• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    小腸結(jié)腸炎耶爾森菌前增菌方式的選擇

    2011-10-18 04:16:48祝長(zhǎng)青周光宏徐幸蓮
    食品科學(xué) 2011年5期
    關(guān)鍵詞:增菌耶爾森雜菌

    牛 蕾,祝長(zhǎng)青,2,周光宏,*,徐幸蓮,李 彬,江 蕓

    (1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210095;2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局,江蘇 南京 200001)

    小腸結(jié)腸炎耶爾森菌前增菌方式的選擇

    牛 蕾1,祝長(zhǎng)青1,2,周光宏1,*,徐幸蓮1,李 彬1,江 蕓1

    (1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210095;2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局,江蘇 南京 200001)

    小腸結(jié)腸炎耶爾森菌作為一種食源性致病菌逐漸引起了關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)利用胰蛋白胨培養(yǎng)基、改良磷酸鹽緩沖液和氯苯酚-替卡西林-氯酸鉀培養(yǎng)基對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌前增菌,并采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)增菌效果進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果表明:在純菌體系中胰蛋白胨培養(yǎng)基對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的增菌作用優(yōu)于其他兩種培養(yǎng)基,并且增菌24h后即可檢測(cè)到該菌。在混菌體系中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌經(jīng)過(guò)改良磷酸鹽緩沖液增菌后靈敏性最高,并且增菌時(shí)間可縮短至8h。因此在實(shí)際檢測(cè)中可采用改良磷酸鹽緩沖液對(duì)該菌進(jìn)行增菌檢測(cè)。

    小腸結(jié)腸炎耶爾森菌;前增菌;實(shí)時(shí)熒光PCR;培養(yǎng)基;食源性致病菌

    小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)是一種革蘭氏陰性短桿菌。它在畜禽中含量較高,豬帶菌率最高。本菌是一種嗜冷菌,在0~4℃仍能繼續(xù)繁殖并產(chǎn)生毒素。在冰箱內(nèi)存放的污染該細(xì)菌的食品對(duì)人仍具有感染性[1]。自20世紀(jì)80年代以來(lái),小腸結(jié)腸炎耶爾森菌成為全球廣泛關(guān)注的一種要的食源性致病菌。1985—1987年我國(guó)從20 個(gè)省市的39412例腹瀉患者中檢出患小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病例為256例,占0. 64%[2]。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌所致疾病有回腸炎、腸系膜淋巴結(jié)炎、闌尾炎、結(jié)節(jié)性紅斑、關(guān)節(jié)炎、敗血癥和各種膿腫等[3]。

    目前國(guó)內(nèi)外各標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測(cè)方法均為傳統(tǒng)生化鑒定方法,此方法既耗時(shí)又需要大量的勞動(dòng)力。實(shí)時(shí)熒光PCR方法由于具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程、快速、特異性強(qiáng)以及靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)而成為目前檢驗(yàn)該菌的主要方法[4-12]。但由于食品體系較復(fù)雜且雜菌率較高以致檢出率較低,所以在使用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌之前增菌是十分必要的。本實(shí)驗(yàn)選取胰蛋白胨培養(yǎng)基(TSB)、改良磷酸鹽緩沖液(PSB)和氯苯酚-替卡西林-氯酸鉀培養(yǎng)基(ITC)3種培養(yǎng)基作為增菌液,分別在純菌體系和雜菌體系中對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行前增菌,利用PCR方法對(duì)增菌效果進(jìn)行驗(yàn)證。

    1 材料與方法

    1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

    小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CICC21565)購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。陰性肉樣為市售肉制品。

    PSB培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、CIN-1培養(yǎng)基、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生化鑒定套裝培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限公司;ITC培養(yǎng)基及配套添加劑 青島海博公司。

    DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司;PCR預(yù)混液GoTaq Green Master Mix 美國(guó)Promega公司;Taqman探針預(yù)混液2×Premix Ex TaqTM大連寶生物科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Mastercycler PCR儀 美國(guó)Eppendorf公司;ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司;LX-100手掌型離心機(jī) 江蘇海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠;Anke TGL-16G 高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;WH-2 微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器有限公司;ZKSY-42智能恒溫水箱 南京科爾儀器設(shè)備有限公司;LD ZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;BIO-RAD凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

    1.3 方法

    1.3.1 前增菌培養(yǎng)

    1.3.1.1 純菌體系

    取4.8×104CFU/mL小腸結(jié)腸炎耶爾森菌純菌液0.1mL分別接種于100mL PSB、TSB、ITC增菌液中,并置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。每隔8h取菌體沉淀一次,并取一定稀釋度的菌液0.1mL涂布于CIN-1選擇培養(yǎng)基上,置于26℃培養(yǎng)48h后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

    1.3.1.2 雜菌體系

    以480CFU/g肉樣為標(biāo)準(zhǔn)將小腸結(jié)腸炎耶爾森菌接種于10g陰性肉樣中,并將此肉樣分別置于裝有90mL PSB、TSB、ITC增菌液的三角瓶中,置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,每隔8h取菌體沉淀一次,取菌液劃線接種于CIN-1選擇培養(yǎng)基上,置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,另外將可疑菌落接種于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生化鑒定套裝培養(yǎng)基上進(jìn)行生化鑒定。

    1.3.2 DNA提取

    取各時(shí)間點(diǎn)保留的菌體沉淀,參照天根生化科技有限公司細(xì)菌DNA提取試劑盒操作流程提取DNA。提取出來(lái)的DNA作為反應(yīng)模板,以備后續(xù)PCR反應(yīng)使用。

    1.3.3 普通PCR反應(yīng)

    反應(yīng)體系:GoTaq Green Master Mix預(yù)混液12.5μL,上、下游引物(10μmol/L)各0.75μL,模板DNA 2μL,雙蒸水補(bǔ)足體積到25μL。引物序列:上游引物ail-F為5'-ACT CGA TGA TAA CTG GGG AG-3'(664-683),下游引物ail-R為5'-CCC CCA GTA ATC CAT AAA GG -3'(814-833)。引物由大連寶生物科技有限公司合成。

    反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5min;95℃變性45s,54℃退火45s,72℃延伸34s,共40個(gè)循環(huán)。

    1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳

    利用1%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳,觀察目的基因擴(kuò)增情況。

    1.3.5 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)

    反應(yīng)體系:預(yù)混液2×Premix Ex TaqTM10μL (DNA聚合酶、反應(yīng)用Buffer、dNTP、Mg2+等),引物ail-F和ail-R (10μmol/L)各0.4μL,探針(10μmol/L)0.2μL,50×Rox Reference Dye Ⅱ0.4μL,模板DNA 2μL,雙蒸水補(bǔ)足體積到20μL。探針為FAM-TCG TTT GCT TAT ACT CAT CAGGGA - Eclipse (692-715),其5'-端標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)為FAM,3'-端標(biāo)記淬滅基團(tuán)為非熒光基團(tuán)Eclipse。探針由大連寶生物科技有限公司合成。

    反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性30s;95℃變性5s,60℃退火及延伸34s,共40個(gè)循環(huán)。

    結(jié)果判斷:Ct值≥40,可判斷樣品結(jié)果為陰性,可直接報(bào)告未檢出相應(yīng)致病菌;Ct 值<40,可判斷該樣品結(jié)果為陽(yáng)性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法

    表1 純菌體系中對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌增菌不同時(shí)間后平板計(jì)數(shù)結(jié)果Table 1 The plate count of Yersinia enterocolitica after different cultivation time lg(CFU/mL)

    如表1所示,在TSB培養(yǎng)基中該菌生長(zhǎng)速度較快,PSB培養(yǎng)基是3種培養(yǎng)基中增菌效果較差的一種。在雜菌體系中通過(guò)對(duì)各培養(yǎng)基進(jìn)行劃線分離,并進(jìn)行生化鑒定,小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生化鑒定結(jié)果如表2所示。在雜菌體系中檢驗(yàn)結(jié)果顯示TSB培養(yǎng)基和PSB培養(yǎng)基經(jīng)16h以上增菌 時(shí)間后均有陽(yáng)性菌株被分離出來(lái),但TSB 培養(yǎng)基檢出率不如PSB培養(yǎng)基高,而ITC培養(yǎng)基并未分離出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陽(yáng)性菌株。

    表2 雜菌體系中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生化鑒定結(jié)果Table 2 Biochemical identification of Yersinia enterocolitica

    2.2 普通PCR反應(yīng)結(jié)果

    圖1 純菌體系中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌經(jīng)不同培養(yǎng)基及不同時(shí)間培養(yǎng)后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of PCR amplified products of pure Yersinia enterocolitica after various cultivation time and media

    如圖1所示,根據(jù)電泳條帶亮度可知在純菌體系條件下TSB培養(yǎng)基增菌效果較好,增菌 16h即可檢出該菌。在混合菌體系中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌目的基因擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。從電泳條帶亮度可以看出PSB培養(yǎng)基在雜菌體系中增菌效果較好,且經(jīng)16h增菌后即可檢測(cè)出該菌。但是由于瓊脂糖凝膠電泳靈敏度較低,所以各培養(yǎng)基具體前增菌效果需要通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。

    圖2 人工污染小腸結(jié)腸炎耶爾森菌后經(jīng)不同培養(yǎng)基及不同時(shí)間培養(yǎng)后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of PCR amplified products of artificially contaminated Yersinia enterocolitica after various cultivation time and media

    2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)果

    圖3 純菌體系中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌經(jīng)不同培養(yǎng)基及不同時(shí)間培養(yǎng)后實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線Fig.3 Real-time PCR amplification curve of pure Yersinia enterocolitica after various cultivation time and media

    根據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR原理,可以根據(jù)擴(kuò)增曲線的Ct值判斷起始菌液濃度的高低進(jìn)而得到各培養(yǎng)基的增菌效果。

    由圖3可以看出,純菌體系中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌只有經(jīng)過(guò)TSB培養(yǎng)基增菌后才有擴(kuò)增曲線。

    表3 純菌體系中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌經(jīng)TSB培養(yǎng)基不同時(shí)間增菌后實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果Table 3 Real-time PCR results of pure Yersinia enterocolitica in TSB medium after different cultivation time

    由表3可知,8h和16h的Ct值明顯大于其他時(shí)間點(diǎn)的Ct值,所以小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在經(jīng)過(guò)TSB培養(yǎng)基增菌24h后可穩(wěn)定的被檢測(cè)出來(lái)。

    圖4 人工污染小腸結(jié)腸炎耶爾森菌經(jīng)不同培養(yǎng)基及不同時(shí)間培養(yǎng)后實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線Fig.4 Real-time PCR amplification curve of artificially contaminated Yersinia enterocolitica after various cultivation time and media

    表4 人工污染小腸結(jié)腸炎耶爾森菌經(jīng)不同培養(yǎng)基及不同時(shí)間培養(yǎng)后實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果Table 4 Real-time PCR results for artificially contaminated Yersinia enterocolitica after different cultivation time and media

    如圖4及表4所示,在雜菌體系中PSB培養(yǎng)基和TSB培養(yǎng)基均對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌有增菌作用。但根據(jù)Ct值可知PSB培養(yǎng)基的增菌效果較好,并僅需8h即可檢測(cè)出該菌的存在。

    3 結(jié)論與討論

    經(jīng)過(guò)普通PCR反應(yīng)后,結(jié)果顯示純菌體系中TSB培養(yǎng)基是效果較好的增菌液。TSB培養(yǎng)基增菌8h后條帶較暗,這可能是由于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌正處于延滯期,所以菌液中含菌量較低。然而PSB和ITC培養(yǎng)基增菌后并未有電泳條帶產(chǎn)生可能是由兩個(gè)原因所致:首先PSB對(duì)于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的增菌效果不如TSB好,這與計(jì)數(shù)結(jié)果一致;其次由于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在PSB培養(yǎng)基中為無(wú)色透明狀,所以很難獲得菌體沉淀從而致使提取DNA濃度較低。在雜菌體系中TSB培養(yǎng)基效果不如PSB培養(yǎng)基好,這可能是由于在TSB培養(yǎng)基中大多數(shù)細(xì)菌均適合增長(zhǎng),導(dǎo)致雜菌與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)形成了競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。PSB培養(yǎng)基則選擇性較強(qiáng),從而更適合小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的增長(zhǎng)。通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定的方法可以在雜菌系體系中分離出陽(yáng)性菌株,從而排除了PCR反應(yīng)假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。

    實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)果顯示,小腸結(jié)腸炎耶爾森菌處于純菌體系中時(shí)在TSB培養(yǎng)基中增菌效果優(yōu)于其他兩種增菌液,并且增菌24h時(shí)即可穩(wěn)定檢測(cè)。將該菌接種于陰性肉樣,用于模擬實(shí)際樣品檢驗(yàn)時(shí)的雜菌體系環(huán)境,此時(shí) PSB培養(yǎng)基的增菌效果好于TSB和ITC培養(yǎng)基,這與等[13]的研究結(jié)果基本一致,并且他還指出TSB培養(yǎng)基與PSB培養(yǎng)基相比更容易引起假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌接種量為480CFU/g的肉樣雜菌體系中,使用PSB增菌液對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌經(jīng)過(guò)8h的增菌即可進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)。

    小腸結(jié)腸炎耶爾森菌毒力檢測(cè)基因包括:質(zhì)粒上的黏附素基因(yadA)、毒力活化因子基因(virF),染色體上的黏附侵襲位點(diǎn)基因(ail)、耐熱腸毒素基因(ystA)[14]。在這4種毒力基因中,質(zhì)粒由于在菌種培養(yǎng)過(guò)程中易丟失,而Yst基因由于在多種致病菌中均出現(xiàn)而難以保證特異性檢測(cè)該菌,所以選定特異性較高的ail基因作為檢測(cè)目的基因。本實(shí)驗(yàn)利用Nakajima等[15]設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,該引物通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示特異性較好進(jìn)而極大的減少了假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生。在實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)中根據(jù)普通PCR中的引物選擇探針,本實(shí)驗(yàn)探針3'端使用的淬滅基團(tuán)并非為通常采用的TAMRA基團(tuán),而采用了非熒光基團(tuán)Eclipse。這種淬滅基團(tuán)由于本身不產(chǎn)生熒光而降低了本底信號(hào),可使反應(yīng)的效率和可靠性增加。

    隨著近年來(lái)多起食品安全事件的發(fā)生,食源性致病菌的檢測(cè)顯得尤其重要。傳統(tǒng)培養(yǎng)分離鑒定方法依然是檢測(cè)致病菌的主要方法,但其具有時(shí)間長(zhǎng)、工作量大以及需要具有一定經(jīng)驗(yàn)的人員操作等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的前增菌方法的研究發(fā)現(xiàn),利用PSB培養(yǎng)基對(duì)樣品進(jìn)行8h前增菌,結(jié)合實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。

    [1] 劉琳. 肉中革蘭氏陰性食源性致病菌[J].肉類(lèi)研究, 2008, 22(6): 33-45.

    [2] 鄭浩軒, 姜泊. 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌研究概況[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2006, 18(5): 416-419.

    [3] 王煒, 丁潔, 吳詠梅, 等. 幾種檢驗(yàn)豬扁桃體中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌方法的對(duì)比[J]. 職業(yè)與健康, 2007, 23(22): 2046-2047.

    [4] JOURDAN A D, JOHNSON S C J, WESLEY I V. Development of a fluorogenicnuclease PCR assay for detection of the ail gene of pathogenic Yersinia enterocolitica[J]. Appl Environ Microbiol, 2000,66(9): 3750-3755.

    [5] BHADURI S. Comparison of multiplex PCR, PCR-ELISA and fluorogenicnuclease PCR assays for detection of plasmid-bearing virulent Yersinia enterocolitica in swine feces[J]. Molecular and Cellular Probes, 2002, 16: 191-196.

    [6] VISHNUBHATLA A, FUNG D Y C, OBERST R D, et al. Rapidnuclease (TagMan) assay for detection of virulent strains of Yersinia enterocolitica[J]. Appl Environ Microbiol, 2000, 66: 4131-4135.

    [7] FUKUSHIMA H, TSUNOMORI Y, SEKI R. Duplex real-time SYBR Green PCR assay for detection of 17 species of food- or waterborne pathogenic in stools[J]. Clin Microbiol, 2003, 41(11): 5134-5146.

    [8] 鄭浩軒, 張明軍, 孫勇, 等. 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)腹瀉糞便中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的研究和評(píng)價(jià)[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 86(32):2281-2284.

    [9] JACOBSEN N R, BOGDANOVICH T, SKURNIK M, et al. A realtime PCR assay for the specific identification of serotype O:9 of Yersinia enterocolitica[J]. Journal of Microbiological Methods, 2005, 63(2):151-156.

    [10] FREDRIKSSON-AHOMAA M, HARTMANN B, SCHEU P, et al.Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica in meat using real-time PCR[J]. Journal of Consumer Protection and Food Safety, 2007, 2(2):202-208.

    [11] NILSSON A, LAMBERTZ S T, STALHANDSKE P, et al. Detection of Yersinia enterocolitica in food by PCR amplification[J]. Applied Microbiology, 1998, 26(2): 140-144.

    [12] BHADURI S, WESLEY I V, BUSH E J. Prevalence of pathogenic Yersinia enterocolitica strains in pigs in the United States[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(11): 7117-7121.

    [14] 王鑫, 邱海燕, 肖玉春, 等. 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌耐熱性腸毒素B基因(yst)初步研究[J]. 中國(guó)人獸共患病雜志, 2005, 21(6): 449-453.

    [15] NAKAJIMA H, INOUE M, MORI T, et al. Detection and identification of Yersinia pseudotuberculosis and pathogenic Yersinia enterocolitica by an improved polymerase chain reaction method[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1992, 30(9): 2484-2486.

    Selection of Pre-enrichment Methods for Yersinia enterocolitica

    NIU Lei1,ZHU Chang-qing1,2,ZHOU Guang-hong1,*,XU Xing-lian1, LI Bin1,JIANG Yun1
    (1. Nantional Center of Meat Quality and Safety Control, Nanjing Agricultual University, Nanjing 210095, China;2. Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing 200001, China)

    Yersinia enterocolitica has been paid so much attention as a kind of foodborne pathogen. The pre-enrichment of Yersinia enterocolitica was conducted by using the cultivation in TSB, PSB and ITC media. The pre-enrichment effect was evaluated by real-time PCR. The results indicated that the cultivation in TSB medium was better than other two media for pure Yersinia enterocolitica system. The enrichment time was 24 h. In addition, an enhanced sensitivity and shorten enrichment time (8 h) of Yersinia enterocolitica were achieved in the mixed microbe system containing TSB and ITC. Therefore, PSB can be used in the detection of Yersinia Enterocolitica in samples.

    Yersinia enterocolitica;pre-enrichment;real-time PCR;culture medium;foodborne pathogen

    TS251.1

    A

    1002-6630(2011)05-0168-04

    2010-05-13

    國(guó)際科技合作項(xiàng)目——食品質(zhì)量安全控制技術(shù)研究 (2009DFA31770);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071614)

    牛蕾(1985—),女,碩士研究生,主要從事肉品質(zhì)量安全檢測(cè)研究。E-mail:hingis1985@126.com

    *通信作者:周光宏(1960—),男,教授,博士,主要從事肉品科學(xué)研究。E-mail:ghzhou@njau.edu.cn

    猜你喜歡
    增菌耶爾森雜菌
    云南省金沙江中下游流域致病性耶爾森菌調(diào)查研究
    不同檢測(cè)方法對(duì)妊娠晚期B族鏈球菌的篩查比較
    3種改良B族鏈球菌檢測(cè)方法的檢測(cè)效果比較▲
    齊氏姬鼠-大絨鼠鼠疫疫源地內(nèi)鼠疫主要宿主動(dòng)物和指示動(dòng)物攜帶非鼠疫耶爾森菌的調(diào)查研究
    豬耶爾森氏菌病的分析、診斷和防控措施
    飼料博覽(2019年1期)2019-02-14 21:44:22
    茶樹(shù)菇感染雜菌的原因和控制方法
    生產(chǎn)食用菌 石灰用途廣
    交換生的計(jì)謀
    西寧野生動(dòng)物園靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物糞便中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測(cè)
    大腸桿菌O157:H7快速增菌培養(yǎng)基檢測(cè)效果的研究
    亚洲精品第二区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| av一本久久久久| 1024视频免费在线观看| 久久婷婷青草| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产一区二区三区综合在线观看| 欧美日韩精品网址| 黑人猛操日本美女一级片| 久久精品亚洲av国产电影网| 精品酒店卫生间| videos熟女内射| a级毛片黄视频| 国产亚洲欧美精品永久| 国产av精品麻豆| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产精品免费视频内射| 精品国产国语对白av| 美国免费a级毛片| 亚洲精品乱久久久久久| 大话2 男鬼变身卡| 尾随美女入室| 丝袜喷水一区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 我的亚洲天堂| 午夜老司机福利片| 伊人亚洲综合成人网| av有码第一页| 国产午夜精品一二区理论片| 一区二区三区激情视频| av电影中文网址| 精品第一国产精品| 国产一区亚洲一区在线观看| 69精品国产乱码久久久| 麻豆av在线久日| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品一国产av| 国产熟女欧美一区二区| 另类亚洲欧美激情| 久久久久久免费高清国产稀缺| 大片免费播放器 马上看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久99一区二区三区| 岛国毛片在线播放| 亚洲少妇的诱惑av| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久综合国产亚洲精品| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲成人国产一区在线观看 | 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲第一区二区三区不卡| 黑人欧美特级aaaaaa片| 午夜老司机福利片| 日本午夜av视频| av在线观看视频网站免费| 大陆偷拍与自拍| 久久鲁丝午夜福利片| 一区二区日韩欧美中文字幕| videos熟女内射| 日本91视频免费播放| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 韩国高清视频一区二区三区| 成年人午夜在线观看视频| 午夜日韩欧美国产| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 啦啦啦在线观看免费高清www| 人人妻人人澡人人看| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 精品久久久久久电影网| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 满18在线观看网站| 国产精品av久久久久免费| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲专区中文字幕在线 | 99香蕉大伊视频| 亚洲成人av在线免费| 人妻一区二区av| 亚洲第一av免费看| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲国产精品国产精品| 色网站视频免费| 五月天丁香电影| 美国免费a级毛片| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 免费观看性生交大片5| 天堂8中文在线网| 国精品久久久久久国模美| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 丝袜脚勾引网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 赤兔流量卡办理| 欧美在线黄色| 国产精品久久久久久久久免| 性色av一级| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲伊人久久精品综合| av在线老鸭窝| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美精品亚洲一区二区| 日本欧美国产在线视频| 老司机深夜福利视频在线观看 | 韩国精品一区二区三区| 秋霞在线观看毛片| 免费黄色在线免费观看| 麻豆乱淫一区二区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 免费看av在线观看网站| 久久精品久久久久久久性| 青春草国产在线视频| 蜜桃国产av成人99| 久久人人爽人人片av| 一本大道久久a久久精品| 国产成人av激情在线播放| 两个人看的免费小视频| 久久久久久久精品精品| 观看美女的网站| 国产av国产精品国产| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 午夜日韩欧美国产| av不卡在线播放| 不卡av一区二区三区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲精品中文字幕在线视频| 午夜精品国产一区二区电影| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 男女边摸边吃奶| 国产福利在线免费观看视频| 国产福利在线免费观看视频| 国产成人精品久久二区二区91 | 一级毛片 在线播放| 成人国产av品久久久| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲男人天堂网一区| 成人免费观看视频高清| 午夜福利在线免费观看网站| 国产精品av久久久久免费| av在线老鸭窝| 国产又爽黄色视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 欧美97在线视频| 蜜桃在线观看..| 看免费成人av毛片| 亚洲av电影在线进入| 国产成人精品在线电影| 精品国产乱码久久久久久男人| 日韩一本色道免费dvd| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲欧洲国产日韩| 一级片'在线观看视频| 久久热在线av| 嫩草影院入口| 国产 精品1| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 一区二区三区激情视频| 国产精品久久久久久久久免| tube8黄色片| 男人添女人高潮全过程视频| 久久av网站| 亚洲精品美女久久av网站| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 在线看a的网站| 日本色播在线视频| 精品久久蜜臀av无| 国产激情久久老熟女| 色视频在线一区二区三区| 在线观看免费高清a一片| 老司机影院成人| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 精品一品国产午夜福利视频| 国产xxxxx性猛交| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 女性生殖器流出的白浆| 国产福利在线免费观看视频| 中文天堂在线官网| 国产 一区精品| 国产一区二区在线观看av| 大片电影免费在线观看免费| 伦理电影免费视频| 综合色丁香网| 大片免费播放器 马上看| 亚洲一区中文字幕在线| 青春草国产在线视频| 飞空精品影院首页| 国产精品久久久av美女十八| 午夜福利一区二区在线看| 啦啦啦 在线观看视频| 最近中文字幕2019免费版| 午夜福利在线免费观看网站| 这个男人来自地球电影免费观看 | 色视频在线一区二区三区| 国产一区二区 视频在线| 免费高清在线观看日韩| 晚上一个人看的免费电影| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 考比视频在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 少妇 在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 丝袜在线中文字幕| 美女中出高潮动态图| 国产欧美亚洲国产| 十八禁人妻一区二区| 色吧在线观看| 伦理电影免费视频| 一区二区三区乱码不卡18| 欧美日韩av久久| 亚洲图色成人| 精品人妻在线不人妻| 捣出白浆h1v1| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 大码成人一级视频| 91精品国产国语对白视频| 欧美日韩av久久| av线在线观看网站| 亚洲精品一二三| 亚洲成色77777| 伊人亚洲综合成人网| 日日撸夜夜添| 日韩av免费高清视频| 国产亚洲最大av| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 黄色 视频免费看| 欧美在线黄色| 黄色一级大片看看| 青草久久国产| 在线观看三级黄色| 精品少妇久久久久久888优播| 在线 av 中文字幕| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产在线一区二区三区精| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲第一青青草原| 国产av码专区亚洲av| 亚洲国产欧美一区二区综合| 看非洲黑人一级黄片| 国产精品三级大全| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久久久精品性色| 999久久久国产精品视频| 在线观看免费视频网站a站| 国产高清不卡午夜福利| 婷婷色麻豆天堂久久| www.精华液| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 成年av动漫网址| 亚洲视频免费观看视频| 久久人妻熟女aⅴ| 精品国产乱码久久久久久小说| 搡老乐熟女国产| 男人爽女人下面视频在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 国产成人午夜福利电影在线观看| 看十八女毛片水多多多| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久久久精品久久久久真实原创| 大码成人一级视频| 亚洲国产欧美网| 亚洲熟女毛片儿| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久久久久久久久久久大奶| 久久久久视频综合| 嫩草影院入口| 丰满饥渴人妻一区二区三| avwww免费| 精品国产乱码久久久久久男人| 观看av在线不卡| 制服人妻中文乱码| 欧美人与性动交α欧美软件| 欧美日韩亚洲高清精品| h视频一区二区三区| 午夜福利免费观看在线| 亚洲精品,欧美精品| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 一本大道久久a久久精品| 亚洲图色成人| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 日韩大码丰满熟妇| 七月丁香在线播放| 国产高清国产精品国产三级| av国产久精品久网站免费入址| 啦啦啦啦在线视频资源| 日本欧美视频一区| 九草在线视频观看| 大香蕉久久成人网| 亚洲情色 制服丝袜| 久久久久久免费高清国产稀缺| 另类亚洲欧美激情| 男女之事视频高清在线观看 | 一区二区日韩欧美中文字幕| 色网站视频免费| 免费人妻精品一区二区三区视频| 一级片'在线观看视频| 99九九在线精品视频| 美女视频免费永久观看网站| 日韩精品免费视频一区二区三区| 香蕉丝袜av| 免费不卡黄色视频| 美女福利国产在线| 丝袜喷水一区| 久久天堂一区二区三区四区| 欧美精品一区二区大全| 日韩大片免费观看网站| 在线观看免费高清a一片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 午夜免费观看性视频| 欧美在线一区亚洲| 国产精品欧美亚洲77777| 不卡av一区二区三区| 97在线人人人人妻| 老汉色av国产亚洲站长工具| avwww免费| 在线观看人妻少妇| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 我要看黄色一级片免费的| 一边亲一边摸免费视频| 伦理电影大哥的女人| 美女大奶头黄色视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 嫩草影视91久久| 国产高清不卡午夜福利| 少妇人妻 视频| 黄色毛片三级朝国网站| 婷婷色av中文字幕| 免费在线观看完整版高清| 亚洲精品自拍成人| av网站在线播放免费| 超碰成人久久| 国产日韩欧美在线精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 哪个播放器可以免费观看大片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲精品中文字幕在线视频| 捣出白浆h1v1| 国产 一区精品| 久久99热这里只频精品6学生| 国产日韩欧美视频二区| 国产av一区二区精品久久| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲精品国产区一区二| kizo精华| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲图色成人| 大香蕉久久网| 少妇人妻久久综合中文| 一本久久精品| 精品亚洲成国产av| 在线看a的网站| 国产精品免费大片| 免费日韩欧美在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲七黄色美女视频| 777米奇影视久久| 精品久久久精品久久久| av在线app专区| 啦啦啦 在线观看视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 久久久久精品国产欧美久久久 | 搡老岳熟女国产| 成人亚洲欧美一区二区av| 日本vs欧美在线观看视频| 老司机影院成人| 精品一品国产午夜福利视频| 大话2 男鬼变身卡| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产一卡二卡三卡精品 | 大片电影免费在线观看免费| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲视频免费观看视频| 欧美精品一区二区免费开放| 国产成人免费无遮挡视频| av在线app专区| 成人毛片60女人毛片免费| 夫妻午夜视频| 亚洲精品在线美女| 亚洲精品美女久久av网站| 日本wwww免费看| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 观看av在线不卡| 久久韩国三级中文字幕| 91成人精品电影| 亚洲一码二码三码区别大吗| 制服人妻中文乱码| 中文字幕亚洲精品专区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲精品在线美女| 国产熟女欧美一区二区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 另类亚洲欧美激情| 在线观看免费午夜福利视频| 一区二区三区乱码不卡18| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲国产最新在线播放| 人妻 亚洲 视频| 日本午夜av视频| 国产精品免费视频内射| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久久欧美国产精品| 又大又黄又爽视频免费| 又黄又粗又硬又大视频| 宅男免费午夜| 亚洲免费av在线视频| 97精品久久久久久久久久精品| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲成人一二三区av| 人体艺术视频欧美日本| 久久午夜综合久久蜜桃| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美激情高清一区二区三区 | 国产野战对白在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 三上悠亚av全集在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 欧美少妇被猛烈插入视频| 男人舔女人的私密视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 黄片播放在线免费| 国产成人系列免费观看| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产一区二区三区av在线| 一级毛片我不卡| 人妻一区二区av| 久久久久国产一级毛片高清牌| 一区二区三区激情视频| 欧美日韩综合久久久久久| 久久影院123| 精品亚洲成a人片在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲国产欧美网| 午夜福利,免费看| 精品午夜福利在线看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产乱人偷精品视频| 日韩中文字幕视频在线看片| 中国国产av一级| 久久久久久人人人人人| 国产伦人伦偷精品视频| av天堂久久9| 亚洲图色成人| 又大又爽又粗| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲,欧美,日韩| 国产一区亚洲一区在线观看| 飞空精品影院首页| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 高清av免费在线| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美在线一区亚洲| 美女福利国产在线| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产麻豆69| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美日韩综合久久久久久| 一级毛片电影观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产黄色免费在线视频| 精品国产国语对白av| 宅男免费午夜| 少妇的丰满在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 国产黄色免费在线视频| 我要看黄色一级片免费的| 欧美黑人精品巨大| 一区二区av电影网| 97精品久久久久久久久久精品| 人体艺术视频欧美日本| 看免费av毛片| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产成人免费观看mmmm| 老司机靠b影院| 一级,二级,三级黄色视频| 国产在视频线精品| 欧美日本中文国产一区发布| svipshipincom国产片| tube8黄色片| 日韩制服骚丝袜av| 国产精品一二三区在线看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 热re99久久国产66热| 亚洲国产精品999| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久性视频一级片| 在线观看一区二区三区激情| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产精品嫩草影院av在线观看| 色94色欧美一区二区| 久久久久久久精品精品| 考比视频在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲精品,欧美精品| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲成人手机| 日本黄色日本黄色录像| 中文字幕最新亚洲高清| 精品视频人人做人人爽| 日本vs欧美在线观看视频| 中文字幕亚洲精品专区| 一区在线观看完整版| 性色av一级| 亚洲精品视频女| 欧美日韩精品网址| av.在线天堂| 一区二区三区乱码不卡18| 色94色欧美一区二区| 国精品久久久久久国模美| 国产不卡av网站在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 午夜影院在线不卡| 中文字幕色久视频| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲欧洲国产日韩| 欧美日韩亚洲高清精品| 日本色播在线视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | netflix在线观看网站| 精品酒店卫生间| 亚洲精品av麻豆狂野| 啦啦啦 在线观看视频| 成人漫画全彩无遮挡| 宅男免费午夜| 亚洲情色 制服丝袜| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲精品国产色婷婷电影| 两个人免费观看高清视频| 丰满乱子伦码专区| 另类亚洲欧美激情| 免费av中文字幕在线| 欧美黑人精品巨大| 欧美国产精品一级二级三级| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲第一av免费看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产免费又黄又爽又色| 大片电影免费在线观看免费| 精品一区二区三卡| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 18禁动态无遮挡网站| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产亚洲一区二区精品| 国产精品国产三级专区第一集| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| av电影中文网址| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 高清欧美精品videossex| 国产精品一区二区在线观看99| 国精品久久久久久国模美| 久久精品人人爽人人爽视色| 国精品久久久久久国模美| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 精品视频人人做人人爽| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 在线观看三级黄色| 亚洲欧美清纯卡通| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产成人免费无遮挡视频| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲综合色网址| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲精品乱久久久久久| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲成国产人片在线观看| 日本欧美视频一区| 精品久久蜜臀av无| 在线观看人妻少妇| 久久久国产一区二区| 午夜免费观看性视频| 国产一区二区 视频在线| a级片在线免费高清观看视频| 久久综合国产亚洲精品| 欧美激情极品国产一区二区三区| 91精品伊人久久大香线蕉| 天天添夜夜摸|