有報(bào)道在AML患者骨髓中存在腎素、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶及血管緊張素的過表達(dá)[4]。在腎素表達(dá)陽性白血病患者中，化療完全緩解(CR)時(shí)腎素表達(dá)消失，在復(fù)發(fā)時(shí)腎素再次表達(dá);而在化療不敏感的AML患者中腎素持續(xù)表達(dá)[7]。但Ang II對(duì)原代AML細(xì)胞增殖體外實(shí)驗(yàn)報(bào)道較少見,我們的研究發(fā)現(xiàn)Ang II體外可促進(jìn)AML細(xì)胞的增殖，隨著Ang Ⅱ濃度增大及作用時(shí)間延長，這種促進(jìn)作用進(jìn)一步增強(qiáng)，在Ang Ⅱ濃度為10-7mol/L時(shí)這種促進(jìn)作用達(dá)到最大，而Ang Ⅱ?qū)φ９撬鑶蝹€(gè)核細(xì)胞生長無促進(jìn)作用,這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的AML患者存在Ang Ⅱ的過表達(dá)[4]相符合，說明AngII在AML發(fā)病中起重要作用。

AngⅡ在實(shí)體瘤中的作用機(jī)制，有研究證實(shí)在膀胱癌動(dòng)物中AngⅡ通過AT1R使血管內(nèi)皮細(xì)胞因子(VEGF)水平升高促進(jìn)腫瘤生長[3]；激活MAPK(促分裂激活蛋白激酶)信號(hào)途徑促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長[2]；也有發(fā)現(xiàn)Ang II激活A(yù)T1R后通過PI3K/Akt信號(hào)途徑增強(qiáng)絨毛膜癌BeWo細(xì)胞株遷移和侵襲[8]。但Ang II對(duì)急性白血病的作用機(jī)制仍不清楚，有報(bào)道AT1R拮抗劑氯沙坦抑制K562、HL60和U937細(xì)胞增殖不依賴于c-myc和bcl-2基因表達(dá)的下降，其促細(xì)胞凋亡作用也不是通過下調(diào)c-myc、bcl-2和bcl-x基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，其機(jī)制可能與這些藥物阻斷AngⅡ經(jīng)AT1R激活Smad有關(guān)[9]；有研究表明持續(xù)激活的變異型STAT5通過PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)造血惡性細(xì)胞株(Ba/F3)生長及維持其生存，阻斷PI3K/Akt信號(hào)途徑后抑制細(xì)胞增殖，我們觀察Ang II促白血病細(xì)胞增殖是否通過PI3K/Akt(Akt是PI3K的主要下游效應(yīng)分子之一)信號(hào)途徑而起作用，我們的結(jié)果顯示PI3K 抑制劑LY294002可阻斷Ang II誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞的增殖，坎地沙坦可以下調(diào)Ang II誘導(dǎo)白血病細(xì)胞Akt蛋白磷酸化，提示Ang II與其AT1R結(jié)合經(jīng)PI3K/Akt信號(hào)途徑促進(jìn)原代AML細(xì)胞增殖，坎地沙坦可阻斷該途徑。

AT1R拮抗劑坎地沙坦能劑量和時(shí)間依賴性阻斷Ang II作用下原代AML細(xì)胞增殖，這一結(jié)果與De la Iglesia Iigo等[9]報(bào)道血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑群多普利、AT1R拮抗劑氯沙坦對(duì)體外培養(yǎng)的白血病細(xì)胞株K562、HL60、U937和 KU812的增殖具有抑制作用相符合，提示AT1R受體拮抗劑具有一定的抗白血病作用。在其它研究中許多證據(jù)顯示ACEI 和AT1R拮抗劑可能是抗血管生成、抗腫瘤細(xì)胞生長和抗癌細(xì)胞侵襲的新抗腫瘤藥，Kosugi等[10]報(bào)道在膀胱癌動(dòng)物模型中顯示坎地沙坦聯(lián)合紫杉醇具有協(xié)同抗腫瘤作用。Wilop等[11]報(bào)道52例晚期非小細(xì)胞肺癌患者長期服用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑或者AT1R拮抗劑聯(lián)合以鉑類藥物為一線化療藥物的化療方案，其生存率較單純以鉑類藥物為一線化療藥物的患者生存率高[11],但AT1R拮抗劑對(duì)急性白血病的臨床療效還有待進(jìn)一步證實(shí)。

[1] 陳志堅(jiān), 王彥富, 廖玉華，等.血管緊張素Ⅱ?qū)HP - 1源性泡沫細(xì)胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1的影響[J].中國病理生理雜志，2007,23(2):316-320.

[2] Greco S, Muscella A, Elia MG, et al. Angiotensin II activates extracellular signal regulated kinases via protein kinase C and epidermal growth factor receptor in breast cancer cells[J]. J Cell Physiol, 2003, 196(2): 370-377.

[3] Kosugi M, Miyajima A, Kikuchi E, et al. Effect of angiotensin II type 1 receptor antagonist on tumor growth and angiogenesis in a xenograft model of human bladder cancer[J]. Hum Cell, 2007, 20(1): 1-9.

[4] Beyazit Y, Aksu S, Haznedaroglu IC, et al. Overexpression of the local bone marrow renin-angiotensin system in acute myeloid leukemia[J]. J Natl Med Assoc, 2007, 99(1): 57-63.

[5] Rodgers KE,Xiong S,Steer R,et al. Effect of angiotension II on hematopoietic progenitor cell proliferation[J].Stem Cells,2000,18(4):287-294.

[6] Koca E, Haznedaroglu IC, Acar K, et al. Renin-angiotensin system expression in the K562 human erythroleukaemic cell line[J]. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 2007, 8(3): 145-147.

[7] Inigo SL, Casares MT, Jorge CE, et al. Relevance of renin expression by real-time PCR in acute myeloid leukemia[J]. Leuk Lymphoma, 2006, 47(3): 409-416.

[8] Ishimatsu S, Itakura A, Okada M, et al. Angiotensin II augmented migration and invasion of choriocarcinoma cells involves PI3K activation through the AT1 receptor[J]. Placenta, 2006, 27(6): 587-591.

[9] De la Iglesia Iigo S, López-Jorge CE, Gómez-Casares MT, et al. Induction of apoptosis in leukemic cell lines treated with captopril, trandolapril and losartan: a new role in the treatment of leukaemia for these agents[J]. Leuk Res, 2009, 33(6): 810-816.

[10]Kosugi M, Miyajima A, Kikuchi E, et al. Angiotensin II type 1 receptor antagonist enhances cis-dichlorodiammineplatinum-induced cytotoxicity in mouse xenograft model of bladder cancer[J]. Urology, 2009, 73(3): 655-660.

[11]Wilop S, von Hobe S, Crysandt M, et al. Impact of angiotensin I converting enzyme inhibitors and angiotensin II type 1 receptor blockers on survival in patients with advanced non-small-cell lung cancer undergoing first-line platinum-based chemotherapy[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2009, 135(10): 1429-1435.

AntagonisticeffectofangiotensinIItype1receptorblockercandesartanonangiotensinII-inducedproliferationofprimaryacutemyeloidleukemiacells

TONG Xiu-zhen, CHEN Zi-ren, LIANG Wei, LIANG Shu, LI Juan, LUO Shao-kai, CHEN Yun-xian

(DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:tongxz05@163.com)

AIM: To explore the antagonistic effect and mechanism of candesartan on angiotensin II (Ang II)-induced proliferation of primary acute myeloid leukemia (AML)cells.METHODSMTT assay was used to observe the proliferation effect of Ang II on primary AML cells and normal bone marrow mononuclear cells, and the antagonistic effects of candesartan[an antagonist of angiotensin Ⅱ type 1 receptor (AT1R)] and PD123319 (an antagonist of AT2R) were also observed. Akt phosphorylation was detected by Western blotting when the cells were treated with candesartan and a PI3K inhibitor LY294002.RESULTSCompared with the control cells, Ang II significantly increased the proliferation of AML cells in a dose-and time-dependent manner (P<0.05). Ang II did not stimulate the proliferation of normal bone marrow mononuclear cells. The proliferative effect of Ang II was effectively blocked by the AT1R blocker candesartan (P<0.05). PI3K inhibitor strongly repressed the Ang II-induced cell proliferation (P<0.05). Candesartan significantly reduced Akt phosphorylation promoted by Ang II on primary AML cells (P<0.05).CONCLUSIONCandesartan effectively inhibits Ang II-induced proliferation of primary AML cells by down-regulating PI3K/Akt signaling pathway, indicating a new possible treatment mechanism in some AML cells.

Leukemia,myeloid,acute; Angiotensin II; Candesartan; PI3K/Akt signaling pathway

R733.71

A

1000-4718(2011)03-0514-04

2010-07-06

2011-01-05

廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2010B031600077)

△通訊作者 Tel：020-87755766-8911;E-mail：tongxz05@163.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.018