hHBrk1與WAVE1蛋白相互作用位點的鑒定*

虞紅珍, 祝 敏, 王 豫, 徐勤枝, 吳 強, 周平坤△

(1安徽醫(yī)科大學病理學教研室, 安徽 合肥 230032；2軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850 )

hHBrk1與WAVE1蛋白相互作用位點的鑒定*

虞紅珍1,2, 祝 敏2, 王 豫2, 徐勤枝2, 吳 強1△, 周平坤2△

(1安徽醫(yī)科大學病理學教研室, 安徽 合肥 230032；2軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850 )

目的鑒定微絲相關蛋白hHBrk1與WAVE1的結(jié)合位點。方法利用PCR的方法克隆人WAVE1及各結(jié)構(gòu)域的基因片段，并將之亞克隆至真核表達載體；免疫共沉淀技術檢測hHBrk1與WAVE1結(jié)合位點。結(jié)果獲得了WAVE1及各結(jié)構(gòu)域基因的真核表達載體；免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)hHBrk1與WAVE1的Scar同源結(jié)構(gòu)域(SHD)結(jié)合，而WAVE1蛋白結(jié)合于hHBrk1的羧基端，羧基端七肽重復(HR)結(jié)構(gòu)域點突變后獲得的蛋白失去了與WAVE1的結(jié)合能力。結(jié)論hHBrk1可能通過HR結(jié)構(gòu)域與WAVE1的SHD區(qū)結(jié)合，參與WAVE1蛋白的細胞亞定位或維持其穩(wěn)定性，從而調(diào)控腫瘤細胞的遷移。

蛋白質(zhì)，hHBrk1; 蛋白質(zhì)，HSPC300; 蛋白質(zhì)，WAVE1

微絲與細胞形態(tài)的維持和運動有著密切關系，惡性轉(zhuǎn)化細胞常表現(xiàn)為細胞骨架的破壞和微絲聚合的異常，惡性腫瘤細胞胞漿中微絲聚合增多可促進腫瘤細胞的侵潤、轉(zhuǎn)移[1-4]。因此研究腫瘤侵潤、轉(zhuǎn)移的機制，尋找新的腫瘤運動相關基因，可為抗腫瘤轉(zhuǎn)移的生物治療提供靶點。hHBrk1蛋白在腫瘤組織中高表達，參與腫瘤細胞的遷移[5]；研究發(fā)現(xiàn)hHBrk1是微絲聚合關鍵蛋白WAVE1復合物的成員之一， WAVE1復合體為五聚體，由WAVE1、PIR121、Nap125、HSPC300/hHBrk1和Abi2同源蛋白共同組成[6，7]，其復合物各亞單位之間相互作用的可能機制見圖1[8]；而HSPC300結(jié)合在WAVE1蛋白的SHD結(jié)構(gòu)域，在WAVE1蛋白的定位和穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用[9]。本研究分別構(gòu)建了WAVE1和hHBrk1的截短體和突變體，通過免疫共沉淀和GST pull-down技術，進一步探討hHBrk1與WAVE1的相互關系，明確其結(jié)合位點，為更好地了解hHBrk1的作用機制提供實驗基礎。

Figure 1. The model for regulation of WAVE/Scar proteins(Ibarra N,et al[8]).

圖1WAVE/Scar蛋白的調(diào)控模式

材 料 和 方 法

1材料

pCMV-HA質(zhì)粒、人胎腦cDNA文庫、血凝素(hemagglutinin,HA)抗體和組氨酸(histidine,His)抗體購自Clontech；原核表達載體pGBTNH可在目的蛋白羧基端插入His標簽，由國家生物醫(yī)學分析中心顏賢忠教授惠贈；原核表達蛋白GST-hHBrk1、GST-

hHBrk1(47-75)、GST-hHBrk1-R54、 GST-hHBrk1 (1-46)、 GST-hHBrk1-S56G57和His-hHBrk1由本實驗室制備保存[10]；PCR純化試劑盒和T4 DNA連接酶均為Promega產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶購自BioLabs；DMEM和Lipofectamine 2000為Gibco-BRL產(chǎn)品； Protein G和蛋白酶抑制劑cocktail片購自Roche；序列測定由英俊生物技術公司完成。

2方法

2.1WAVE1及各結(jié)構(gòu)域真核表達載體的構(gòu)建 WAVE1含559個氨基酸，從N端到C端分別含有：WAVE同源區(qū)(WAVE/Scar homology domain， WHD/SHD)；堿性區(qū)(basic domain)；脯氨酸富集區(qū)(Pro-rich)；VCA區(qū)(verprolin同源區(qū)、cofilin同源區(qū)和酸性氨基酸富集區(qū)的合稱)[6]。設計引物擴增WAVE1編碼基因及SHD、Pro-rich和VCA 3個結(jié)構(gòu)域，上、下游引物分別引入EcoRI、XhoI酶切位點，引物序列及PCR反應條件見表1。以人胎腦cDNA文庫為模板，擴增WAVE1基因開放閱讀框，將此PCR產(chǎn)物稀釋后為模板，擴增WAVE1的SHD、Pro-rich和VCA 3個結(jié)構(gòu)域，并分別插入pCMV-HA真核表達質(zhì)粒。PCR產(chǎn)物行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠儀觀察并照相。

表1 基因PCR擴增的引物序列和參數(shù)

2.2WAVE1各截短體的真核表達 將pCMV-HA-WAVE1、-SHD、-Pro-rich 和-VCA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人胚腎293T細胞，細胞轉(zhuǎn)染參閱Lipofectamine 2000說明書進行。48 h后提取總蛋白，Western blotting檢測表達情況。Ⅰ抗為HA單抗，Ⅱ抗為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的羊抗鼠抗體。

2.3免疫共沉淀檢測WAVE1及各結(jié)構(gòu)域蛋白與hHBrk1的相互作用 293T細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，pCMV-HA-WAVE1、-SHD、-Pro-rich 和-VCA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染步驟如前。48h后預冷PBS洗滌細胞2次，加裂解緩沖液(lysis buffer I)，冰上裂解1 h, 裂解液離心取上清，在實驗管中加入His-hHBrk1蛋白20 μL, 對照組加入pGBTNH空載體的細菌裂解上清液。加入protein G agarose, 4 ℃預吸附2 h，離心取上清。然后加入HA抗體和protein G 50 μL, 4 ℃混勻過夜。裂解緩沖液洗滌沉淀。每管加50 μL 1×SDS上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，離心取上清，取樣行SDS-PAGE，Western blotting檢測，Ⅰ抗為His抗體。

2.4免疫共沉淀檢測hHBrk1及各缺失截短體與WAVE1的相互作用 pCMV-HA-WAVE1轉(zhuǎn)染293T細胞，48 h后收集細胞。在細胞裂解液中加入50 μL的hHBrk1及各缺失截短體原核表達融合蛋白，兩者均勻混合。共5組，即GST-hHBrk1、GST-hHBrk1(47-75)、GST-hHBrk1-R54、GST-hHBrk1(1-46)和GST-hHBrk1-S56G57，以GST為對照。用HA抗體和protein A/G珠沉淀WAVE1蛋白，實驗步驟如前所述；Western blotting檢測，Ⅰ 抗為GST抗體。

結(jié) 果

1WAVE1及各結(jié)構(gòu)域基因真核表達載體的構(gòu)建

瓊脂糖凝膠電泳顯示，WAVE1基因的PCR擴增成功，在1 500 bp位置上可見一銳利條帶，陰性對照組無擴增,見圖2A。以此PCR稀釋產(chǎn)物為模板，PCR擴增WAVE1的結(jié)構(gòu)域片段，結(jié)果如圖2B顯示，PCR分別擴增出相應片段，大小分別為600 bp、600 bp和200 bp左右。將PCR產(chǎn)物克隆至PGEM-T-easy載體中，雙酶切后連接至pCMV-HA載體中，菌落PCR鑒定，測序證實目的基因片段正向同框插入，序列無誤，表達載體在目的蛋白的氨基端加入了HA標簽。質(zhì)粒分別命名為pCMV-HA-WAVE1、pCMV-HA-SHD、pCMV-HA -Pro-rich 和pCMV-HA-VCA。

Figure 2. Electrophoresis of PCR products ofWAVE1 gene and the truncated mutants. A: marker: DL2000 DNA marker; WAVE1: the PCR product of humanWAVE1 gene.B: marker: DL2000 DNA marker; The PCR products of SHD,Pro-rich and VCA domains.

圖2WAVE1及各結(jié)構(gòu)域PCR電泳圖

2WAVE1及各截短體的真核表達

WAVE1及截短體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，48 h后提取總蛋白，Western blotting檢測表達情況。顯影后在67 kD 、22 kD及8 kD位置得到特異條帶，表明載體構(gòu)建正確，轉(zhuǎn)染真核細胞有表達,見圖3。

Figure 3. Identification of recombination protein of WAVE1 and the truncated mutants by SDS-PAGE. A: Western blotting analysis of recombination protein of WAVE1; B: Western blotting analysis of recombination protein of truncated mutants.

圖3Western印跡檢測WAVE1及各截短體融合蛋白表達

3WAVE1與hHBrk1免疫共沉淀

為了驗證hHBrk1和人的WAVE1蛋白是否存在相互作用，我們采用了免疫共沉淀的方法。pCMV-HA-WAVE1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293T細胞，48 h后裂解細胞。實驗組加入了含His-hHBrk1的菌液裂解上清，對照組加入pGB-TNH空載體的細菌裂解上清液。結(jié)果顯示，實驗組和細菌裂解液(陽性對照)均在約20 kD的同一水平出現(xiàn)特異條帶而對照組(NC)未出現(xiàn)，提示hHBrk1與WAVE1共沉淀，兩者存在相互作用，見圖4。

Figure 4. WAVE1 co-immunoprecipitated with hHBrk1 from the mixed supernatant of cellular lysates.

圖4Western印跡證實hHBrk1與WAVE1免疫共沉淀

4hHBrk1結(jié)合在WAVE1的SHD區(qū)

為了進一步探索hHBrk1和WAVE1的相互作用位點，我們檢測hHBrk1和WAVE1各截短體的相互作用位點。結(jié)果如圖5所示，hHBrk1與WAVE1的SHD區(qū)域共沉淀，而Pro-rich和VCA區(qū)未能與hHBrk1結(jié)合，表明WAVE1蛋白的SHD結(jié)構(gòu)域存在hHBrk1蛋白相互作用位點。

Figure 5. The immunoprecipitation analysis of hHBrk1 with various domains of WAVE1.The result indicated the hHBrk1 interacted with the SHD domain of WAVE1 protein.

圖5Western印跡分析hHBrk1與WAVE1各截短體的相互作用

5WAVE1結(jié)合于hHBrk1的羧基端

結(jié)果如圖6所示，WAVE1與GST-hHBrk1、GST-hHBrk1(47-75)共沉淀，表明hHBRrk1的羧基端有WAVE1蛋白的結(jié)合位點。在hHBrk1的第47-67位氨基酸殘基，有1個七肽重復(heptad repeat, HR )結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域可形成特殊的卷曲螺旋，是介導蛋白質(zhì)相互作用的重要結(jié)構(gòu)域[6]。針對HR結(jié)構(gòu)域的點突變蛋白hHBrk1-R54和hHBrk1 S56G57均未能與WAVE1共沉淀，表明HR結(jié)構(gòu)域的破壞可能改變了hHBrk1蛋白的構(gòu)象，阻止了其與WAVE1的相互作用。

Figure 6. Identification the binding site between WAVE1and hHBrk1. The result indicated that WAVE1 interacted with HR domain of hHBrk1.

圖6WAVE1與hHBrk1及各缺失突變體免疫共沉淀結(jié)果

討 論

WAVE蛋白最初在網(wǎng)狀原蟲(Dictyostelium)中發(fā)現(xiàn)，是Scar的同源基因產(chǎn)物，包括WAVE1/Scar1、WAVE2/Scar2和WAVE3/Scar3。WAVE/Scar蛋白是目前較為關注的肌動蛋白成核促進因子，功能定位于細胞的片狀偽足，參與細胞遷移[11,12]；其以WAVE1、PIP121、Nap125、HSPC300/hHBrk1和Abi2同源蛋白共同組成的復合物形式存在，當Rac1將外界刺激傳遞至復合體時，后者反式激活，釋放PIR121、Nap 125及Abi2，WAVE1與HSPC300形成亞二聚體而活化，暴露VCA區(qū)與Arp2/3相互作用，以Arp2/3依賴的方式參與肌動蛋白組裝。Gautreau 等[13]進一步闡述了WAVE1/Scar復合體各亞單位之間的相互作用。他的研究表明此復合體可能以Nap和Abi2為核心， PIR121和 Scar/WAVE-HSPC300抱繞其外周，形成1個緊密結(jié)合的五聚體，以保持WAVE蛋白功能的穩(wěn)定，其活性依賴于Rac，見圖1。研究發(fā)現(xiàn)WAVE2和WAVE3也以相同的信號復合物形式參與微絲聚合的調(diào)控[14]。

Caracino等[9]的研究顯示網(wǎng)狀原蟲細胞中HSPC300蛋白與WAVE1的SHD區(qū)結(jié)合，但人源hHBrk1和WAVE1的相互作用如何，尚未有報道。我們采用了免疫共沉淀方法，明確了hHBrk1與WAVE1存在相互作用，且WAVE1的SHD區(qū)結(jié)合于hHBrk1第47-75位氨基酸，該段序列含有HR結(jié)構(gòu)域。HR 結(jié)構(gòu)域的特征可形成特殊的卷曲螺旋(coiled-coil)，可與其它有此結(jié)構(gòu)的蛋白形成異二聚體，或本身形成同源二聚體[15,16]。實驗同時證明，在進行點突變破壞HR結(jié)構(gòu)域的疏水性后，突變體表達蛋白不能和WAVE1相互作用，提示HR結(jié)構(gòu)域的完整性是hHBrk1與WAVE1相互作用的結(jié)構(gòu)基礎。

Qurashi等[17]利用果蠅模型發(fā)現(xiàn)HSPC300突變后，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表現(xiàn)如神經(jīng)細胞的軸突不連續(xù)、神經(jīng)肌肉連接處的突觸發(fā)育不良的改變與WAVE/Scar復合體中其它成員突變后的病理表現(xiàn)相同，提示HSPC300作為WAVE/Scar復合體的成員，共同調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。有研究顯示hHBrk1基因突變細胞中，WAVE1蛋白表達水平急劇下降[18]，提示hHBrk1參與維持WAVE1蛋白的穩(wěn)定性。缺失N末端Scar/WAVE的網(wǎng)狀原蟲細胞在F-actin的排列分布、細胞形態(tài)、細胞運動及胞漿流動上都表現(xiàn)異常；特別是N末端的前96個氨基酸殘基對于Scar/WAVE的功能定位與調(diào)控至關重要[9]。結(jié)合本研究的結(jié)果，提示hHBrk1可能通過HR結(jié)構(gòu)域與WAVE1的SHD區(qū)結(jié)合，參與維持WAVE1蛋白的穩(wěn)定性，從而調(diào)控細胞的遷移。

本研究明確了hHBrk1與WAVE1存在相互作用，且兩者相互結(jié)合位點位于WAVE1的SHD結(jié)構(gòu)域和hHBrk1的羧基端，從分子結(jié)構(gòu)上找到了兩者相結(jié)合的依據(jù)；豐富了hHBrk1在Rac-WAVEs-Arp2/3信號通路中的調(diào)控作用，為更好理解腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移提供了實驗依據(jù)。

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InteractionbetweenhHBrk1andWAVE1protein

YU Hong-zhen1,2, ZHU Min2, WANG Yu2, XU Qin-zhi2, WU Qiang1, ZHOU Ping-kun2

(1DepartmentofPathology,CollegeofBasicMedicine,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China;2InstituteofRadiationMedicine,AcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100850,China.E-mail:aydjohn@yahoo.com;zhoupk@nic.bmi.ac.cn)

AIM: To identify the binding sites between hHBrk1 and WAVE1 protein.METHODSPCR was applied to clone theWAVE1 gene and its truncated domains from human fetal brain library. The gene fragments were sub-cloned into eukaryotic expression vector. Co-immunoprecipitation assay was used to identify the binding sites between hHBrk1 and WAVE1.RESULTSThe sequences ofWAVE1 and the truncated domains were successfully amplified and sub-cloned into pCMV-HA vector. An HA tag was added to the fused protein at N-terminal. The interaction between hHBrk1 and the Scar homology domain(SHD) of WAVE1 was identified by co-immunoprecipitation. We also observed that WAVE1 bound to the heptad repeat(HR) domain of hHBrk1, and the site-directed mutations at HR domain abolished the interaction between hHBrk1 and WAVE1.CONCLUSIONhHBrk1 may play an important role in migration of tumor cells through binding to SHD of WAVE1 protein.

Protein hHBrk1; Protein HSPC300; Protein WAVE1

R363

A

1000-4718(2011)03-0494-05

2010-10-25

2010-12-29

國家自然科學基金資助項目(No.30570550); 北京市自然科學基金資助項目(No.5042023;No.7062052);安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院引進人才基金資助項目(No.2009/3)

△通訊作者 Tel: 010-66931217; 0551-3869489； E-mail: aydjohn@yahoo.com;zhoupk@nic.bmi.ac.cn

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.014