• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    酸性植酸酶產生菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件研究

    2011-10-18 04:17:16文,王
    食品科學 2011年5期
    關鍵詞:植酸酶植酸黑曲霉

    李 文,王 陶

    (徐州工程學院食品(生物)工程學院,江蘇 徐州 221008)

    酸性植酸酶產生菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件研究

    李 文,王 陶

    (徐州工程學院食品(生物)工程學院,江蘇 徐州 221008)

    從土壤中篩選到一株產酸性植酸酶酶活較高的菌株,初步鑒定為黑曲霉,菌株最優(yōu)發(fā)酵條件為:麩皮3g/100mL、(NH4)2SO4 0.5g/100mL、發(fā)酵液初始pH5.5、發(fā)酵時間84h,酶活力可達12.06U/mL。對其粗酶液的酶學性質研究表明:該酶最適作用pH值為5左右,最適溫度是45℃;該酶在55℃保溫30min后酶活力保留在60%左右;在酸性和中性條件下有一定的穩(wěn)定性;金屬離子Ca2+、 Fe2+、Na+、K+、Zn2+、Cu2+對酶有一定的抑制作用,Mg2+、Ba2+對酶有一定的激活作用。

    酸性植酸酶;篩選;發(fā)酵;酶學性質

    近年來,飼用酶制劑以其高效、安全、低成本等特點,已成為飼料添加劑研究和應用的熱點[1]。植酸酶就是其中之一。谷物飼料中50%~70%的磷是以植酸鹽(肌醇六磷酸鹽)的形式存在,單胃動物不能或很少分泌分解植酸的酶,使得人和動物內鈣、鎂、鐵、鋅等微量礦物質元素失衡[2-3],植酸直接排出體外,又可導致水體的富營養(yǎng)化,對環(huán)境造成嚴重的磷污染[4-6]。植酸酶(EC.3.1.3.8)可催化肌醇六磷酸(鹽或酯)脫掉磷酸基團[7],從而提高飼料中磷的利用率,減少磷的排放,解除植酸鹽的抗營養(yǎng)作用[8-9]。目前,植酸酶已經(jīng)開始試用在植物性食品中,達到分解植酸磷,平衡營養(yǎng)的作用[10]。

    植酸酶廣泛存在于動植物組織和微生物細胞中。產植酸酶的微生物有細菌、酵母和真菌等[7]。由于來源于

    微生物的植酸酶作用范圍和穩(wěn)定性較好,易規(guī)?;a,近幾年的研究大都集中在微生物來源植酸酶[11]。根據(jù)最適pH值的不同,植酸酶可分為酸性植酸酶、中性植酸酶和堿性植酸酶[12],其中,酸性植酸酶的酶促反應的pH值有效作用范圍在2.5~5.5之間,適用于胃pH值呈酸性的單胃動物以及少數(shù)魚類如虹鱒等[13],能有效作用于單胃動物的消化道。故此,本實驗擬從徐州地區(qū)的土壤中分離篩選產酸性植酸酶酶活較高的菌株,對其進行鑒定,并研究其酶學性質和發(fā)酵條件,以期為酸性植酸酶的應用提供實驗基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    土樣:采自徐州市樹林、菜地、動物園等處。

    植酸鈣 丹徒第一化工廠;植酸鈉 美國Sigma公司;四水合鉬酸銨 合肥工業(yè)大學化學試劑廠;三氯乙酸 天津市河東區(qū)紅巖試劑廠;苯酚 天津市永大化學試劑開發(fā)中心;其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設備

    HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠;HYG旋式恒溫調速搖瓶柜 上海欣蕊自動化設備有限公司;DL-5低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠;TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

    1.3 方法

    1.3.1 酸性植酸酶產生菌的初篩

    1.3.1.1 初篩培養(yǎng)基

    植酸鈣1g/100mL、葡萄糖3g/100mL、NH4NO30.5g/100mL、KCl 0.05g/100mL、MgSO4·7H2O 0.05g/100mL、MnSO4·H2O 0.0018g/100mL、FeSO4·7H2O 0.003g/100mL、瓊脂1.5g/100mL,pH5.5。同時制作pH4.5、pH3.5和pH2.5的初篩培養(yǎng)基。

    1.3.1.2 初篩過程

    取5g土樣于45mL有玻璃珠的無菌生理鹽水,于100r/min的搖床上振蕩30min,靜置,取上清液原液以及10-1、10-2的稀釋液涂布初篩平板,于28℃條件下培養(yǎng)3~5d,從第24小時起以每12h觀察透明圈產生情況,挑取透明圈直徑與菌落直徑比大的菌落于查氏培養(yǎng)基斜面(29±1)℃培養(yǎng)3~5d。

    1.3.2 酸性植酸酶產生菌的復篩

    1.3.2.1 復篩培養(yǎng)基

    葡萄糖3g/100mL、(NH4)2SO40.2g/100mL、蛋白胨0.3g/100mL、KCl 0.05g/100mL、MgSO4·7H2O 0.05g/100mL、MnSO4·H2O 0.0018g/100mL、FeSO4·H2O 0.003g/100mL,pH5.5。

    1.3.2.2 復篩過程

    將菌株接種于錐形瓶中,于28℃、150r/min搖床培養(yǎng)3d。

    1.3.3 酸性植酸酶活性的測定

    植酸酶活性的測定參照文獻[14]的方法進行。

    酶活力單位定義:在溫度37℃、pH5.5條件下,每分鐘從濃度為5.0mmol/L植酸鈉溶液中釋放lμmol無機磷即為一個植酸酶活性單位,以U表示。

    1.3.4 菌種遺傳穩(wěn)定性檢測

    將高產菌株連續(xù)傳6代,分別搖瓶發(fā)酵測酶活力,檢測菌株的遺傳穩(wěn)定性。

    1.3.5 菌種的初步鑒定

    觀察菌落形態(tài)及菌絲形態(tài),依據(jù)《真菌鑒定手冊》鑒定菌種。

    1.3.6 發(fā)酵條件的優(yōu)化

    1.3.6.1 碳源種類的優(yōu)化

    考察葡萄糖、蔗糖、乳糖、麩皮對酶活力的影響,取酶活力最大值所對應的碳源為最適碳源。

    1.3.6.2 碳源質量濃度的優(yōu)化

    考察質量濃度分別為2、3、4、5、6g/100mL的碳源對酶活力的影響,取酶活最大值所對應的質量濃度作為最適碳源質量濃度。

    1.3.6.3 氮源質量濃度的優(yōu)化

    改變(NH4)2SO4的質量濃度為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7g/100mL,分別進行酶活力測定,取酶活力最大時所對應的條件作為最適氮源質量濃度。

    1.3.6.4 培養(yǎng)基初始pH值的優(yōu)化

    考察培養(yǎng)基初始pH值為3、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7對酶活力的影響,取酶活力最大值所對應的pH值為發(fā)酵最適初始pH值。

    1.3.6.5 培養(yǎng)時間的優(yōu)化

    從第24小時開始,每12h進行酶活力測定,以酶活力最高時的時間為最優(yōu)發(fā)酵時間。

    1.3.7 酸性植酸酶的酶學性質

    1.3.7.1 酶作用的最適pH值

    將植酸鈉溶液用緩沖液配制成不同的pH值(1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0)作為底物進行酶促反應,測定粗酶液的酶活。以最高酶活力為100%,在其他條件的酶活力占最高酶活力的百分數(shù)即為該酶在此pH值條件的相對酶活力。最高酶活力時的pH值即為最適pH值。

    1.3.7.2 酶的pH值穩(wěn)定性

    采用不同pH值(1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0)的緩沖液在37℃條件下處理酶溶液30min和60min,然后調回最適pH值,在常規(guī)條件下測定酶活力,并計算相對酶活力,考察酶在37℃條件下的pH值穩(wěn)定性。

    1.3.7.3 酶作用的最適溫度

    在不同溫度條件下(25、35、37、45、55、65、75℃)進行酶促反應,測定酶活力。最高酶活力時的溫度即為酶作用的最適溫度。

    1.3.7.4 酶的熱穩(wěn)定性

    在不同溫度條件下(35、45、50、55、60、65℃)處理粗酶液30min和60min,再在37℃條件下進行酶活力測定。

    1.3.7.5 金屬離子對酶活力的影響

    在植酸鈉溶液中添加質量濃度為0.1g/100mL的CaCl2、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、FeSO4、NaCl、KCl、Ba(OH)2,測定酶活力。研究金屬離子對酶活力的影響。

    2 結果與分析

    2.1 酸性植酸酶產生菌的篩選與鑒定

    圖1 初篩的透明圈Fig.1 Transparent circles observed in primary screening of strains

    對學校及學校周圍的林場、菜地等多處取樣地點所取的28批表層土樣本和30批深層土樣本進行篩選,其中表層土樣成功兩批,篩選得到的菌種均為細菌,深層土樣成功8批,篩選得到的菌種有58株霉菌和6株細菌,所有菌株均在pH5.5的篩選培養(yǎng)基上篩到,在pH2.5的篩選培養(yǎng)基上也篩到一株霉菌。透明圈產生情況見圖1。對透明圈與菌落直徑比較大的菌進行液體發(fā)酵,提取粗酶液進行酶活力測定,酶活力較大的7株菌的酶活力見表1。其中1號霉菌的酶活力最高,為9.48U/mL,與其他菌株的酶活力之間具有極顯著差異(P<0.01)。

    圖2 單菌落形態(tài)特征Fig.2 Single colony morphology of strain 1 (with the highest phytase activity)

    對1號菌株進行菌種鑒定,單菌落的形態(tài)特征見圖2。菌落在査氏瓊脂上生長迅速,菌落初白色,后變黑,28℃培養(yǎng)7d直徑一般40~50mm,少數(shù)菌株生長較局限;平坦或中心稍凸起,有規(guī)則或不規(guī)則的輻射狀溝紋;質地絲絨狀或稍呈絮狀,有的菌株偶有不育性過度生長;菌落表面有大量孢子,呈暗褐黑色至炭黑色;具有霉味;菌落反面無色或呈不同程度的黃色、黃褐色或帶微黃綠色。通過40倍物鏡觀察到霉菌的顯微結構,見圖3。菌絲有隔膜,梗部有足細胞。有些分生孢子頭分裂成幾個圓柱狀結構,可達500μm,產孢結構雙層。分生孢子頭為球形至輻射性,直徑150~500μm,分生孢子梗壁光滑,長約800~4000μm,頂囊球形或近球形,直徑40~70μm。實驗研究該菌株與標準黑曲霉的個體形態(tài)完全相同[15-16],綜上特征,此酸性植酸酶產生菌初步鑒定為黑曲霉。

    圖3 菌株的個體形態(tài)特征(×400)Fig.3 Individual morphology of strain 1 (×400)

    2.2 黑曲霉產酸性植酸酶的遺傳穩(wěn)定性

    對篩選得到的黑曲霉進行6次傳代,并分別測其酶活力,結果如表2所示。各代菌株與第一代菌株的酶活力均無顯著性差異(P>0.05),表明該菌株有較好的遺傳穩(wěn)定性。

    2.3 發(fā)酵條件初步優(yōu)化

    2.3.1 不同碳源對植酸酶酶活力的影響

    由圖4可以看出,利用麩皮作為產酶培養(yǎng)的碳源,酶活比使用其他碳源物質明顯增高,同比葡萄糖增長30%,可能由于麩皮中含有某種成分,可以刺激黑曲霉分泌植酸酶,故以麩皮作為碳源。

    表1 不同菌株所產酸性植酸酶的酶活力Table 1 Enzyme activities of strains producing acid phytase

    表2 黑曲霉產酸性植酸酶的遺傳穩(wěn)定性Table 2 Genetic stability of strain 1

    圖4 不同碳源對植酸酶酶活力的影響Fig.4 Effect of carbon source on phytase activity

    2.3.2 碳源質量濃度對植酸酶酶活力的影響

    圖5 麩皮質量濃度對植酸酶酶活力的影響Fig.5 Effect of wheat bran concentration on phytase activity

    如圖5所示,隨著麩皮溶液質量濃度的增加,酶活力先上升,后下降,可能因為少量的麩皮對產酶有促進作用,過多的纖維存在對于產酶并沒有明顯的刺激作用,所以利用3g/100mL麩皮作為產酶培養(yǎng)的碳源。

    2.3.3 (NH4)2SO4質量濃度對植酸酶酶活力的影響

    圖6 (NH4)2SO4質量濃度對植酸酶酶活力的影響Fig.6 Effect of (NH4)2SO4 concentration on phytase activity

    如圖6所示,(NH4)2SO4質量濃度為0.5g/100mL時黑曲霉產植酸酶的酶活力最高,質量濃度過高,反而會抑制植酸酶的活力。

    2.3.4 培養(yǎng)基初始pH值對植酸酶酶活力的影響

    圖7 培養(yǎng)基初始pH值對植酸酶酶活力的影響Fig.7 Effect of initial culture pH on phytase activity

    如圖7所示,酸性范圍內,酶活力先上升后下降,黑曲霉產的植酸酶活力在pH5.5的條件下最高,可能由于該株黑曲霉是在pH5.5的條件下篩選得到的,它最適宜這個pH值條件,也說明篩選出的黑曲霉產生的確為酸性植酸酶。故以pH5.5作為培養(yǎng)基的初始pH值。

    2.3.5 培養(yǎng)時間對植酸酶酶活力的影響

    圖8 培養(yǎng)時間對植酸酶酶活力的影響Fig.8 Effect of culture time on phytase activity

    利用最優(yōu)的培養(yǎng)基,觀察培養(yǎng)時間對植酸酶活力的影響,結果見圖8。從第24小時開始,黑曲霉分泌的植酸酶就存在活力了,前60h的活力增長不是很明顯,從第60小時開始,酶活力迅速提高,說明霉菌新增加的細胞數(shù)目和死亡的細胞數(shù)目達到動態(tài)平衡,數(shù)目達到最高峰,細胞開始大量進行累積代謝,當?shù)竭_84h時,酶活力達到了峰值,為12.06U/mL。此后酶活力可能因為代謝活動所必需的物質減少而小范圍的降低,因此,確定最佳發(fā)酵時間為84h。

    2.4 酸性植酸酶的酶學性質

    2.4.1 酸性植酸酶作用的最適pH值

    由圖9可以看出,該酶在pH2和5時酶活力都較高,符合酸性植酸酶的性質。

    圖9 pH值對植酸酶酶活力的影響Fig.9 Effect of reaction pH on phytase activity

    2.4.2 酸性植酸酶的pH值穩(wěn)定性

    圖10 酸性植酸酶的pH值穩(wěn)定性Fig.10 pH stability of phytase

    用不同pH值的緩沖液在37℃條件下處理粗酶液30、60min,然后調回最適pH值,在常規(guī)條件下測定酶活力,考察酶在37℃條件下的pH值穩(wěn)定性,結果見圖10。該酶在pH3時,只有40%左右的酶活力,而其他pH值之間均有50%以上的酶活力,延長處理時間,對酶活力的影響不大。此酶在酸性和中性的pH值條件下有一定的穩(wěn)定性。

    2.4.3 酸性植酸酶作用的最適溫度

    圖11 溫度對植酸酶酶活力的影響Fig.11 Effect of reaction temperature on phytase activity

    從圖11可以看出,酸性植酸酶的最適溫度為45℃,在35~55℃都具有較高的酶活力,超過55℃后酶活力迅速下降。

    2.4.4 酸性植酸酶的熱穩(wěn)定性

    圖12 酸性植酸酶的熱穩(wěn)定性Fig.12 Thermal stability of phytase

    從圖12可以看出,在50℃保溫30min后酶活力保留在80%左右,在55℃保溫30min后酶活力仍能保留在60%以上,之后酶活力就迅速降低,65℃幾乎沒有酶活力。延長處理時間對酶的熱穩(wěn)定性影響不大。

    2.4.5 金屬離子對酸性植酸酶酶活力的影響

    表3 金屬離子對酸性植酸酶酶活力的影響Table 3 Effect of metal ions on phytase activity

    由表3可以看出,各種金屬離子與無添加金屬離子的酶活力相比均有顯著性差異。Ca2+、Fe2+、Na+、K+對酶活力有一定的抑制作用,Zn2+、Cu2+對酶有很大的抑制作用,可能這些離子可以和底物植酸鈉發(fā)生很強的絡合作用,是該酶的抑制劑;Mg2+、Ba2+對酶有一定的激活作用,是該酶的激活劑。

    3 結 論

    從土壤中篩選到一株產酸性植酸酶酶活力較高的菌株,初步鑒定為黑曲霉,對該菌株液體發(fā)酵產酶條件進行初步優(yōu)化,最優(yōu)條件為:麩皮3g/100mL、(NH4)2SO40.5g/100mL、發(fā)酵液初始pH5.5、發(fā)酵時間84h,此時酶活力可達12.06U/mL,此酶活高于目前報道的天然篩選的黑曲霉的酶活力,這可能與此菌株不同的生長環(huán)境有關,或是菌株發(fā)生了突變,使得酶活力較高。此菌株有一定的應用潛力,為下一步的遺傳改良以更進一步的提高酶活力打下很好的基礎。

    對該酸性植酸酶粗酶液的酶學性質研究表明:該酶的最適pH值為5左右,最適溫度是45℃;耐熱性方面,該酶在55℃保溫30min后酶活保留在60%左右,之后迅速下降;該酶在酸性和中性條件下有一定的穩(wěn)定性;金屬離子 Ca2+、Fe2+、Na+、K+、Zn2+、Cu2+對酶有一定的抑制作用,Mg2+、Ba2+對酶有一定程度的激活作用,因此,可考慮在發(fā)酵時加入這些金屬離子,以增大酶活力。另外,為適應飼料制粒過程中的高溫過程,可對該酸性植酸酶的耐熱性進行遺傳改良,以更好地發(fā)揮其作用。

    [1] 趙翠燕, 許欽坤, 柯野. 植酸酶的來源及合成研究進展[J]. 中國飼料,2009(8): 11-12.

    [2] BRUCE H M, CALLOW R K. Cereals and rickers: the role of inositolhexaposphoric acid[J]. Biochemistry, 1934, 28(2): 517-538.

    [3] MAGA J A. Phytate: its chemistry, occurrence, food interactions, nutritional significance, and methods of analysis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1982, 30(1): 1-9.

    [4] 周紫雨, 張俊紅. 植酸酶在飼料中的應用[J]. 飼料研究, 2006(7): 55-57.

    [5] HAEFNET S, KNIETSCH A, SCHOLTEN E, et al. Biotechnological production and applications of phytases[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2005, 68(5): 588-597.

    [6] NELSON T S. The utilization of phytate phosphorus by poultry[J].Poult Sci, 1967, 46(5): 862-871.

    [7] 施安輝, 王光玉, 李桂杰. 目前國內外植酸酶研究進展[J]. 中國釀造,2005, 6(5): 5-10.

    [8] WYSS M, PASAMONTES L. Biophysical characterization of fungal phytases (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases): molecular size, glycosylation pattern, and engineering of proteolyticresistance[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(2): 359-366.

    [9] 李大剛, 張秉勝, 張廣民. 植酸酶及其生產概述[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊, 2003(1): 8-9.

    [10] 董志平, 董立, 馬繼芳. 植酸酶研究進展及應用展望[J]. 河北農業(yè)科學, 2003, 7(9): 40-45.

    [11] 武燕平, 劉霞, 張彥杰, 等. 植酸酶及其基因工程改造研究進展[J].生命科學儀器, 2009, 7(4): 12-16.

    [12] EDWARD J, ABUL H J, ULLAH A H J. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2003, 312(3): 179-184.

    [13] 王亞茹, 姚斌, 曾虹, 等. 枯草芽孢桿菌中性植酸酶的純化和酶學性質[J]. 微生物學報, 2001, 41(2): 198-203.

    [14] 中國農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所. GB/T 18634—2009飼用植酸酶活性的測定 分光光度法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2009.

    [15] 魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海: 上??茖W技術出版社, 1979: 129-136.

    [16] 齊祖同. 中國真菌志: 曲霉屬及其相關有性型: 第五卷[M]. 北京: 科學出版社, 1997: 100-103.

    Screening and Identification of a Strain Capable of Producing Acid Phytase and Optimization of Its Fermentation Conditions

    LI Wen,WANG Tao
    (College of Food (Biological) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

    A strain with higher acid phytase activity isolated from soil was identified as Aspergillus niger. The optimal fermentation conditions for improved production of phytase by the strain were incubation in a medium composed of 3 g/100mL wheat bran and 0.5 g/100mL (NH4)2SO4, at an initial pH of 5.5 for 84 h. Under the optimal fermentation conditions, the phytase activity was up to 12.06 U/mL. The optimal reaction pH and temperature of this enzyme were 5 and 45 ℃, respectively. The relative enzyme activity remained to be 60% after heating treatment at 55 ℃ for 30 min. In addition, the enzyme was stable in acidic and neutral media. The phytase activity was inhibited by Ca2+, Fe2+, Na+, K+, Zn2+and Cu2+, while activated by Mg2+and Ba2+.

    acid phytase;screening;fermentation;enzyme property

    Q93.331

    A

    1002-6630(2011)05-0228-06

    2010-06-21

    江蘇省高校自然科學研究面上項目(10KJD180006);徐州工程學院科研基金青年課題(XKY2009122)

    李文(1982—),女,講師,碩士,研究方向為微生物發(fā)酵。E-mail:wenlisony@126.com

    猜你喜歡
    植酸酶植酸黑曲霉
    非反芻動物營養(yǎng)中的植酸酶:胃腸道植酸酶活性及其影響因素(續(xù)2)
    非反芻動物營養(yǎng)中的植酸酶:胃腸道植酸酶活性及其影響因素
    植酸酶在蛋雞生產應用
    復合誘變選育耐高溫高產葡萄糖酸鹽的黑曲霉菌株
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:22
    黑曲霉產纖維素酶混合發(fā)酵條件的研究
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:20
    飼料中植酸的抗營養(yǎng)作用
    酶法制備黑曲霉原生質體的條件
    超量使用植酸酶時所需的關鍵特性
    響應面法優(yōu)化黑曲霉產纖維素酶的發(fā)酵條件
    食品科學(2013年17期)2013-03-11 18:27:04
    β-螺旋槳植酸酶的金屬離子依賴性
    食品科學(2013年13期)2013-03-11 18:24:37
    视频中文字幕在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 十八禁高潮呻吟视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 精品亚洲成国产av| 国产精品欧美亚洲77777| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 一边摸一边做爽爽视频免费| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产乱人偷精品视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲精品,欧美精品| 秋霞伦理黄片| 久久国内精品自在自线图片| 97超视频在线观看视频| 美女大奶头黄色视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产精品一区二区在线不卡| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲国产欧美在线一区| 精品视频人人做人人爽| www.色视频.com| 高清欧美精品videossex| 大香蕉久久成人网| 欧美亚洲日本最大视频资源| 母亲3免费完整高清在线观看 | 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 精品久久久精品久久久| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 涩涩av久久男人的天堂| 我要看黄色一级片免费的| 蜜臀久久99精品久久宅男| 老女人水多毛片| 精品少妇内射三级| 少妇人妻 视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 中国国产av一级| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 亚洲国产av新网站| 亚洲av二区三区四区| 亚洲国产成人一精品久久久| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 只有这里有精品99| 精品酒店卫生间| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 九色亚洲精品在线播放| 欧美精品一区二区免费开放| kizo精华| 亚洲精品成人av观看孕妇| 夫妻午夜视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 免费少妇av软件| 最近手机中文字幕大全| 最黄视频免费看| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 久久韩国三级中文字幕| 日韩中字成人| 日本-黄色视频高清免费观看| av在线老鸭窝| av电影中文网址| 男女国产视频网站| 最近最新中文字幕免费大全7| 美女大奶头黄色视频| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精品一区二区在线观看99| 99re6热这里在线精品视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 97在线视频观看| 激情五月婷婷亚洲| 日日撸夜夜添| 日本色播在线视频| 不卡视频在线观看欧美| 飞空精品影院首页| 国产在视频线精品| 国产精品欧美亚洲77777| 大话2 男鬼变身卡| 日本欧美视频一区| 99热6这里只有精品| 美女内射精品一级片tv| 各种免费的搞黄视频| 91精品三级在线观看| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲av国产av综合av卡| 女人久久www免费人成看片| 97超碰精品成人国产| 乱码一卡2卡4卡精品| 涩涩av久久男人的天堂| 视频中文字幕在线观看| 中国三级夫妇交换| 天堂中文最新版在线下载| 国产午夜精品一二区理论片| 999精品在线视频| 国模一区二区三区四区视频| 国产精品人妻久久久影院| 精品人妻在线不人妻| 午夜免费男女啪啪视频观看| 午夜免费观看性视频| 亚洲三级黄色毛片| tube8黄色片| 国产精品蜜桃在线观看| 99热这里只有精品一区| 日本欧美国产在线视频| 国产在视频线精品| 国产亚洲精品久久久com| 色婷婷久久久亚洲欧美| 免费观看性生交大片5| 色婷婷av一区二区三区视频| 男女免费视频国产| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久精品久久久久久久性| 天美传媒精品一区二区| 日韩精品有码人妻一区| 国产一区二区三区综合在线观看 | 永久免费av网站大全| 在线 av 中文字幕| 国产成人freesex在线| 亚洲色图综合在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 日本欧美国产在线视频| 黄片无遮挡物在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 91aial.com中文字幕在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲怡红院男人天堂| 一个人看视频在线观看www免费| 欧美成人午夜免费资源| 国模一区二区三区四区视频| 丰满乱子伦码专区| 国产精品无大码| 久久女婷五月综合色啪小说| 成年女人在线观看亚洲视频| 久久99热6这里只有精品| 国精品久久久久久国模美| 国产成人91sexporn| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产精品不卡视频一区二区| 一个人免费看片子| 国产乱来视频区| 成人无遮挡网站| 成人国语在线视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| a级片在线免费高清观看视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 我要看黄色一级片免费的| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 哪个播放器可以免费观看大片| 99国产综合亚洲精品| 伦精品一区二区三区| 高清在线视频一区二区三区| 国产亚洲一区二区精品| 久久韩国三级中文字幕| 18禁在线播放成人免费| 日韩av免费高清视频| 中文欧美无线码| av网站免费在线观看视频| 精品酒店卫生间| 黄色一级大片看看| 午夜福利视频在线观看免费| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 我的老师免费观看完整版| 乱人伦中国视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产探花极品一区二区| 中文字幕精品免费在线观看视频 | av天堂久久9| av.在线天堂| 高清在线视频一区二区三区| 精品一区二区三区视频在线| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 69精品国产乱码久久久| 亚洲成色77777| av在线老鸭窝| 久久精品夜色国产| 搡老乐熟女国产| 一级毛片 在线播放| 成人国产av品久久久| av卡一久久| 午夜福利视频精品| 丰满少妇做爰视频| 热99国产精品久久久久久7| av不卡在线播放| 亚洲国产色片| 欧美精品亚洲一区二区| 日韩一区二区三区影片| 韩国av在线不卡| 中文字幕免费在线视频6| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 亚洲第一av免费看| 日韩成人伦理影院| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 永久免费av网站大全| 国产 一区精品| 日韩强制内射视频| 水蜜桃什么品种好| 亚洲少妇的诱惑av| h视频一区二区三区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 麻豆成人av视频| 伦理电影大哥的女人| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品久久久久久久电影| 两个人的视频大全免费| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲熟女精品中文字幕| 最新中文字幕久久久久| 中国三级夫妇交换| 男女边吃奶边做爰视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 好男人视频免费观看在线| 免费观看的影片在线观看| 日本欧美国产在线视频| 水蜜桃什么品种好| 久久99热6这里只有精品| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲图色成人| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲精品一二三| 亚洲av二区三区四区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 免费观看a级毛片全部| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 草草在线视频免费看| 国产男女内射视频| 一级二级三级毛片免费看| 热re99久久国产66热| 国产亚洲精品久久久com| 欧美xxxx性猛交bbbb| 如何舔出高潮| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 青春草视频在线免费观看| 午夜视频国产福利| www.av在线官网国产| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久99蜜桃精品久久| av免费在线看不卡| av天堂久久9| 能在线免费看毛片的网站| 久久精品国产亚洲网站| 熟妇人妻不卡中文字幕| 欧美精品高潮呻吟av久久| 成人毛片a级毛片在线播放| 日韩av不卡免费在线播放| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久久国产一区二区| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久精品夜色国产| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲久久久国产精品| 蜜臀久久99精品久久宅男| 日韩强制内射视频| av国产久精品久网站免费入址| 97精品久久久久久久久久精品| 91精品国产九色| 亚洲少妇的诱惑av| 精品一品国产午夜福利视频| 蜜桃在线观看..| 国产精品一区二区在线观看99| 午夜日本视频在线| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲国产欧美在线一区| 美女内射精品一级片tv| 日韩亚洲欧美综合| av在线app专区| 国产不卡av网站在线观看| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 久久ye,这里只有精品| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 99热这里只有精品一区| 国产成人freesex在线| 视频在线观看一区二区三区| 午夜激情久久久久久久| 一本久久精品| 亚洲国产精品国产精品| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 伊人久久国产一区二区| av黄色大香蕉| 日韩成人伦理影院| 国产成人精品久久久久久| 在线观看免费日韩欧美大片 | 国产视频内射| 男女无遮挡免费网站观看| 日本黄色日本黄色录像| 国产永久视频网站| 亚洲综合色惰| 成人漫画全彩无遮挡| 大香蕉97超碰在线| 妹子高潮喷水视频| 在线观看一区二区三区激情| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品久久久精品久久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 中文字幕久久专区| 少妇的逼水好多| 精品一区二区三卡| 18禁观看日本| 色婷婷av一区二区三区视频| 自线自在国产av| 尾随美女入室| a级片在线免费高清观看视频| 国产成人freesex在线| 国产淫语在线视频| 18+在线观看网站| 久久av网站| 国产成人精品福利久久| 视频在线观看一区二区三区| 色吧在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲熟女精品中文字幕| 三上悠亚av全集在线观看| 久久久久网色| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久久久久久久久成人| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 好男人视频免费观看在线| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 午夜福利网站1000一区二区三区| 午夜免费鲁丝| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲精品中文字幕在线视频| av播播在线观看一区| 下体分泌物呈黄色| 人成视频在线观看免费观看| 一本一本综合久久| 国产成人精品久久久久久| 精品久久久精品久久久| 欧美日韩综合久久久久久| 国精品久久久久久国模美| 老司机影院成人| 看十八女毛片水多多多| 午夜免费鲁丝| 国产欧美亚洲国产| 一区二区三区四区激情视频| 日韩视频在线欧美| 大码成人一级视频| 一级爰片在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 高清毛片免费看| 免费观看a级毛片全部| 国产精品一二三区在线看| 两个人的视频大全免费| 美女国产高潮福利片在线看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 高清欧美精品videossex| videosex国产| 丰满乱子伦码专区| 国产午夜精品一二区理论片| 日韩中字成人| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 一区二区三区精品91| 久久久久网色| 日韩一本色道免费dvd| 国产老妇伦熟女老妇高清| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 日韩欧美精品免费久久| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 熟女电影av网| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久久久网色| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产69精品久久久久777片| 婷婷色麻豆天堂久久| 熟女人妻精品中文字幕| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国内精品宾馆在线| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 一级毛片我不卡| 欧美最新免费一区二区三区| 精品少妇久久久久久888优播| 精品亚洲成国产av| 亚洲av男天堂| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 纯流量卡能插随身wifi吗| 91国产中文字幕| 少妇熟女欧美另类| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 在线免费观看不下载黄p国产| 母亲3免费完整高清在线观看 | 亚洲欧美成人综合另类久久久| 妹子高潮喷水视频| 69精品国产乱码久久久| 亚洲精品国产av蜜桃| 哪个播放器可以免费观看大片| 99热这里只有是精品在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 国产日韩欧美视频二区| 黄片无遮挡物在线观看| 飞空精品影院首页| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲国产精品国产精品| 久久久久久伊人网av| 精品人妻一区二区三区麻豆| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 一级爰片在线观看| 丰满乱子伦码专区| 99re6热这里在线精品视频| 国产综合精华液| 亚洲国产日韩一区二区| 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品久久久久久久电影| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲精品,欧美精品| 久久99热6这里只有精品| 成人手机av| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产一区二区三区av在线| 亚洲精品中文字幕在线视频| 草草在线视频免费看| 伊人久久国产一区二区| 国产精品人妻久久久影院| 日韩视频在线欧美| 久久久久人妻精品一区果冻| 99国产精品免费福利视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 精品酒店卫生间| 国产精品久久久久久av不卡| 免费观看av网站的网址| 丝袜脚勾引网站| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲av男天堂| av专区在线播放| 日韩强制内射视频| 十八禁网站网址无遮挡| 国产免费一区二区三区四区乱码| 久久人妻熟女aⅴ| 女性被躁到高潮视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产精品国产三级国产专区5o| 在线观看免费日韩欧美大片 | 中国三级夫妇交换| 国产淫语在线视频| 在线观看国产h片| 欧美日本中文国产一区发布| 青春草视频在线免费观看| 亚洲内射少妇av| 少妇的逼水好多| 亚洲情色 制服丝袜| 国产一区二区三区综合在线观看 | 99久久人妻综合| 精品久久蜜臀av无| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产高清有码在线观看视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久国内精品自在自线图片| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产精品一二三区在线看| 少妇丰满av| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 高清av免费在线| 亚洲无线观看免费| 久久国产亚洲av麻豆专区| 色网站视频免费| 免费日韩欧美在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片 | 精品久久久久久久久av| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美日韩av久久| 日韩人妻高清精品专区| 成人二区视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 两个人免费观看高清视频| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲成色77777| 日韩亚洲欧美综合| 一区二区三区精品91| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 精品久久蜜臀av无| 午夜福利,免费看| 亚洲成人手机| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久久精品区二区三区| 亚洲综合色惰| 秋霞伦理黄片| 亚洲精品久久午夜乱码| 九九在线视频观看精品| 亚洲欧美一区二区三区国产| 免费观看a级毛片全部| 午夜福利视频在线观看免费| 欧美少妇被猛烈插入视频| 成年人免费黄色播放视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 男女边摸边吃奶| 国产精品久久久久久久久免| 成人国产av品久久久| 一级毛片 在线播放| 久久婷婷青草| 天美传媒精品一区二区| 精品国产露脸久久av麻豆| 精品人妻熟女av久视频| 免费观看a级毛片全部| 免费黄频网站在线观看国产| 国产亚洲最大av| 黄色一级大片看看| 国产精品熟女久久久久浪| 国产精品成人在线| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 色5月婷婷丁香| 人妻人人澡人人爽人人| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 熟妇人妻不卡中文字幕| 久久久国产一区二区| 伊人久久精品亚洲午夜| videossex国产| av网站免费在线观看视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 国产成人午夜福利电影在线观看| 91精品国产国语对白视频| 永久网站在线| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| av免费在线看不卡| 国产精品人妻久久久久久| 美女福利国产在线| 日韩av不卡免费在线播放| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲综合色网址| 亚洲,欧美,日韩| 最近手机中文字幕大全| 免费高清在线观看视频在线观看| 十八禁高潮呻吟视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产精品.久久久| 久久久久精品性色| 日韩中字成人| 秋霞伦理黄片| 美女内射精品一级片tv| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 九九爱精品视频在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 伦理电影大哥的女人| 九色亚洲精品在线播放| 最黄视频免费看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 青青草视频在线视频观看| 精品熟女少妇av免费看| 在线观看www视频免费| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 赤兔流量卡办理| 日日摸夜夜添夜夜爱| 两个人的视频大全免费| 久久久久久人妻| 国产片内射在线| 夫妻性生交免费视频一级片| 水蜜桃什么品种好| 亚洲熟女精品中文字幕| 日本91视频免费播放| 欧美性感艳星| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 另类精品久久| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 女人久久www免费人成看片| a 毛片基地| 亚洲伊人久久精品综合| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲精品国产av成人精品| av播播在线观看一区| 国产免费又黄又爽又色| av在线播放精品| 亚洲av日韩在线播放| 18禁观看日本| 成人影院久久| 欧美最新免费一区二区三区| 日本黄色片子视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产免费现黄频在线看| 国产成人aa在线观看| 亚洲国产精品专区欧美| 中国美白少妇内射xxxbb| 在现免费观看毛片| 日本色播在线视频| 午夜影院在线不卡| 最近中文字幕高清免费大全6| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久久久久久久久久丰满| 伦理电影免费视频| 免费观看在线日韩| 18禁动态无遮挡网站| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲av不卡在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲成色77777| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 午夜久久久在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 美女视频免费永久观看网站| 国产男女内射视频| 久久国产精品大桥未久av| 美女视频免费永久观看网站| 男女国产视频网站|