感染CDV的犬病料N、H、F基因的克隆與序列分析

劉巧榮，包新奇，孫 明，王 芳，喬明明，李 佳，陳曦，秦亞嫚，陳西釗，2

(1.北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司，北京 100085;2.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100085;3.江蘇省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，南京 210036)

感染CDV的犬病料N、H、F基因的克隆與序列分析

劉巧榮1，包新奇3，孫 明1，王 芳1，喬明明1，李 佳1，陳曦1，秦亞嫚1，陳西釗1，2

(1.北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司，北京 100085;2.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100085;3.江蘇省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，南京 210036)

目的 了解病料中犬瘟熱病毒(CDV)的變異情況，為犬瘟熱的預(yù)防與治療提供理論依據(jù)。方法 采用RT-PCR方法對(duì)犬病料中CDV的血凝素蛋白(H)、融合蛋白(F)和核衣殼蛋白(N)基因進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGEM-T-easy載體中測(cè)序，并進(jìn)行序列分析。結(jié)果 測(cè)定一株 CDV的 H、F和 N基因大小分別為1863 bp、1653 bp和2235 bp。同源性分析表明，未發(fā)現(xiàn)堿基的插入和缺失。該病毒的 H、F和 N基因分別與國(guó)內(nèi)強(qiáng)毒株BJ080127株的H基因、GN株的F基因和HL株的N基因親緣關(guān)系最近，氨基酸同源性分別為97.3%、97.7%和99.3%。與國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)野毒株A75-17在核苷酸水平上同源性依次為94.4%、93.8%和97.2%，與疫苗株CDV3在核苷酸水平上同源性分別為88.5%、88.8%和93.9%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明該病毒與國(guó)內(nèi)強(qiáng)毒株在同一譜系。糖基化分析顯示，該病毒在F基因3～5位氨基酸處多出1個(gè)糖基化位點(diǎn)。結(jié)論 本研究從犬病料中成功克隆了犬瘟熱病毒血凝素蛋白、融合蛋白和核衣殼蛋白，在F基因中新增了一個(gè)糖基化位點(diǎn)，為犬瘟熱的遺傳變異和流行學(xué)研究提供了分子生物學(xué)依據(jù)。

犬瘟熱;血凝素蛋白基因;融合蛋白基因;核衣殼蛋白基因;序列分析S

犬瘟熱(canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病。該病毒屬于副粘病毒科、麻疹病毒屬的單股負(fù)鏈RNA病毒。在自然狀態(tài)下感染犬科、鼬科、浣熊科等多種動(dòng)物。是養(yǎng)犬業(yè)、毛皮獸養(yǎng)殖業(yè)的主要傳染病。目前，CDV自然感染的動(dòng)物范圍還有不斷擴(kuò)大的趨勢(shì)，甚至已擴(kuò)展到偶蹄目豬科及靈長(zhǎng)類(lèi)獼猴屬等動(dòng)物［8］。也有日本學(xué)者報(bào)道 CDV可感染人［1］，其危害越來(lái)越大。因此，本研究對(duì)CDV的有效防治具有重要意義。

CDV基因組全長(zhǎng)15690 bp，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核衣殼蛋白(N)、膜蛋白(M)、磷蛋白(P)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)、大蛋白(L)。其中F、H和N蛋白是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，在機(jī)體免疫原性與致病性上發(fā)揮著重要作用。本研究從感染CDV的犬病料中克隆出N、H、F基因，與國(guó)內(nèi)外的CDV毒株進(jìn)行遺傳關(guān)系比較，旨在分析其在基因水平上發(fā)生的遺傳變化，為CDV基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)的豐富和CDV分子流行病學(xué)的深入研究提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病料和毒株

病料由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院提供。2008年12月，1只3月齡喜樂(lè)蒂犬，臨床癥狀有疑似犬瘟熱，經(jīng)過(guò)RT-PCR方法和膠體金試劑盒檢測(cè)為陽(yáng)性，確診為犬瘟熱。

1.2 載體、菌株和主要試劑

pGEM-T-Easy載體購(gòu)自于Promega公司，JM109感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自于北京全式金生物技術(shù)有限公司。EX-Taq酶為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品，總RNA提取試劑盒為Bioflux公司產(chǎn)品，膠回收試劑盒為Omega產(chǎn)品。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Genbank上發(fā)表的CDV全基因序列，針對(duì)N、F、H蛋白的全基因分別設(shè)計(jì)3對(duì)引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成：

N-P1：5′-GCCTTCTTAARAGCCT-3′

N-P2：5′-TTGTTGGACCTGGGTCCTAAGT-3′

擴(kuò)增N基因

F-P1：5′-TAATCAAAACTTAGGGTCCAGGA-3′

F-P2：5′-CTACCTGAGCCCTAAGTTTTCT-3′

擴(kuò)增F基因

H-P1：5′-GCTCAGGTAGTCCARCAATGCT-3′

H-P2：5′-GARATGTGTATCATYATACTGTCA-3′

擴(kuò)增H基因。

1.4 RNA的提取

將犬瘟熱病料的肺組織研磨成勻漿，8 000 r/min 離心 4 min，取上清液 100 μL，按照 Bioflux RNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取病毒總RNA。

1.5 RT-PCR反應(yīng)

25 μL反應(yīng)體系中加入DEPC處理的滅菌雙蒸水 12.5 μL，5 × PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.5 μL，10 pmol/L 引物 1.5 μL，AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.2 μL(10 U/μL)，RNA 酶抑制劑 0.3 μL(40 U/μL)，TaqDNA 聚合酶 1 μL(5 U/μL)，模板 2 μL。PCR 擴(kuò)增程序如下，42℃ 1 h，95℃ 3 min;95℃ 45 s，退火溫度分別為 44℃ 、46℃ 、50℃ 和 52℃ ，72℃ 90 s，各 10循環(huán);72℃擴(kuò)增10 min。

1.6 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及測(cè)序

RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用膠回收試劑盒回收純化擴(kuò)增的目的基因片段，按照pGEM-T easy載體操作手冊(cè)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。用PCR篩選陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 目的基因序列同源性分析與比較

應(yīng)用DNAman和DNAStar生物軟件分析目的基因序列，并將N、F、H基因序列和推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank上的CDV代表毒株進(jìn)行同源性分析比較，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

用設(shè)計(jì)的3對(duì)引物對(duì)感染肺組織的RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到了與N、F、H設(shè)計(jì)大小一致的目的片段，其片段長(zhǎng)度分別約為1 600 bp、2 200 bp和1 800 bp。與預(yù)期大小一致(圖1)，將病毒命名為CDV-WZ。

2.2 克隆鑒定和測(cè)序結(jié)果

重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定顯示，成功將3個(gè)基因片段克隆到pGEM-T-Easy載體中。陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序表明，擴(kuò)增的H、F和N大小分別為1 863 bp、2 235 bp和1 653 bp，未發(fā)現(xiàn)堿基的插入和缺失。

2.3 序列同源性分析結(jié)果

N基因與Genbank中22株CDV毒株在核苷酸水平上同源性為(CDV3)93.3% ～97.4%(HL)，氨基酸水平上同源性為(CDV3)96.9%～99.3%(HL)。該 CDV-WZ和國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)野毒株 A75-17和5804核苷酸水平上同源性為97.2%和96.3%，氨基酸水平同源性為98.5%和97.7%;與國(guó)外疫苗株Onderstepoort核苷酸水平上同源性為93.9%，氨基酸水平同源性為97.1%，表明該病毒N基因相對(duì)保守，變異小。

F基因與其他CDV毒株在核苷酸水平上同源性為(CDV3和 Onderstepoort)88.8% ～98.7%(GN和SC01)，氨基酸水平上同源性為(Onderstepoort)89.0% ～98.8%(TW-TN1)。該 CDV-WZ和野毒株Strain A75-17和Strain 5804核苷酸水平上同源性為93.8%和93.1%，氨基酸水平同源性均為93.5%;與標(biāo)準(zhǔn)疫苗株Onderstepoort核苷酸水平上同源性為88.8%，氨基酸水平同源性為89.0%。另外，由 F基因推導(dǎo)的氨基酸分析表明，F(xiàn)蛋白含有13個(gè)半胱氨酸殘基，7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。

H基因與其他CDV毒株在核苷酸水平上同源性為(Onderstepoort和 Vaccine strain Japan)88.1%～97.6%(BJ080127)，氨基酸水平上同源性為(Convac vaccine strain)89.1% ～97.3%(BJ080127)。該CDV-WZ和野毒株Strain A75-17和Strain 5804核苷酸水平上同源性為94.4%和93.8%，氨基酸水平同源性為94.4%和94.1%;與疫苗株Onderstepoort和 Strain CDV3核苷酸水平上同源性為88.1%和88.5%，氨基酸水平同源性為89.7%和90.1%。另外，H蛋白氨基酸分析結(jié)果顯示，H半胱氨酸殘基數(shù)目及位置是保守的，沒(méi)有變化，為13個(gè);糖基化位點(diǎn)為9個(gè)。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

將N、H、F三段基因推斷的氨基酸序列和相應(yīng)代表株進(jìn)行比對(duì)，利用DNAman軟件繪制進(jìn)化樹(shù)，在系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上可分為強(qiáng)毒和弱毒兩大譜系。CDV-WZ位于強(qiáng)毒株譜系，與國(guó)內(nèi)外使用疫苗株親緣關(guān)系很遠(yuǎn)，可能對(duì)CDV免疫保護(hù)效果有一定影響。

圖2 N基因氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.2 Phylogenetic tree of the N gene amino acids

N蛋白與其他CDV毒株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，CDV-WZ與2007年黑龍江從狐貍分離的 HL強(qiáng)毒株在一個(gè)分支。F蛋白與其他毒株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明(圖3)，CDV-WZ和黑龍江2007年從浣熊分離的強(qiáng)毒株GN強(qiáng)毒株歸為一組。而從H基因推導(dǎo)的氨基酸系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上看，CDV-WZ和北京新分離的BJ080127強(qiáng)毒株在同一分支，與遼寧2007年從浣熊分離的LN(07)1、山東2008年從狐貍分離的SD(08)1以及GN毒株在同一大的分組;同時(shí)與近幾年分離的 HeB(07)1、JL(08)1、HLJ(08)2強(qiáng)毒株也很接近。

從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以看出，最新分離的毒株通常在進(jìn)化樹(shù)的末端，但也有例外的，如山東2008年從狐貍分離的HT-P毒株就在進(jìn)化樹(shù)的較前部(圖4)。這基本說(shuō)明CDV各毒株在不斷地發(fā)生新的變異。從地域來(lái)看，國(guó)外和國(guó)內(nèi)毒株還是存在較大差異，這可能與環(huán)境、原始毒株以及不同的選擇免疫壓力有關(guān)。從國(guó)內(nèi)來(lái)看，南北差異不大，如新疆2003年分離的 TN、浙江2008年分離的 HZ026、湖北2006年分離的 BS0610、HLJ(08)2、JL(08)1以及 HeB(07)1又在同一大的分支上(圖3和圖4)。此外，從不同種動(dòng)物分離的毒株間的差異也在不斷縮小。這可能與近年來(lái)區(qū)域間的頻繁交流、不同動(dòng)物的混養(yǎng)等有較大的關(guān)系。

圖3 F基因氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 Phylogenetic tree of the F gene amino acids

圖4 H基因氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree of the H gene amino acids

3 討論

N蛋白是保守性最強(qiáng)的免疫原性蛋白，含有B細(xì)胞和T細(xì)胞表位，在診斷和細(xì)胞免疫方面發(fā)揮著重要作用，對(duì)病毒裝配、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程起調(diào)控作用。F蛋白介導(dǎo)囊膜和細(xì)胞膜融合，決定病毒在宿主體內(nèi)擴(kuò)散的能力，盡管該基因相對(duì)保守，但其微小的改變會(huì)對(duì)CDV毒力強(qiáng)弱產(chǎn)生影響。H蛋白位于病毒粒子的表面，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原之一，同時(shí)，H蛋白決定著病毒感染宿主的特異性，并協(xié)助F蛋白使 CDV進(jìn)入宿主細(xì)胞［6，7］。故H蛋白基因成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究CDV遺傳變異規(guī)律的首選基因［14，15］。

本研究病毒的F和H基因分別與Strain BS0610、Strain GN、Strain SC01、Strain TW-TN1 和BJ080127、Hamamatsu、HB062、TN 有較高的同源性，在系統(tǒng)分類(lèi)上與野毒株較近，屬于強(qiáng)毒株。用本研究病料接種45日齡健康比格犬，出現(xiàn)了明顯的雙相熱，并出現(xiàn)了100%的死亡率，充分驗(yàn)證了CDV-WZ為強(qiáng)毒。F、H基因及其推導(dǎo)的氨基酸和國(guó)內(nèi)外疫苗株的同源性均較低，有可能對(duì)犬瘟熱免疫保護(hù)有一定影響。這與王君瑋等對(duì)狐、貉和水貂源共5株CDV野毒和疫苗株部分H基因氨基酸序列分析的結(jié)果相類(lèi)似［2］。近幾年日本免疫犬暴發(fā)了犬瘟熱，經(jīng)研究表明，可能與H蛋白抗原性變化有關(guān)［9］。

H蛋白屬于典型的II型糖蛋白，在病毒的吸附和侵入宿主細(xì)胞過(guò)程中起重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道，所有CDV野毒株H蛋白均存在8～9個(gè)潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，而疫苗株為4個(gè)(Onderstepoort株)或7個(gè)(Convac株)，H蛋白N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)的差異可能影響病毒的抗原性［8，9］。另有研究證實(shí)，在麻疹病毒屬所有結(jié)構(gòu)蛋白中，H蛋白基因變異最大［9，11-13］，抗原變化最大［15］。在免疫壓力作用下，CDV抗原表位可能發(fā)生漂移，較大的H蛋白極易發(fā)生變異，從而引起 CDV 毒力的變化［16，17］。H 蛋白作為誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要保護(hù)性抗原，其抗原性的改變很可能導(dǎo)致CDV野毒逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，共同特征之一是造成CDV在不同種動(dòng)物之間，不同地區(qū)以不同毒株的形式大面積爆發(fā)［18］。

在CDV所有結(jié)構(gòu)蛋白中，N蛋白是保守性最強(qiáng)的免疫原性蛋白。N蛋白在337～358位或者1～80位的氨基酸存在B細(xì)胞表位，其中1～80位氨基酸是N蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核所必需的［1］。281～289位即Y P A L G L H E F連續(xù)9個(gè)氨基酸高度保守，是T細(xì)胞表位，在細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要的功能［10］。Pascal Cherpillod等［19］證實(shí)CDV N蛋白可以刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)，當(dāng)H和F蛋白的特異性抗體低于檢測(cè)水平時(shí)，N蛋白的特異性抗體仍可以檢測(cè)到，這也揭示出N蛋白在CDV感染的檢測(cè)中具有重要的意義。本研究克隆了整個(gè)開(kāi)放閱讀框，核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸同源性分析顯示，N蛋白的保守性較H和F蛋白高，進(jìn)一步驗(yàn)證了N蛋白較高的保守性。

F蛋白是典型的 I型糖蛋白，在病毒侵入機(jī)體和刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)性反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能阻止病毒感染，抑制犬瘟熱臨床癥狀產(chǎn)生。F蛋白的 T細(xì)胞表位(288～302aa)和B細(xì)胞表位(404～414aa)構(gòu)成嵌合多肽，能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)［3，4］。研究發(fā)現(xiàn)該蛋白基因相對(duì)比較保守［5］，在診斷上亦具有一定的價(jià)值。在CDV-WZ的F蛋白中，對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)起著重要作用的13個(gè)Cys殘基位置與其它毒株一致，對(duì)蛋白的裂解、穩(wěn)定性和生物學(xué)活性都很重要的4個(gè)潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)也完全保守。與其它大部分CDV毒株(糖基化位點(diǎn)4～6個(gè))相比，在 CDV-WZ氨基酸的3～5位置多出了1個(gè)糖基化位點(diǎn)。這對(duì)F抗原性的影響還有待進(jìn)一步的研究。

［1 ］ Yoshida E，Iwatsuki K，Miyashita N，et al.Molecular analysis of the nucleocapsid protein of recent isolates of canine distemper virus in Japan ［J］.Vet Microbiol，1998，59(2-3)：237-244.

［2］ 王君瑋，姜平，王志亮，等.貂、狐、貉源犬瘟熱病毒分離株 H和N基因的遺傳多樣性分析［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30(4)：108-113

［3］ Obeid OE，Partidos CD，Howard CR，et al.Protection against morbillivirus-induced encephalitis by immunization with a rationally designed synthetic peptide vaccine containing B-and T-cell epitopes from the fusion protein of meales virus［J］.J Gen Virol，1995，69(3)：1420-1428.

［4 ］ Barret T，Clorke DK，Evons SA，et al.The nucleotide sequence of gene encoding the F protein ofcanine distempervirus：a comparison of the deduced amino acid sequence with other paramyxovirus［J］.Virus Res，1987，8：373-386.

［5］ Merz DC，Seheid A，Choppin PW，et al.Importance of antibodies to the fusion glycoprotein of paramyxoviruses in the prevention of spread of infection［J］.J Exp Med，1980，15：275-288.

［6］ Kingsbury DW.Paramyxoviridae and their replication.In：B.N.Fields(Ed.)，F(xiàn)ield's Virology［M］.Raven Press，New York(1990)，945-962.

［7］ Wild TF.Mode of entry of morbilliviruses［J］.Vet Microbiol.1995，44：267-270.

［8］ Boit G，Jensen TD，Gottschalck E，et al.Genetic diversity of the attachment(H) protein gene of current isolates of canine distemper virus［J］.Gen Virol，1997，78：367-372.

［9］ Iwatsuki K，MiyashitaN，YoshidaE，etal. Molecularand phylogenetic analyses of the haemagglutinin(H)proteins of field isolates of canine distemper virus from naturally infected dogs［J］.Gen Virol，1997，78(2)：373-380.

［10］ Beauverger P，Buckland R，Wild TF.Measles virus antigens induce both type-specific and canine distemper virus crossreactive cytotoxic T lymphocyte in epitope［J］.J Gen Virol，1993，74：2357-2363.

［11］ Blixenkrone-M?ller M，Svansson V，Appel M，et al.Antigenic relationships between field isolates of morbillivimses from different carnivores［J］.Arch Virol，1992，123：279-294.

［12］ Blixenkrone-M?ller M，Svansson V，Have P，et al.Studies on manifestations of canine distemper virus infection in an urban dog population［J］.Vet Microbiol，1993，37：163-173.

［13］ Iwatsuki K，Tokiyoshi S，Hirayama N，et al.Antigenic difference in the H proteins of canine distemper viruses［J］.Vet Microbiol，2000，71：281-286.

［14］ Haas L，Martens W，Greiser-Wilke I，et al.Analysis of the haemagglutinin gene of current wild-type canine distemper virus isolates from Germany.Virus Res，1997，48：165-171.

［15］ Mochizuki M，Hasimoto M，Hagiwara S，et al.Genotypes of canine distemper virus determined by analysis of the hemagglutinin genes of recent isolates from dogs in Japan［J］.Clinical Microbiol，1999，37(9)：2936-2942.

［16］ 許莎瓊，朱建國(guó)，傅志強(qiáng)，等.犬瘟熱病毒當(dāng)前研究進(jìn)展［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，1：5-7.

［17］ 莫小見(jiàn)，郭愛(ài)珍，陸承平.犬瘟熱病毒南京株 H蛋白的克隆與表達(dá)［J］. 中國(guó)病毒學(xué)，2004，19(5)：487-489.

［18］ 趙建軍，閆喜軍，吳威.犬瘟熱病毒基因變異及其細(xì)胞受體研究進(jìn)展［J］. 微生物學(xué)報(bào)，2008，48(7)：986-991.

［19］ Cherpillod P，Tipold A，Griot-Wenk M，et al.DNA vaccine encoding nucleocapsid and surface proteinsoftype canine distemper virus protects its natural host against distemper［J］.Vaccine，2000，(18)：2927-2936.

Cloning and Sequence Analysis of Canine Distemper Virus N，F(xiàn) and H Genes from the Samples Infected with CDV

LIU Qiao-rong1，BAO Xin-qi3，SUN Ming1，Wang Fang1，QIAO Ming-ming1，LI Jia1，CHEN Xi1，QIN Ya-man1，CHEN Xi-zhao1，2
(1.Beijing ANHEAL Laboratories Co.Ltd，Beijing 100085，China;2.China Animal Disease Control Center，Beijing 100085;3.Jiangsu Animal Disease Control Center，Nanjing 210036，China)

Objective The aim of this study was to identify the variations of canine distemper viruses(CDV)obtained from clinical samples，and provide a theoretical basis for the prevention and control of CDV infection.Methods The segments of hemagglutinin protein(H)gene，fusion protein(F)gene and nucleocapsid protein(N)gene were amplified by RT-PCR.The amplicons were cloned into pGEM-T-easy vector and the recombination clones were sequenced.Subsequently，the nucleotide and amino acid sequences were analyzed.Results The nucleotide lengths of H，F(xiàn) and N genes for the virus were 1863 bp，1653 bp and 2234 bp，respectively.Sequence analysis did not present any nucleotide insertion or deletion.The three sequences determined in this study showed the high amino acid identities corresponding with three Chinese highly pathogenic CDV isolates BJ080127(H gene)，GN(F gene)and HL(N gene)，which were 97.3% ，97.7%and 99.3% ，respectively.Meanwhile，each of them displayed the nucleotide identity of 94.4% ，93.8%and 97.2% ，when compared with the CDV prototypic strain A75-17.In addition，comparing with the CDV vaccine strain CDV3，they displayed the nucleotide similarities of 88.5% ，88.8%and 93.9% ，respectively.The glycosylation sites analyses revealed a glycosylation site aimed at the 3～5 amino acids of F gene.The phylogenetic tree displayed that the virus had the closest relationship with the highly pathogenic CDV isolates identified in China.Conclusion In this study，we cloned the H，F(xiàn) and N genes of a CDV determined in canine samples and identified that the virus is a highly pathogenic CDV，which contains a novel glycosylation site in F gene.This study provides evidence in studies on the molecular mutation epidemiology of CDV infection.

Canine distemper virus;Hemagglutinin protein gene;Fusion protein gene;Nucleocapsid protein gene;Sequence analysis

R33

A

1671-7856(2011)04-0037-05

2010-10-12

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.04.009

劉巧榮(1979-)女，碩士。主要研究方向：動(dòng)物疫病診斷。

陳西釗，博士，研究員，Email：chenxizhao@anheal.com。