一株融合菌株G23產(chǎn)胞外多糖的流變學(xué)特性

張巖春，戴智勇，劉躍輝，李盛鈺，楊貞耐

（1.湖南澳優(yōu)食品與營養(yǎng)研究院，長沙410005；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，長春130033）

一株融合菌株G23產(chǎn)胞外多糖的流變學(xué)特性

張巖春1，2，戴智勇1，劉躍輝1，李盛鈺2，楊貞耐2

（1.湖南澳優(yōu)食品與營養(yǎng)研究院，長沙410005；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，長春130033）

融合菌株G23是由植物乳桿菌C88和發(fā)酵乳桿菌F6通過原生質(zhì)體融合獲得的菌株。采用動態(tài)流變儀，在不同多糖質(zhì)量濃度、溫度、pH值條件下測定融合菌株G23所產(chǎn)生的胞外多糖的流變學(xué)性質(zhì)。所產(chǎn)胞外多糖溶液是典型的非牛頓流體，胞外多糖質(zhì)量濃度的增大可提高溶液體系的黏度。在10～80℃的較大溫度范圍內(nèi)黏度變化較小，在所測溫度范圍內(nèi)溶液黏度基本保持不變。在不同pH值條件下，胞外多糖溶液均表現(xiàn)為剪切力作用下黏度迅速下降趨勢。胞外多糖加入脫脂乳溶液中能夠明顯的增加脫脂乳的黏度，且溶液的黏度下降變慢。在試驗的頻率范圍內(nèi)，隨著胞外多糖溶液質(zhì)量濃度的增加，對應(yīng)的交叉頻率的值相應(yīng)變大，膠體特征越明顯。

胞外多糖；融合菌株G23；流變學(xué)特性

0 引言

隨著我國乳品工業(yè)的迅速發(fā)展，乳酸菌胞外多糖將在乳品加工業(yè)中起到越來越重要的作用。在發(fā)酵過程中，乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖有利于改善產(chǎn)品的流變學(xué)特性，如提高產(chǎn)品的黏彈性、質(zhì)地和口感[1]。

乳酸菌胞外多糖能夠提高乳制品的流變學(xué)特性，能為生產(chǎn)廠家降低穩(wěn)定劑和增稠劑等添加劑用量，降低生產(chǎn)廠家的生產(chǎn)成本[2]。胞外多糖突變株G23產(chǎn)生的胞外多糖的流變學(xué)特性黏彈性好，抗機械破壞能力強，凝固敏感性低。能滿足發(fā)酵乳品的理想質(zhì)地及柔滑口感的要求。

通過測定胞外多糖突變株G23的胞外多糖溶液流變學(xué)特性受多糖濃度、剪切速率、作用溫度和多糖溶液pH值等因素[3]的影響，分析了該菌產(chǎn)生的胞外多糖的流變學(xué)特性變化，為提高乳酸菌胞外多糖在發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用效果和獲得優(yōu)良乳酸菌發(fā)酵劑菌株打下基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料與儀器

融合菌株G23（中國農(nóng)業(yè)科技東北創(chuàng)新中心），脫脂奶粉（恒天然公司），三氯乙酸和瓊脂糖凝膠（sigma公司），DEAE-纖維素（上海恒信公司），無水乙醇、苯酚、硫酸等均為分析純試劑。

AR-500動態(tài)流變儀，恒溫培養(yǎng)箱,真空冷凍干燥機，超低溫冰柜，紫外可見分光光度計，高壓蒸汽滅菌器,臺式高速離心機，超純水器,分析天平。

1.2 方法

1.2.1 胞外多糖提取

將融合突變菌株G23接入脫脂乳培養(yǎng)基，接種量為1%，pH值為6.5,溫度37℃，培養(yǎng)32 h后取樣，制取胞外多糖。

1.2.2 胞外多糖的分離純化

取融合突變菌株G23脫脂乳發(fā)酵樣品，用質(zhì)量濃度800 g/L的三氯乙酸(終質(zhì)量濃度為40 g/L)沉淀蛋白，在4℃下離心(10 000 r/min,15 min),去除沉淀蛋白質(zhì)和菌體,重復(fù)離心兩次，取上清液。2倍體積的無水乙醇加入上清液中，充分?jǐn)嚢杌旌? h，然后放置于4℃冰箱中過夜，用來沉淀胞外多糖。離心胞外多糖沉淀物，獲得粗制胞外多糖。用蒸餾水溶解粗制胞外多糖，再次4℃下離心，胞外多糖溶液用2倍體積的乙醇再次沉淀，然后4℃離心后冷凍干燥后保存[4]。

每次處理200 mg左右的干燥胞外多糖，用15 mL蒸餾水至完全溶解。胞外多糖溶液經(jīng)DEAE-纖維素離子交換柱(2.6 cm×30 cm)層析純化。胞外多糖溶液上樣到平衡好的DEAE-纖維素離子交換柱。按次序以蒸餾水,濃度為0.2 mol/L和0.5 mol/L的NaCl進行分批洗脫，流速為1 mL/min,收集器收集每管5 mL,按照測定值的正態(tài)分布吸收峰收集單峰樣品，裝入透析袋用蒸餾水透析，然后真空冷凍干燥。以水做流動相洗脫部分經(jīng)Sepharose CL-6B凝膠層析柱進一步分離純化。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液洗脫，流速為0.4 mL/min，洗脫液按照測定值的正態(tài)分布吸收峰收集后，經(jīng)透析袋透析后凍干，獲得精制胞外多糖，用于多糖的流變學(xué)特性分析。

1.3 胞外多糖的流變學(xué)分析

將先后經(jīng)過DEAE-纖維素離子交換和Sepharose CL-6B凝膠層析柱純化后的干燥精制胞外多糖用蒸餾水配制成試驗條件所需的溶液，室溫下磁力攪拌2h，用于多糖的流變學(xué)特性的測定。

1.3.1 質(zhì)量濃度對多糖流變學(xué)性質(zhì)的影響

用去離子水配制質(zhì)量濃度為3，5和10 g/L的胞外多糖溶液，測定各個質(zhì)量濃度胞外多糖溶液的黏度和剪切速率關(guān)系。測定條件：溫度25℃，錐板(40 mm，1°)，測定模式為流體，數(shù)據(jù)獲取模式為連續(xù)讀取，以剪切速率為自變量，范圍為0～300 s-1，掃描完成時間為10 min，變量掃描范圍設(shè)定為線性，獲得質(zhì)量濃度對胞外多糖流變學(xué)影響的變化曲線。

1.3.2 體系溫度對流變學(xué)性質(zhì)的影響

用去離子水配制質(zhì)量濃度為1 g/L的胞外多糖溶液，用流變儀測定并繪制胞外多糖溶液黏度隨溫度變化的曲線。測定條件：錐板(40 mm，1°)，測定模式為流體，數(shù)據(jù)獲取模式為溫度梯度升高，溫度掃描范圍為10～80℃，掃描完成時間為10 min，自變量為剪切速率，范圍為0-100 s-1，獲得溫度對胞外多糖流變學(xué)影響的變化曲線。

1.3.3 體系pH值對流動性質(zhì)的影響

用酸或堿調(diào)節(jié)多糖的去離子水溶液(質(zhì)量濃度為1g/L)體系的pH值，使之成為中性(pH值為7.0)，酸性(pH值為4.0)和堿性(pH值為10.0)狀態(tài)，流變儀測定酸堿度對胞外多糖溶液黏度的影響，測定條件為：溫度25℃，錐板(40 mm，1°)，測定模式為流體，數(shù)據(jù)獲取模式為連續(xù)讀取，以剪切速率為自變量，范圍為0～300 s-1，掃描完成時間為10 min，變量掃描范圍設(shè)定為線性，獲得胞外多糖溶液pH值對溶液流變學(xué)性質(zhì)影響的變化曲線。

1.3.4 對脫脂乳溶液流變學(xué)性質(zhì)的影響

用去離子水配制質(zhì)量濃度為100 g/L的脫脂乳溶液，將胞外多糖以質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%加入脫脂乳溶液中，同時以不添加胞外多糖的脫脂乳做對照。測定添加胞外多糖的脫脂乳溶液和空白脫脂乳溶液的在剪切速率黏度變化時的溶液黏度變化。測定過程是在溫度為20℃，錐板(40 mm，1°)，測定模式為流體，數(shù)據(jù)獲取模式為連續(xù)讀取。以剪切速率為自變量，變量范圍為0～100 s-1，變量掃描范圍為線性，獲得添加胞外多糖對脫脂乳溶液的流變學(xué)影響的變化曲線。

1.3.5 胞外多糖溶液的動態(tài)振蕩剪切試驗

質(zhì)量濃度分別為3，5和10 g/L的乳酸菌胞外多糖溶液的表觀黏度受剪切震蕩頻率影響的曲線。測定條件：錐板（40 mm，1°），測定模式為震蕩，,數(shù)據(jù)獲取模式連續(xù)讀取，溫度20℃，剪切時間10 min，控制變量為剪切震蕩頻率0～100 Hz。獲得不同質(zhì)量濃度胞外多糖溶液對溶液黏彈性影響的變化曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)量濃度對溶液流變學(xué)特性的影響

圖1為多糖溶液質(zhì)量濃度對溶液表觀黏度的影響。由圖1可以看出，在剪切速率范圍(0～300 s-1)內(nèi)，胞外多糖溶液的表觀黏度隨質(zhì)量濃度的加大而增高，在比較低的剪切速率范圍內(nèi)，不同質(zhì)量濃度的胞外多糖溶液均表現(xiàn)為溶液黏度隨剪切速率增加而減小的典型非牛頓流體的假塑性流動行為,而在比較高的剪切速率范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度為10，5和3 g/L的乳酸菌胞外多糖溶液在剪切速率不大時表現(xiàn)為溶液黏度隨剪切速率的增加而緩慢降低的假塑性流動行為，隨剪切速率的隨后增加而保持恒定的理想牛頓流體行為。這個結(jié)果和藍(lán)藻ATCC 33047產(chǎn)生的多糖表現(xiàn)的非牛頓流體的假塑性流動行為類似[5]。

圖1 質(zhì)量濃度對溶液表觀黏度的影響

2.2 溫度對多糖溶液流變學(xué)特性的影響

圖2為多糖溶液溫度對溶液黏度的影響。由圖2可知，在剪切速率范圍(0～100 s-1)內(nèi)乳酸菌胞外多糖溶液的黏度隨著溫度的上升而變化，在10～80℃的溫度范圍內(nèi)1.0%的乳酸菌胞外多糖溶液的黏度都是比較穩(wěn)定的。因為在這樣大的溫度范圍內(nèi)黏度變化不大，說明這種乳酸菌胞外多糖可以適應(yīng)需要加熱而保持黏度相對穩(wěn)定的操作過程。而Moreno等人[6]研究發(fā)現(xiàn)，一種新型庭薺種子膠的30 g/L質(zhì)量濃度溶液隨溫度的升高（5～65℃）黏度下降明顯。

圖2 溫度對溶液黏度的影響

2.3 pH值對胞外多糖流動性質(zhì)的影響

圖3為多糖溶液pH值對溶液黏度的影響。由圖3可以看出，質(zhì)量濃度為10 g/L的乳酸菌胞外多糖溶液在pH值發(fā)生變化時，黏度變化較穩(wěn)定，即在pH值為4～10范圍內(nèi)有很好的酸堿耐受能力。乳酸菌胞外多糖溶液的黏度值基本不隨著溶液酸堿度的改變而變化，說明該乳酸菌胞外多糖能夠適應(yīng)各種酸堿體系環(huán)境，拓寬了該乳酸菌胞外多糖的適用范圍和應(yīng)用潛力。郭守軍等人[7]研究發(fā)現(xiàn)，龍須菜多糖溶液在pH值在5～11之間，其黏度也基本穩(wěn)定，在酸性溶液中，pH值為3～4時黏度還略有增加。

2.4 對脫脂乳溶液流變學(xué)性質(zhì)的影響

圖4為胞外多糖對脫脂乳溶液黏度的影響。由圖4可以看出，突變菌株G23產(chǎn)生的胞外多糖對脫脂乳的質(zhì)地影響顯著。添加質(zhì)量濃度為10 g/L胞外多糖的脫脂乳溶液的黏度比不添加胞外多糖的脫脂乳溶液的黏度顯著提高，隨著剪切速率的增大，溶液的黏度快速下降，顯現(xiàn)出明顯的剪切變稀作用。有研究表明，乳酸菌胞外多糖作為質(zhì)地改良劑，能夠明顯提高乳產(chǎn)品的黏度，還能夠通過與乳成分如蛋白質(zhì)膠粒相互作用，從而增強酪蛋白網(wǎng)絡(luò)的剛性和穩(wěn)定性[8]。

2.5 動態(tài)振蕩剪切實驗

圖3 pH值對溶液黏度的影響

圖4 多糖對脫脂乳溶液黏度的影響

圖5為不同質(zhì)量濃度多糖溶液震蕩剪切實驗結(jié)果。由圖5可以看出，對多糖溶液施以一定的剪切應(yīng)力，乳酸菌胞外多糖表現(xiàn)出粘彈特性，即同時具有固體和液體的性質(zhì)。儲能模量G’(描述固體特性，即彈性)和損耗模量G”(描述液體特性，即黏度)的大小隨胞外多糖所處的狀態(tài)不同而不同。隨著剪切振動頻率升高(0～100 Hz)，G’和G”同時升高，并在達到一定頻率時G’和G”曲線相交，交點處頻率稱為交叉頻率。在剪切振動頻率低于交叉頻率時，胞外多糖主要表現(xiàn)為液體黏性性質(zhì)，即G”＜G’。而當(dāng)剪切振動頻率超過交叉頻率時，胞外多糖更多地表現(xiàn)出固體彈性性質(zhì)，即G’＞G”。在試驗范圍內(nèi)，隨著胞外多糖溶液質(zhì)量濃度的提高，交叉頻率值也隨之變大，這說明隨著胞外多糖質(zhì)量濃度的提高，胞外多糖溶液的膠體化程度越高，表現(xiàn)出更多的固體彈性性質(zhì)。Gorret等人[9]研究了由丙酸菌ATCC 25562產(chǎn)生的多糖的溶液粘彈性，配制水溶液分別為4，8和18 g/L的胞外多糖溶液的質(zhì)量濃度，得出了胞外多糖質(zhì)量濃度越高，胞外多糖溶液的膠體化程度越大的類似研究結(jié)果。

圖5 多糖溶液震蕩剪切實驗結(jié)果

3 結(jié)論

（1）融合菌株G23胞外多糖溶液是典型的非牛頓流體，溶液表觀黏度隨剪切速率的增大而降低，隨著多糖質(zhì)量濃度的升高黏度也增大，剪切稀釋現(xiàn)象趨勢一致。

（2）融合菌株G23產(chǎn)的胞外多糖具有很好的熱穩(wěn)定性，隨著剪切時間的延長，溶液黏度下降較緩慢；在酸堿性環(huán)境條件下，多糖的黏度變化趨勢十分一致且相對穩(wěn)定。

（3）融合菌株G23多糖能夠提高脫脂乳的黏度，但隨著剪切速率的提高，添加胞外多糖的脫脂乳溶液的黏度下降變慢。

（4）隨著胞外多糖溶液質(zhì)量濃度的增加，對應(yīng)的交叉頻率的值相應(yīng)變大，說明該胞外多糖溶液質(zhì)量濃度越高，膠體特征越明顯。

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Rheological properties of the exopolysaccharide produced by fusion strains G23

ZHANG Yan-chun1，2,DAI Zhi-yong1,LIU Ye-hui1,LI Sheng-yu2,YANG Zhen-nai2
(1.Food and Nutritional Institute of Hunan Ausnutria,Changsha 410005,China；2.Center of Agro-food Technology,Jilin Academy of Agricultural Sciences,Changchun 130033,China)

Fusion strain G23 was obtained by protoplast fusion of Lactobacillus plantarum C88 and Lactobacillus fermentum F6.The solution rheology of exopolysaccharide produced by fusion of strain G23 was measured by dynamic rheometer at different polysaccharide concentration,temperature,pH values.The exopolysaccharide solution is a typical non-Newtonian fluid.The increasing the concentration of extracellular polysaccharides can improve the viscosity of aqueous solution.The viscosity of extracellular polysaccharide solution produced by fusion mutants G23 had little change at the range of 10～80℃,the extracellular polysaccharide display a thermal stability properties in the measured temperature range.And the viscosity of the extracellular polysaccharide solution remained unchanged with the shearing time extension.In different pH values,the extracellular polysaccharide solution showed the rapid decline when the shear rate increased.The skim milk solution by adding exopolysaccharide can significantly increase the viscosity,and with the shear rate increases,the decrease rate of viscosity of skim milk added exopolysaccharide became slow.In the measured frequency range,with the increasing concentration of exopolysaccharide increased the corresponding value of the crossover frequency,which meant that the higher the concentration of exopolysaccharide solution showed the more obvious colloid features.

exopolysaccharide；fusion strains G23；rheological properties

Q936

A

1001-2230（2011）02-0021-03

2010-09-08

張巖春(1976-),男,博士研究生,研究方向為畜產(chǎn)品加工。