支原體和肺支原體雙通道熒光定量PCR法檢測鼠支原體感染試驗

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(1.浙江大學實驗動物中心，浙江杭州 310058；2.浙江大學附屬兒童醫(yī)院)

國家科委、衛(wèi)生部在有關(guān)實驗動物管理法規(guī)中要求，清潔級以上實驗動物大、小鼠應(yīng)排除鼠支原體和肺支原體。

本文通過已建立，能同時檢測支原體通用型和肺支原體特異型的雙通道熒光定量PCR方法，檢測清潔級和普通級大鼠、小鼠支原體和肺支原體的感染，了解和比較在不同生長環(huán)境下大鼠、小鼠支原體的感染情況。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級SD大鼠150只、ICR小鼠120只， C57小鼠100只，普通級SD大鼠104只、ICR小鼠97只，C57小鼠76只。

1.2標本DNA的獲得 采集大鼠、小鼠、兔的鼻腔和氣管標本各1份，加入生理鹽水500 μL，震蕩混勻，12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入50 μL抽提裂解液混勻(10 mmol/L Tri-HCl，pH 7.6, 5 mmol/L EDTA，0.5% SDS),置100℃煮沸10 min, 12 000 r/min離心5 min，取3 μL上清液作為PCR模板。

每只大鼠或小鼠只要其中的一份標本呈陽性，即判定為陽性。

1.3TaqMan探針法支原體通用型和肺支原體特異型雙通道熒光定量PCR法設(shè)計 PCR反應(yīng)體系引物、探針由上海某生工生物工程有限公司合成，探針經(jīng)高效液相(HPLC)純化。目的片段160 bp。

雙通道熒光定量PCR反應(yīng)體系為25 μL，引物和探針濃度分別為0.4 μmol/L和0.2 μmol/L，熒光定量PCR反應(yīng)液用2×熒光定量PCR 緩沖液(其中包括dNTP、MgCl2和熱啟動Taq酶等，大連某生物工程有限公司TAKARA提供)，上清液模板為3 μL，其余用ddH2O補足至25 μL。

采用ABI 7500儀器進行熒光定量PCR反應(yīng)。熒光定量PCR反應(yīng)循環(huán)和溫度設(shè)置為94℃預變性2 min后，94℃、15 s，60℃、60 s為一個循環(huán)，共循環(huán)40次。

2 試驗結(jié)果

清潔級SD大鼠150只、ICR小鼠120只，C57小鼠100只，普通級SD大鼠104只、ICR小鼠97只，C57小鼠76只的鼻腔和氣管標本，進行支原體和肺支原體熒光定量PCR法檢測。結(jié)果詳見表1。

表1 鼠支原體和肺支原體感染情況檢測結(jié)果

由表1可見，比較清潔級和普通級大鼠、小鼠支原體的總體感染情況，普通級大鼠、小鼠的總體感染率明顯高于清潔級動物(X2=4.413,P=0.036)。

3 分析討論

支原體感染可以引起實驗動物大、小鼠的嚴重疾病。對實驗動物有病原學意義的支原體包括肺支原體、溶神經(jīng)支原體和關(guān)節(jié)炎支原體等。鼠肺支原體可以引起大、小鼠呼吸系統(tǒng)疾病，包括鼻炎、中耳炎、氣管炎和肺炎。此外，還可能侵害生殖系統(tǒng)，引起母鼠產(chǎn)仔率下降。

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展和普及，PCR檢測技術(shù)已體現(xiàn)出特異、靈敏、快速的優(yōu)勢。Goto等(1994)[1]用PCR法和分離培養(yǎng)法檢測大鼠鼻腔、氣管和咽拭子中的肺支原體，在鼻腔和氣管中，PCR法的陽性率為62.9%和57.4%，而分離培養(yǎng)法的陽性率為55.5%和51.8%。Takahashi(2004)[2]根據(jù)肺支原體ITS 序列設(shè)計引物，檢測靈敏度達10 pg/5 μL，通過Southern雜交可提高到100 fg/5 μL；熒光核酸酶PCR能檢測到模板中10個DNA拷貝[3]，均顯示了很高的敏感性。

本文采用能同時檢測支原體和肺支原體的雙通道熒光定量PCR方法，最低也可檢測到10個肺支原體；且使用該法，只要通過一次熒光定量PCR，就能確認是否有支原體感染，達到了快速、敏感和定量的效果。結(jié)果表明，普通級大鼠、小鼠支原體的總體感染率明顯高于清潔級大鼠、小鼠。在動物實驗中應(yīng)慎用普通級，使用清潔級實驗動物時也應(yīng)嚴格遵照實驗要求。本試驗所用的普通級大鼠、小鼠均來自清潔級大鼠、小鼠，只因?qū)嶒炐枰?，飼養(yǎng)在非屏障系統(tǒng)環(huán)境中。在清潔級大鼠中仍然發(fā)現(xiàn)1例支原體感染，說明在實驗過程中，由于實驗本身、藥物、手術(shù)、人員進出、器械消毒等多因素的影響，容易受到支原體感染。盡管支原體具有致病性，但多數(shù)時候以隱性感染存在。這種隱性感染容易被忽視，從而嚴重影響實驗結(jié)果，必須引起注意。

[1]Goto K, Kunita S, Terada E, Itoh T. Comparison of polymerase chain reaction and culture methods for detection of Mycoplasma pulmonis from nasal, tracheal and oral swab samples of rats[J].Jikken Dobutsu,1994,43(3):413-415.

[2]Takahashi-Omoe H, Omoe K, Matsushita S, Kobayashi H, Yamamoto K.Polymerase chain reaction with a primer pair in the 16S-23S rRNA spacer region for detection of Mycoplasma pulmonis in clinical isolates[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis,2004,27(2):117-128.

[3]Loganbill JK, Wagner AM, Besselsen DG.Detection of Mycoplasma pulmonis by fluorogenic nuclease polymerase chain reaction analysis[J].Comp Med,2005,55(5):419-424.