子宮內(nèi)膜癌中PTEN與P27kipl蛋白表達(dá)及相關(guān)性研究

馬學(xué)功，朱叢中，岳天孚

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津300052）

子宮內(nèi)膜癌是常見的女性生殖道三大惡性腫瘤之一，其中子宮內(nèi)膜樣腺癌（EECA）占80%~90%。張力蛋白同源第10號(hào)染色體丟失的磷酸酶基因（PTEN）是一種具有雙重磷酸酶活性的抑癌基因，在子宮內(nèi)膜癌尤其EECA中突變率最高，且與子宮內(nèi)膜癌前病變—子宮內(nèi)膜不典型增生（CAH）的發(fā)生有關(guān)，促進(jìn)了CAH向子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)化，PTEN基因表達(dá)減少或缺失有望成為早期子宮內(nèi)膜癌及癌前病變的診斷指標(biāo)之一[1]。P27kipl是近年發(fā)現(xiàn)的一種周期素依賴激酶抑制劑，可能是PTEN通過PI3K/AKT途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞分化增殖，誘導(dǎo)G1期阻滯過程的下游靶基因。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測PTEN及P27蛋白在子宮內(nèi)膜癌病變中的表達(dá)，從而進(jìn)一步探討二者在EECA的早期診斷和預(yù)后判斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科2000~2004年收治患者行診斷性刮宮及手術(shù)切除組織石蠟包埋標(biāo)本，共90例，包括：正常增殖期子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本20例；子宮內(nèi)膜增生癥組織標(biāo)本18例，其中單純或復(fù)雜增生8例，不典型增生10例；子宮內(nèi)膜癌組織標(biāo)本52例，其中EECA 45例，透明細(xì)胞癌4例，漿液性乳頭狀腺癌（UPSC）2例，黏液癌1例。EECA患者平均年齡57歲，術(shù)前未行放化療，按組織學(xué)分級高分化（G1級）30例，中低分化（G2、G3級）15例；按FIGO手術(shù)-病理分期Ⅰ~Ⅱ期33例，Ⅲ~Ⅳ期12例。所有組織標(biāo)本均由病理醫(yī)生閱片復(fù)核，臨床病理資料完整。

1.2 試劑 兔抗人PTEN多克隆抗體與鼠抗人P27單克隆抗體為北京中山生物制劑公司提供的美國Zymed公司產(chǎn)品(工作濃度均為1∶100)；免疫組化超敏SP試劑盒、DAB顯色試劑盒等均為北京中山公司產(chǎn)品。

1.3 方法 蠟塊組織連續(xù)切片，厚5μm，除做HE染色外，其余均按照試劑盒要求做免疫組化SP法染色。每批染色均設(shè)陰性和陽性對照。

1.4 結(jié)果判定 P27蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，為棕黃色顆粒；PTEN主要表達(dá)于胞漿，亦呈黃色或棕黃色顆粒。采取兩人雙盲法觀察切片，隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)1 000個(gè)實(shí)質(zhì)細(xì)胞中陽性細(xì)胞的百分比，無陽性細(xì)胞為0分；陽性細(xì)胞比例小于10%為1分;10%～50%為2分；51%～80%為3分；大于80%為4分。按染色強(qiáng)度評分:不著色為0分；黃色1分；棕黃色2分；黃褐色3分。兩者評分相乘，0分為陰性；1~3分弱陽性；4~6分為中度陽性；7~12分為強(qiáng)陽性[2]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)數(shù)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性比較用χ2或Fisher’s精確概率分析，兩者相關(guān)性檢驗(yàn)用Kendall’s等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 PTEN與P27在Ⅰ型、Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá) 在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌組織中PTEN與P27分別有57.8%和62.2%表達(dá)缺失,而在7例Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌組織中有6例PTEN與P27表達(dá)陽性，PTEN與P27在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)陽性率明顯低于Ⅱ型（P<0.05），見表 1。

表1 Ⅰ、Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中PTEN與P27蛋白的表達(dá)Tab 1 Expression of PTEN and P27 protein inⅠ、Ⅱtype EC

2.2 PTEN與P27在子宮內(nèi)膜不同病變中的表達(dá) 正常內(nèi)膜組PTEN蛋白的表達(dá)明顯高于EECA組（P<0.01），與增生癥組相比也有顯著差異（P<0.01）；P27蛋白在正常內(nèi)膜組中的表達(dá)明顯高于 EECA 組（P<0.01），見表 2。

表2 PTEN與P27在子宮內(nèi)膜不同病變中的表達(dá)Tab 2 Expression of PTEN and P27 protein in differenthistological group

2.3 EECA中PTEN與P27蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 PTEN蛋白在不同分化程度的組織中表達(dá)有顯著性差異（P<0.05），而與年齡、手術(shù)病理分期、肌層浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性。P27蛋白在不同年齡組的表達(dá)之間有顯著性差異（P<0.01）；在不同手術(shù)病理分期中，Ⅰ~Ⅱ期的表達(dá)陽性率明顯高于Ⅲ~Ⅳ期,兩者之間存在顯著差異（P<0.05）。P27的表達(dá)與組織學(xué)分級,肌層浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)，見表3。

表3 EECA中PTEN和P27表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系Tab 3 The correlation of PTEN,P27 exp ression and clinicopathological features

2.4 P27與PTEN在EECA中表達(dá)的相互關(guān)系 由表4可以看出，在EECA中P27與PTEN的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。

表4 EECA中P27與PTEN表達(dá)的關(guān)系Tab 4 The correlation of PTEN and P27 immunostaining in EECA

3 討論

子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率逐年升高，依臨床病理特征將其分為雌激素依賴型（Ⅰ型），即EECA和非雌激素依賴型（Ⅱ型）。PTEN基因是Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌中突變率最高的基因，定位于10q23染色體,具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶雙重活性[3]。PTEN通過磷酸酶的活性使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化，負(fù)性調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)G1期阻滯及細(xì)胞凋亡[4]。PTEN還對細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）/絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信號(hào)途徑起負(fù)調(diào)節(jié)作用，抑制MAPK激酶的磷酸化,阻滯細(xì)胞生長周期于G1期，抑制腫瘤細(xì)胞生長[5]。同時(shí)，PTEN下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)mRNA的水平以影響其分泌,從而調(diào)控腫瘤血管生長，進(jìn)而影響其生長和轉(zhuǎn)移。PTEN基因N端序列與整合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體中的細(xì)胞骨架蛋白tensin有較高同源性，其突變失活形成配體—整合素—FAK—p130cas復(fù)合物，啟動(dòng)跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘連和遷移[6]。因此PTEN通過多種途徑參與細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及血管發(fā)生，其突變和失活與腫瘤的惡性進(jìn)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)PTEN在EECA中總的突變率為34%～80%[7]，突變的位點(diǎn)是磷酸酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)的半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸使磷酸酶活性全部喪失，影響蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的殘基。本實(shí)驗(yàn)觀察了52例子宮內(nèi)膜癌中PTEN的表達(dá)，27例（52%）為表達(dá)完全缺失；其中EECA45例，PTEN表達(dá)完全缺失占26例（57.8%）。在7例非EECA組織中僅有1例PTEN表達(dá)陰性，進(jìn)一步證實(shí)了兩型子宮內(nèi)膜癌發(fā)生機(jī)制的不同。本研究中，PTEN表達(dá)陽性率在正常增生期子宮內(nèi)膜組、增生癥組和EECA組中呈漸進(jìn)下降，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在單純增生過長子宮內(nèi)膜或復(fù)雜增生過長子宮內(nèi)膜中可見少量不等的PTEN表達(dá)陰性的腺體散在于陽性腺體中間；而在不典型增生內(nèi)膜組織中，PTEN陰性腺體居多；在EECA合并有PTEN表達(dá)陰性的不典型增生內(nèi)膜組織中，所有內(nèi)膜癌腺體也都無PTEN蛋白表達(dá)。這種PTEN蛋白在不同子宮內(nèi)膜病變組織中表達(dá)的漸變，提示PTEN陰性細(xì)胞克隆的擴(kuò)增可能是在子宮內(nèi)膜增殖過程中進(jìn)行的[8]。這也佐證了PTEN蛋白表達(dá)缺失可能是子宮內(nèi)膜癌病變的早期分子事件。目前，關(guān)于PTEN基因突變與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌的臨床病理特征之間的關(guān)系研究結(jié)果不一，楊琳琳等[9]發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的組織學(xué)分級和肌層浸潤有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白表達(dá)在高分化EECA中的表達(dá)陽性率明顯高于中-低分化，提示PTEN蛋白表達(dá)越低，腫瘤惡性程度越高，臨床預(yù)后越差。綜上，PTEN突變或表達(dá)缺失是Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌病變的早期分子事件，可能成為其早期診斷的一個(gè)生物學(xué)指標(biāo)。

P27基因是1994年P(guān)olyak等發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)控細(xì)胞周期并抑制細(xì)胞分裂的重要基因,定位于第12號(hào)染色體短臂1區(qū)3帶 (12p13),其編碼的蛋白P27kipl是一種非特異性多功能周期素依賴性激酶抑制劑（CDKI），通過抑制cyclin-CDK復(fù)合物的生物活性來調(diào)控細(xì)胞周期，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在G1/S期停滯[10]。P27在人類腫瘤中的突變罕見,多表現(xiàn)為基因缺失和蛋白表達(dá)的異常,Masciullo等[11]研究發(fā)現(xiàn)P27在子宮內(nèi)膜增殖過程中起到調(diào)控作用，其表達(dá)缺失是發(fā)展為子宮內(nèi)膜癌的重要一步。本研究中P27蛋白在正常子宮內(nèi)膜、增生癥組以及Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)陽性率呈梯度下降，反映了P27表達(dá)缺失是隨著由正常子宮內(nèi)膜發(fā)展為子宮內(nèi)膜癌的過程中不斷積累的。Ⅰ、Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中P27蛋白的表達(dá)差異顯著，P27蛋白在EECA中的表達(dá)位于細(xì)胞核內(nèi)；而在UPSC組織卻定位于胞漿。說明P27蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞核可能是其抑制腫瘤的前提條件[12]。Dellas等13]研究了225例子宮內(nèi)膜癌患者發(fā)現(xiàn)P27表達(dá)缺失與肥胖的EECA患者預(yù)后相關(guān)。本次研究EECA中P27蛋白表達(dá)隨著FIGO分期越晚和患者年齡越大其缺失率越高，提示P27與EECA預(yù)后相關(guān)。

P27作為細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控因子，以化學(xué)計(jì)量方式與cyclinE-CDK2，cyclinD-CDK4復(fù)合物緊密結(jié)合，抑制其活性。抑癌基因PTEN抑制細(xì)胞生長的作用機(jī)制之一即是可促使P27組裝進(jìn)cyclinE/CDK2復(fù)合物中并提交P27蛋白水平,使CDK2活性下降,阻止細(xì)胞通過G1→S限制點(diǎn)。Cheney等[14]發(fā)現(xiàn)PTEN誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯與P27的大量積聚有關(guān)，提出P27可能是PTEN通過PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞分化增殖，誘導(dǎo)G1期阻滯過程的下游靶基因。Erkanli等[15]通過研究29例EECA和38例子宮內(nèi)膜增生癥發(fā)現(xiàn)，P27與PTEN的表達(dá)呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，PTEN表達(dá)陰性的EECA中85%出現(xiàn)P27表達(dá)陰性，兩者的表達(dá)呈明顯正相關(guān)。進(jìn)一步提示EECA中P27可能是直接或間接的PTEN介導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯過程中的下游靶基因。

綜上所述，PTEN作為EECA中突變率最高的基因，其蛋白表達(dá)降低或缺失，是EECA發(fā)生的早期分子事件；P27kipl可能是PTEN介導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯過程中的下游靶基因，其蛋白表達(dá)缺失或降低可能與EECA患者臨床預(yù)后相關(guān)。檢測PTEN與P27的表達(dá)對于EECA早期診斷和預(yù)后判斷的意義尚待進(jìn)一步研究。

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