響應(yīng)面法優(yōu)化Bacillus thuringiensis ZJOU-010產(chǎn)殼聚糖酶

陳 靜，陳小娥*，方旭波，余 輝

(浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院、醫(yī)學(xué)院，浙江 舟山 316000)

響應(yīng)面法優(yōu)化Bacillus thuringiensis ZJOU-010產(chǎn)殼聚糖酶

陳 靜，陳小娥*，方旭波，余 輝

(浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院、醫(yī)學(xué)院，浙江 舟山 316000)

目前，利用殼聚糖酶降解殼聚糖已成為生產(chǎn)功能性殼寡糖的首選途徑。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法結(jié)合中心組合設(shè)計優(yōu)化了Bacillus thuringiensis ZJOU-010產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)條件。結(jié)果表明：當(dāng)蝦殼粉質(zhì)量濃度為44.96g/L、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度為1.48g/L、pH值為6.78時，B. thuringiensis ZJOU-010的殼聚糖酶活力達(dá)到4.25U/mL。優(yōu)化后獲得的實驗值與模型的預(yù)測值(4.16U/mL)基本相符，且較優(yōu)化前的酶活力(3.59U/mL)提高了18.47%。研究表明，利用生物催化技術(shù)以蝦加工企業(yè)的副產(chǎn)物——蝦殼粉為唯一碳源和氮源生產(chǎn)殼寡糖是可行的。

殼寡糖；蝦殼粉；殼聚糖酶；優(yōu)化；響應(yīng)面

殼聚糖(chitosan)又稱甲殼胺，它是自然界唯一的天然陽離子高聚物，也是自然界最豐富的多糖之一，在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛的用途[1-3]。然而，由于殼聚糖分子質(zhì)量大、水溶性差、在人體內(nèi)不易吸收，因而其應(yīng)用難以得到進(jìn)一步拓展。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖降解后獲得的殼寡糖不僅具有水溶性好、保濕性好、易吸收等優(yōu)點(diǎn)，還有抗腫瘤，抗細(xì)菌、真菌，免疫激活等獨(dú)特的生理功能，應(yīng)用前景十分廣闊，因而有關(guān)殼寡糖的制備方法日益成為研究熱點(diǎn)[4]。目前降解殼聚糖的方法主要有酸解法和酶解法，其中酸解法得率低，產(chǎn)物純化難，降解產(chǎn)物聚合度小，且對環(huán)境污染嚴(yán)重；酶解法以產(chǎn)率高、反應(yīng)條件溫和且易控制、產(chǎn)物安全性好及所得低聚物聚合度適中等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞。因此，利用殼聚糖酶降解殼聚糖已成為功能性殼寡糖生產(chǎn)的首選途徑[5-6]。

殼聚糖酶主要分布于細(xì)菌和真菌體內(nèi)，但是迄今報道的微生物大多是以可溶性殼聚糖為唯一碳源[7-8]。在前期的研究工作中，筆者實驗室篩選到一株產(chǎn)殼聚糖酶的菌株Bacillus thuringiensis ZJOU-010，這是該種內(nèi)發(fā)現(xiàn)能以蝦殼粉(shrimp shell powder，SSP)為唯一碳源和氮源產(chǎn)殼聚糖酶的菌株。該工藝的優(yōu)勢在于，以蝦加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物SSP為原料進(jìn)行資源化利用，變廢為寶，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益，同時還能減少環(huán)境污染[9]。

然而，目前以蝦殼粉為基質(zhì)合成的殼聚糖酶活力較低，使得殼寡糖的酶法生產(chǎn)工藝難以進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用，因此提高殼聚糖酶活力具有重要的研究和應(yīng)用價值。眾所周知，產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化是提高微生物源酶活力的重要方式，其最常見的策略是單次單因素(one variable at a time)法。但是該法在考察的因素較多時，需要較多的實驗次數(shù)和較長的實驗周期，而且不能考察各因素間的交互作用[10]。為了彌補(bǔ)單次單因素法的缺陷，本實驗采用中心組合試驗設(shè)計和響應(yīng)面法優(yōu)化B. thuringiensis ZJOU-010產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis ZJOU-010)由本實驗室從水產(chǎn)加工企業(yè)周圍土壤中篩選得到，其16S rRNA的基因序列在Gene Bank 的登錄號為GU384894。蝦殼由浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司饋贈。將經(jīng)自來水沖洗并干燥后的蝦殼用超微粉碎機(jī)加工成粉狀，作為微生物生產(chǎn)殼聚糖酶的碳源和氮源。

殼聚糖(脫乙酰度83%) 浙江天寶殼聚糖有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004電子分析天平 上海精密儀器儀表有限公司；HYG-11回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海新星自動化控制設(shè)備成套廠；UV-754型紫外-可見分光光度計 上海分析儀器廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器材廠；X-22 Centrifuge高速離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3、蛋白胨10、NaCl 5、瓊脂15；種子培養(yǎng)基(g/L)：SSP 20、(NH4)2SO43、K2HPO40.2、MgSO40.3，pH7.0；產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)：SSP 30、(NH4)2SO41、K2HPO40.2、MgSO40.3，pH7.0。

1.4 培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)：從培養(yǎng)好的斜面中挑取一環(huán)菌種接入裝有40mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，32℃、160r/min的搖床上培養(yǎng)24h。

產(chǎn)酶培養(yǎng)：培養(yǎng)24h后的種子液，以體積分?jǐn)?shù)3%的接種量接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，然后在32℃、160r/min的搖床上培養(yǎng)48h。

1.5 酶活力的測定

將發(fā)酵液于10000×g離心10min，取上清液0.5mL，加入1mL 0.5g/100mL的殼聚糖溶液(pH5.0)和0.2mol/L的HAc-NaAc緩沖液(pH5.0)3.5mL。在40℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)15min，立即加入2mL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑，混勻，置沸水浴中反應(yīng)5min，冷卻后定容至25mL，離心去除未水解的殼聚糖，取上清液測OD510nm值[11]。等量煮沸滅活的發(fā)酵液作為空白對照。殼聚糖酶酶活力單位定義：在上述條件下，每分鐘水解底物形成相當(dāng)于1μmol 氨基葡萄糖時所用酶量為1個酶活力單位(U)。

1.6 單因素試驗

為了選擇對Bacillus thuringiensis ZJOU-010產(chǎn)殼聚糖酶能力影響較大的因素，本研究分別對SSP質(zhì)量濃度、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度、Ca2+濃度、Mg2+濃度、培養(yǎng)基初始pH值、接種量、搖瓶裝液量、搖床轉(zhuǎn)速及溫度等參數(shù)進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗。根據(jù)試驗結(jié)果，選擇3個關(guān)鍵因素用于后續(xù)響應(yīng)面分析，并粗略估計響應(yīng)面試驗的中心試驗點(diǎn)和各因素的取值區(qū)間。

1.7 響應(yīng)面試驗設(shè)計

響應(yīng)面分析法是數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計技術(shù)相結(jié)合的一種分析方法，中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計是響應(yīng)面法常用的一種試驗設(shè)計方法[12]，本試驗選擇SSP質(zhì)量濃度、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度和培養(yǎng)基初始pH值3個因素設(shè)計正交旋轉(zhuǎn)回歸試驗，每個因素選3個水平，以殼聚糖酶活力為響應(yīng)值作響應(yīng)面設(shè)計，對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，總共需20個試驗，其中6個是中心點(diǎn)的重復(fù)試驗。用響應(yīng)面試驗結(jié)果建立多項式回歸模型，表達(dá)式為：

式中：X1、X2、X3分別為SSP質(zhì)量濃度、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度和培養(yǎng)基初始pH值的編碼值，Y為預(yù)測值即發(fā)酵液中殼聚糖酶活力；b0為常數(shù)項；b1、b2、b3為一次項回歸系數(shù)；b12、b13、b23為互作相回歸系數(shù)；b11、b22、b33為二次項回歸系數(shù)。通過Design Expert軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析，其中回歸系數(shù)的顯著性由F(Fischer)檢驗，方程的擬合程度由R2決定[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

通過對諸多產(chǎn)酶條件的單因素試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Ca2+濃度、Mg2+濃度、接種量、搖瓶裝液量、搖床轉(zhuǎn)速及溫度等因素相比，SSP質(zhì)量濃度、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度與pH值對產(chǎn)殼聚糖酶的影響更為顯著。由于篇幅所限，本實驗重點(diǎn)對上述3個因素的產(chǎn)酶影響進(jìn)行分析。

2.1.1 SSP質(zhì)量濃度對殼聚糖酶活力的影響

圖1 SSP質(zhì)量濃度對殼聚糖酶活力的影響Fig.1 Effect of SSP concentration on chitosanase activity

由圖1可見，當(dāng)SSP質(zhì)量濃度從10g/L增加至30g/L時，殼聚糖酶活力不斷升高，這歸因于可利用的碳源和氮源逐漸增多。但是，當(dāng)SSP質(zhì)量濃度繼續(xù)增加時，酶活力開始逐漸降低。究其原因，可能是由于過量的營養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致培養(yǎng)基黏度增大而使菌體傳質(zhì)不利。因此，本實驗較適宜的SSP質(zhì)量濃度為30g/L。

2.1.2 (NH4)2SO4質(zhì)量濃度對殼聚糖酶活力的影響

氮是組成微生物細(xì)胞蛋白質(zhì)、酶和核酸的主要元素之一。雖然SSP本身含有氮源，在培養(yǎng)基中既能充當(dāng)碳源，又能充當(dāng)?shù)?，但是由圖2可知，與不加額外氮源相比，加入一定量的(NH4)2SO4能提高殼聚糖酶活力。這可能是由于(NH4)2SO4更容易被微生物利用而促進(jìn)細(xì)胞生長。當(dāng)(NH4)2SO4添加量為1.0g/L時，酶活力達(dá)到最大值；其后再增加(NH4)2SO4質(zhì)量濃度，酶活力不再增加，反而呈下降趨勢，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的可能原因有兩個：1)(NH4)2SO4作為一種無機(jī)氮源，其添加量決定了培養(yǎng)基的碳氮比，進(jìn)而影響菌體生長與產(chǎn)酶，當(dāng)增加(NH4)2SO4質(zhì)量濃度時，菌體的生物量增加，而菌體生長過于旺盛并不利于殼聚糖酶的積累；2)(NH4)2SO4是一種強(qiáng)酸弱堿鹽，在發(fā)酵的后期，NH4+被利用后，培養(yǎng)基pH值明顯下降從而影響產(chǎn)酶。

圖2 (NH4)2SO4質(zhì)量濃度對殼聚糖酶活力的影響Fig.2 Effect of (NH4)2SO4 concentration on chitosanase activity

2.1.3 產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值對酶活力的影響

圖3 產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值對殼聚糖酶活力的影響Fig.3 Effect of initial pH on chitosanase activity

由圖3可見，不同初始pH值的培養(yǎng)基對發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶有顯著影響。眾所周知，培養(yǎng)基的pH值影響細(xì)胞膜表面帶電基團(tuán)的解離及其微觀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，導(dǎo)致微生物的生長和代謝發(fā)生變化；此外，殼聚糖酶是一種胞外酶，pH值通過影響細(xì)胞膜的通透性而決定細(xì)胞分泌胞外酶的能力。值得一提的是，迄今多數(shù)文獻(xiàn)報道的較適宜的產(chǎn)殼聚糖酶的pH值為5.0～6.5[14-15]，而本研究的B. thuringiensis ZJOU-010產(chǎn)殼聚糖酶的pH值以7.0為宜(圖3)。究其原因，前者的微生物以殼聚糖作為碳源，當(dāng)培養(yǎng)基pH值大于6.5時，殼聚糖開始出現(xiàn)沉淀，因而微生物難以利用其生長致使產(chǎn)酶受到嚴(yán)重抑制；后者的B. thuringiensis ZJOU-010以SSP為碳源，SSP溶解度并不隨培養(yǎng)基pH值的變化而產(chǎn)生顯著差異，微生物于pH7.0生長良好。

2.2 中心組合設(shè)計(CCD)及響應(yīng)面法優(yōu)化B. thuringiensis ZJOU-010產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)條件

2.2.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取

根據(jù)中心組合試驗設(shè)計原理，綜合2.1節(jié)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計SSP質(zhì)量濃度、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度和pH值3個因素進(jìn)行正交旋轉(zhuǎn)回歸試驗，每個因素選3個水平，以殼聚糖酶活力為響應(yīng)值作響應(yīng)面設(shè)計，試驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface design

2.2.2 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計方案

以SSP質(zhì)量濃度、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度和pH值為自變量，以殼聚糖酶活力為響應(yīng)值(Y)，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗。試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計安排及結(jié)果Table 2 Response surface central composite design and corresponding results

2.2.3 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

對表2試驗結(jié)果通過Design expert軟件程序進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型：

由表3可見，該回歸模型高度顯著(P＜0.0001)，失擬項(P=0.3079)不顯著，說明本試驗在整個回歸區(qū)域的擬合情況良好，可用該模型代替試驗真實點(diǎn)對試驗結(jié)果進(jìn)行分析[16]?；貧w模型各項的方差分析結(jié)果還表明，一次項、二次項都有較顯著影響，所以響應(yīng)值的變化相當(dāng)復(fù)雜，各個具體試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系?；貧w模型中作用極顯著的是X1、X2、X1X2、和。因此，在一定范圍內(nèi)可調(diào)節(jié)SSP質(zhì)量濃度、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度和pH值的關(guān)系，使殼聚糖酶活力達(dá)到所需水平。

影響殼聚糖酶活力的各因素按顯著性排序依次為：(NH4)2SO4質(zhì)量濃度＞SSP質(zhì)量濃度＞pH值。方程復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方(R2)值為0.9618，說明96.18%的試驗數(shù)據(jù)可由此方程解釋，模型擬合程度很好。

模型的調(diào)整決定系數(shù)R2adj值為0.9275，說明該方程的應(yīng)變量與全體自變量間線性關(guān)系顯著，響應(yīng)值的變化有92.75%來源于所選自變量；模型的變異系數(shù)為6.4%，說明模型的精密度良好。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of the developed regression equation

2.2.4 各因素間交互作用對殼聚糖酶活力的響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程，繪出響應(yīng)面分析圖及等高線圖，見圖4～6。每個響應(yīng)面分別代表著兩個獨(dú)立變量之間的相互作用，此時第3個變量為一恒定值(零水平值)。

圖4 SSP質(zhì)量濃度和(NH4)2SO4質(zhì)量濃度對殼聚糖酶活力的影響Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between SSP concentration and (NH4)2SO4 concentration on chitosanase activity

由圖4可見，硫酸銨質(zhì)量濃度(X1)與SSP質(zhì)量濃度(X2)交互作用極顯著，而且隨著兩者質(zhì)量濃度的增加，殼聚糖酶活力逐漸增大；當(dāng)SSP質(zhì)量濃度和硫酸銨質(zhì)量濃度分別為44.85g/L和1.48g/L時，殼聚糖酶活力達(dá)到最大值(4.15U/mL)。

圖5 (NH4)2SO4質(zhì)量濃度和pH值對殼聚糖酶活力的影響Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between (NH4)2SO4 concentration and pH on chitosanase activity

從圖5的圓形等高線可知，pH值和硫酸銨質(zhì)量濃度的交互作用不顯著，最優(yōu)點(diǎn)接近于pH7.0和硫酸銨質(zhì)量濃度1.50g/L。同時，從等高線圖可看出，酶活力對硫酸銨質(zhì)量濃度變化比對pH值的變化稍為敏感。

從圖6可以看出，SSP質(zhì)量濃度(X1)和pH值(X3)的交互作用較顯著，當(dāng)固定pH值在某一值時，隨SSP質(zhì)量濃度的增加，殼聚糖酶活力也增加，并且其值呈直線的趨勢增加。當(dāng)固定SSP質(zhì)量濃度在某一值時，隨pH值的增加，殼聚糖酶活力先增加后減小。當(dāng)SSP質(zhì)量濃度為44.99g/L，pH6.79時，殼聚糖酶活力最大(3.62U/mL)。

圖6 SSP質(zhì)量濃度和pH值對殼聚糖酶活力的影響Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between SSP concentration and pH on chitosanase activity

2.3 驗證實驗

利用Design expert 7.1.16的數(shù)值特性，各因素的最大和最小取值及殼聚糖酶活力的取值范圍見表5。通過軟件得出，在SSP質(zhì)量濃度為44.96g/L、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度為1.48g/L和pH6.78的條件下，最大殼聚糖酶活力預(yù)測值為4.16U/mL。為驗證回歸模型的可靠性，在響應(yīng)面分析法求得的最佳條件下進(jìn)行了3次驗證實驗，實際測得的酶活力為4.25U/mL，發(fā)現(xiàn)實測值與回歸方程預(yù)測值吻合良好，由此可見，用該回歸模型優(yōu)化B. thuringiensis ZJOU-010產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)條件是可行的，具有實用價值。此外，與響應(yīng)面優(yōu)化前的最大酶活力(3.59U/mL)相比，提高了18.47%。

表5 最大酶活力的優(yōu)化范圍Table 5 Optimal range to achieve the maximum chitosanase activity

3 討論與結(jié)論

響應(yīng)面法克服了正交設(shè)計只能處理離散的水平值而無法找出整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值的缺陷。響應(yīng)面分析方法是研究幾種因素間交互作用的回歸分析方法。將該方法用于殼聚糖酶產(chǎn)生菌B.thuringiensis ZJOU-010培養(yǎng)條件的優(yōu)化，求得的回歸方程精度高；可以準(zhǔn)確找到整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，是比較理想的方法。該方法通過響應(yīng)面圖直觀分析了各因素對殼聚糖酶活力的影響，以及各因素之間對酶活力的交互作用。應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化出最佳培養(yǎng)條件為：SSP質(zhì)量濃度44.96g/L、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度1.48g/L和pH6.78，在此條件下殼聚糖酶活力達(dá)4.25U/mL，與優(yōu)化前的酶活力(3.59U/mL)相比，提高了18.47%。本研究證明，以SSP為唯一碳源和氮源生產(chǎn)殼寡糖是切實可行的，從可持續(xù)發(fā)展的角度看，這一生產(chǎn)過程既能減少環(huán)境污染又具備經(jīng)濟(jì)效益，具有廣闊的應(yīng)用前景，尤其隨著近年來水產(chǎn)企業(yè)副產(chǎn)物日益增多，這一工藝更具競爭力。然而，今后的工作重心還需放在以B. thuringiensis ZJOU-010所產(chǎn)殼聚糖酶為催化劑，以海洋廢棄物為原料生產(chǎn)功能性殼寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)上，真正做到變廢為寶。

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Optimization of Chitosanase Production from Bacillus thuringiensis ZJOU-010 by Response Surface Methodology

CHEN Jing，CHEN Xiao-e*，F(xiàn)ANG Xu-bo，YU Hui
(College of Food and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316000, China)

Chitooligosaccharides exhibit a broad range of potential applications in the fields of biomedicine, pharmaceuticals,food, cosmetics and agriculture. In the present study, based on the results from single factor tests, response surface methodology(RSM) combined with central composite design was used to optimize cultivation conditions of Bacillus thuringiensis ZJOU-010 for producing chitosanase. The optimal conditions were achieved to be shrimp shell powder (SSP) concentration of 44.96 g/L,(NH4)2SO4 concentration of 1.48 g/L, and pH of 6.78. Under the optimal conditions, the chitosanase activity from Bacillus thuringiensis ZJOU-010 was 4.25 U/mL. The obtained value of chitosanase activity was in good agreement with the predicted value (4.16 U/mL). Meanwhile, 18.47% improvement on chitosanase activity after the optimal cultivation was achieved, when compared with the chitosanase activity of 3.59 U/mL before optimization. These results indicated that oligosaccharides could be produced using shrimp processing by-products as the carbon and nitrogen sources.

chitooligosaccharides；shrimp shell powder；chitosanase；optimization；response surface methodology

TS210.1

A

1002-6630(2011)05-0176-06

2010-05-01

浙江省自然科學(xué)基金項目(Y305119)；浙江省優(yōu)先主題農(nóng)業(yè)項目(2008C12029)；浙江海洋學(xué)院科研啟動基金項目

陳靜(1979—)，女，講師，博士，研究方向為海洋生物資源綜合利用。E-mail：chenjing1979@126.com

*通信作者：陳小娥(1969—)，女，副教授，博士，研究方向為海洋生物資源綜合利用及功能性食品。E-mail：xiaoechen@163.com