萬壽菊中葉黃素的提取皂化工藝研究

趙潔,尹俊濤,郭亞可,李超鵬,陳文

(石河子大學(xué)藥學(xué)院,832000)

萬壽菊中葉黃素的提取皂化工藝研究

趙潔,尹俊濤,郭亞可,李超鵬,陳文

(石河子大學(xué)藥學(xué)院,832000)

該文以四氫呋喃和乙醇的二元混合溶劑為主要提取劑,對萬壽菊顆粒中葉黃素的提取皂化工藝進行了研究。實驗分別考察了加入四氫呋喃與乙醇的比例、反應(yīng)時間、料液比、加水體積、加堿量、反應(yīng)溫度對葉黃素得率的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選取影響較大的4個因素采用L9(34)正交試驗考察對葉黃素得率的影響,以得率為指標(biāo),確定最佳工藝條件為A1B2C2D3,即料液比為1∶20,加堿質(zhì)量1.6 g,反應(yīng)時間4 h,THF∶乙醇=2∶8。由此可知:此條件下葉黃素得率為1.14%,所得浸膏中葉黃素的含量達到10.32%。

萬壽菊;葉黃素;提取皂化;正交試驗

葉黃素是天然類胡蘿卜色素的一種,又名“植物黃體素”[1],具有色澤鮮艷、著色力強、安全無毒、富含營養(yǎng)等特點,被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥、煙草、禽類飼料等領(lǐng)域[2-4]。隨著對葉黃素藥理研究的深入,發(fā)現(xiàn)葉黃素在保護視覺、預(yù)防白內(nèi)障、防治動脈硬化、增強免疫力等方面起著重要作用。因此,美國FDA1995年將葉黃素列入食品補充劑名單。

萬壽菊是富含葉黃素類物質(zhì)的天然原料[5],目前葉黃素的提取原料主要為萬壽菊。近年來國外對于葉黃素提取的研究發(fā)展很快,我國對萬壽菊色素研究開發(fā)得較少,尤其是對高純度葉黃素的研究開發(fā)。目前,國內(nèi)提取葉黃素的大多數(shù)廠家采用的工藝是:應(yīng)用正己烷、石油醚[6]、食用油脂或者四氫呋喃和乙醇的混合溶劑為提取溶劑先從萬壽菊中提取出葉黃素酯,再加入金屬強堿使葉黃素直鏈脂肪酸酯皂化,形成游離葉黃素[7]。其步驟較繁瑣、溶劑消耗較多、成本較高。本研究采用四氫呋喃、乙醇和金屬堿液的三元混合溶劑為主要提取劑,使提取、皂化同步進行,與文獻報道的傳統(tǒng)工藝:正己烷和95%乙醇(體積比3∶2),提取溫度60 ℃,提取時間4～5h。提取次數(shù)5～6次,液料比15∶1(mL∶g);皂化溫度55～60℃,皂化時間6 h[6],相比之下本實驗可節(jié)約試劑和減少能源損耗,并對提取皂化工藝進行優(yōu)化,提高產(chǎn)品得率,使該工藝更適合于工業(yè)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

萬壽菊顆粒,由新疆石河子市農(nóng)五師八十四團萬壽菊加工廠提供。葉黃素對照品(含量≥95%),購買于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 試劑

四氫呋喃(THF)、乙醇、乙酸乙酯等,均為分析純;乙腈、甲醇,均為色譜純。

1.3 主要儀器設(shè)備

島津高效液相色譜儀(SIL-20A自動進樣器,SPD-M20A型光電二極管陣列檢測器,CTO-10ASVP柱溫箱,LC-20AT二元泵,DGU-20A5真空脫氣機 ,日本島津);HJ-6A多頭磁力攪拌器(山東菏澤市祥龍電子科技有限公司);SEMCO-R206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司);SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 葉黃素的HPLC檢測[8-9]

色譜條件:色譜柱為 Waters C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱;流動相為甲醇∶乙腈(40∶60),流速為1 mL/min,柱溫為30 ℃,檢測波長為446 nm;進樣體積為10μL。

對照品母液的配制:精密稱取2.24 mg葉黃素對照品用乙腈溶解,定容至25 mL容量瓶中,制得濃度為89.6μg/mL的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別準(zhǔn)確移取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL上述對照品母液至10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,用0.22μm微孔濾膜過濾后。按葉黃素的 HPLC測定方法,以葉黃素峰面積為縱坐標(biāo)(Y),溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其方程為 Y=63483.86X-337.72,R2=1.000,線性范圍:8.96～44.8μg/mL。

1.4.2 游離葉黃素樣品的制備

取萬壽菊顆粒,粉碎,過60目篩,稱取適量過篩后粉末置于圓底燒瓶,加入一定量的 THF、乙醇(95%)、KOH溶液,在一定溫度下,反應(yīng)一段時間后,過濾、濾液用2.5 moL/L HCl調(diào)節(jié)p H至中性、蒸干濾液、乙酸乙酯溶解蒸干產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶定容,精密移取2.00 mL溶液,用乙腈定容至10 mL棕色容量瓶中,測定。注意盡量避光。

1.4.3 單因素考察及正交試驗

按“1.4.2”項下方法,分別對不同的 THF/乙醇的比例、反應(yīng)時間、料液比、加水體積、加堿量、反應(yīng)溫度進行單因素考察實驗,在此基礎(chǔ)上選取影響較大四個因素采用L9(34)正交試驗考察對葉黃素得率的影響,最終得到提取皂化最優(yōu)工藝。

1.4.4 葉黃素得率的計算

根據(jù) HPLC測得的葉黃素含量,計算提取葉黃素質(zhì)量,再由式1計算葉黃素得率。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素考察

2.1.1 THF/乙醇比例的考察

取萬壽菊顆粒,按“1.4.2”方法加入不同比例的THF、乙醇(95%),以葉黃素峰面積為指標(biāo),考察THF/乙醇比例對實驗的影響。試驗結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知:THF/乙醇的比例對提取皂化的影響較大,在7∶3～0∶10范圍內(nèi)時,葉黃素峰面積呈現(xiàn)拋物線趨勢,最高得率為0.53%。

圖1 不同比例的THF/乙醇對提取皂化效果的影響Fig.1 Different ratios of THF/ethanol on the Influences of Extraction rate

2.1.2 反應(yīng)時間的考察

按“1.4.2”方法選擇不同提取皂化時間制備樣品,以葉黃素峰面積為指標(biāo),考察時間對實驗的影響,試驗結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知:提取皂化時間對產(chǎn)物中游離葉黃素的含量變化有較大的影響。隨著皂化時間的延長,產(chǎn)品中游離葉黃素的含量首先不斷增加,當(dāng)超過4 h后影響不顯著,說明反應(yīng)已基本達到平衡,最高得率為0.80%。

圖2 不同反應(yīng)時間對提取皂化效果的影響Fig.2 Different time on the Influences of Extraction rate

2.1.3 料液比的考察

取萬壽菊顆粒,按“1.4.2”方法按不同的料液比制備樣品,以葉黃素峰面積為指標(biāo),考察料液比對實驗的影響,試驗結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知:當(dāng)液料比在1∶10～1∶40范圍內(nèi),隨著皂化液體積的增加,產(chǎn)品中游離葉黃素的含量逐漸升高,當(dāng)料液比超過1∶40后,葉黃素峰面積基本保持平衡,最高得率為0.93%?？紤]到四氫呋喃易燃且對皮膚、眼睛和呼吸器官有刺激性,使用過多溶劑浪費大,且給溶劑回收帶來困難,因而液料比不應(yīng)低于1∶40。

圖3 不同料液比對提取皂化效果的影響Fig.3 Different Liquid to material ratio on the Influences of Extraction rate

2.1.4 加水體積的考察

取萬壽菊顆粒,按“1.4.2”方法。加入相同質(zhì)量的KOH于不同體積的蒸餾水中制備樣品,以葉黃素峰面積為指標(biāo),考察加水體積對實驗的影響,試驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同加水體積對提取皂化效果的影響Fig.4 Different volumes of water on the Influences of Extraction rate

由圖4可知:當(dāng)水與 THF-乙醇混合溶液的比例在1∶2～1∶20范圍內(nèi),隨著皂化液體積的增加,產(chǎn)品中游離葉黃素的含量逐漸升高,當(dāng)其超過1∶20后,葉黃素峰面積略有下降,最高得率為1.13%,所以選擇該比例為1∶20較為適宜。

2.1.5 加堿量的考察

取萬壽菊顆粒,按“1.4.2”方法加入不同質(zhì)量的 KOH于相同體積的蒸餾水中制備樣品,以葉黃素峰面積為指標(biāo),考察因素對實驗的影響,試驗結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知:隨著加堿量的增加,提取得到的葉黃素也呈上升趨勢,當(dāng)溶液達到飽和時,葉黃素得率為1.14%。但是考慮到飽和的KOH溶液耗堿量較大,成本較高,故加堿量需進一步優(yōu)化。

圖5 不同加堿質(zhì)量對提取皂化效果的影響Fig.5 Different quality of KOH on the Influences of Extraction rate

2.1.6 提取皂化溫度的考察

取萬壽菊顆粒,按“1.4.2”方法在不同溫度的恒溫水浴下提取皂化2 h,制備樣品。以葉黃素峰面積為指標(biāo),考察溫度對實驗的影響,試驗結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同溫度對提取皂化效果的影響Fig.6 Different temperature on the Influences of Extraction rate

由圖6可知:溫度在40℃時,葉黃素峰面積最大,其得率為0.94%。這是由于較低的溫度不利于葉黃素酯在皂化體系中分散,而皂化溫度過高則會導(dǎo)致葉黃素的分解,并且 THF和乙醇都易揮發(fā)。因此,皂化溫度控制在40℃為宜。

2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上,在上述單因素中選取對提取皂化效果有顯著性影響的四個因素,即 THF與乙醇的比例、料液比、加堿量、反應(yīng)時間,采用正交試驗法進一步考察各因素對提取皂化效果的影響。選擇3個水平,以產(chǎn)品中游離葉黃素得率為考核指標(biāo),采用L9(34)正交表(表 1)進行試驗,結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。

由表2的極差值R和表3的方差分析結(jié)果可以看出,4種因素對葉黃素得率的影響程度依次為時間＞加堿質(zhì)量＞THF∶乙醇＞料液比,最佳工藝條件為A1B2C2D3,即料液比為1∶20,加堿質(zhì)量1.6 g,反應(yīng)時間4 h,THF∶乙醇=2∶8。

表1 提取皂化工藝因素水平Tab.1 Levels and facts

表3 方差分析Tab.3 Variance analysis

2.3 驗證試驗

取萬壽菊顆粒,按“1.4.2”方法和正交試驗的最佳工藝提取皂化3次,計算得到平均葉黃素得率為1.14%。所得浸膏中,平均葉黃素的含量達到10.32%,RSD為2.05%。

3 討論

1)由萬壽菊顆粒提取皂化工藝合理,研究確定最優(yōu)工藝參數(shù)為:料液比為1∶20,加堿質(zhì)量1.6 g,反應(yīng)時間4 h,THF∶乙醇=2∶8。

2)傳統(tǒng)工藝所得浸膏中葉黃素含量為2%～7%[6,10],而在本實驗條件下得到浸膏中游離葉黃素的含量達到10.32%,葉黃素得率為1.14%。

3)本實驗采用混合溶劑將葉黃素的提取實驗和皂化實驗同步進行,減少了操作步驟,降低損耗,節(jié)約成本,適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

4)葉黃素的穩(wěn)定性受諸多因素影響,對光、熱、氧敏感,極易被氧化,實驗操作過程中應(yīng)盡量避免光照、高溫,隔絕氧氣。

[1]劉洪海,杜平,梁紅兵,等.萬壽菊花中葉黃素酯的提取及皂化工藝的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2009,(3):71-74,77.

[2]李高峰,聶永亮,王佩維.葉黃素浸膏的皂化工藝研究[J].食品科技,2009,(08):172-176.

[3]趙小陽,田河山.葉黃素的測定方法研究[J].飼料廣角,2007,(21):40-42.

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[5]李高峰,聶永亮,王佩維.萬壽菊花萃取物中葉黃素的分離與純化[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(7):1688-1689.

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Extraction and Saponification Technology of Lutein from Marigold

ZHAO Jie,YIN Juntao,GUO Yake,LI Chaopeng,CHEN Wen
(Department of Pharmacy,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

In this paper,Extraction and Saponification technology of Lutein esters inTagetes erectaL.particle were investigated systemically.The mixed solvent of THF and Alc is main extraction solvent.The affecting factors such as the ratio of THF and Alc,reaction time,the ratio of reaction solution to material(mL/g),the addition of water,the addition of KOH in reaction solution and reaction temperature were investigate in singe factor experiments.An orthogonal test table L9(34)was used to optimized the affecting factors on the base of singe factor experiments.The content of free Lutein in the end product was determined by HPLC.The results showed that the optimal Extraction and Saponification parameter was:1.6g KOH,4h,the ratio of 1∶20(mL/g),ratio of THF and Alc is 2∶8.Under this condition,the yield of Free Lutein reach 1.14%and the content of Free Lutein reach 10.32%in extracta sicca.

Marigold;lutein;extraction and saponification;orthogonal test

R97 < class="emphasis_bold">文獻標(biāo)識碼:A

A

2010-07-08

新疆兵團工業(yè)科技攻關(guān)項目(2009GG35),科技部科技人員服務(wù)企業(yè)行動項目(SQ2009G J G4102765)

趙潔(1985-),女,碩士生,專業(yè)方向為藥物新劑型的研究。

陳文(1967-),男,教授,從事藥物新劑型的研究;e-mail:chen-wen2000@126.com。