單關(guān)節(jié)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中uPA、uPAR、PAI-1蛋白表達(dá)及意義

孫建華,李子恢,史晨輝,潘曉琳,陳磊,王永明,李林,李寬新

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,石河子832002;2石河子市人民醫(yī)院,石河子832000)

單關(guān)節(jié)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中uPA、uPAR、PAI-1蛋白表達(dá)及意義

孫建華1,李子恢2,史晨輝1,潘曉琳1,陳磊1,王永明1,李林1,李寬新1

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,石河子832002;2石河子市人民醫(yī)院,石河子832000)

為探討尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,uPA)及其受體(urokinase-type plasminogen activator receptor,uPAR)、纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor,PAI-1)在單關(guān)節(jié)發(fā)病類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)的表達(dá)。采用免疫組化方法檢測(cè)13例單關(guān)節(jié)發(fā)病RA、19例典型RA和20例正?；そM織中uPA、u PAR、PAI-1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示:13例單關(guān)節(jié) RA滑膜組織中 uPA、u PAR、PAI-1陽(yáng)性表達(dá)主要分布在滑膜襯里細(xì)胞、滑膜下層單核細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞,陽(yáng)性表達(dá)部位與典型RA相同,但表達(dá)強(qiáng)度明顯低于典型RA(P＜0.05)。與正?；そM織相比,單關(guān)節(jié) RA滑膜中uPA、uPAR、PAI-1蛋白表達(dá)明顯增高(P＜0.05)。由此可知:單關(guān)節(jié)RA滑膜組織中uPA、uPAR、PAI-1表達(dá)明顯低于典型 RA滑膜組織,可能與單關(guān)節(jié)RA為典型RA病程早期階段,滑膜中uPA、uPAR、PAI-1蛋白尚處于低水平表達(dá)階段有關(guān)。

關(guān)節(jié)炎;類(lèi)風(fēng)濕;尿激酶;免疫組織化學(xué)

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性進(jìn)行性全身結(jié)締組織疾病,其病理特征是滑膜細(xì)胞高度增生并伴有大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。過(guò)度增殖的滑膜細(xì)胞分泌大量蛋白裂解酶,造成關(guān)節(jié)軟骨及骨破壞。其中絲氨酸蛋白酶家族中的尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen ac-tivator,uPA)在軟骨及骨基質(zhì)的降解中發(fā)揮著重要作用。

大量研究表明,RA滑膜中uPA及其受體蛋白(urokinase-type plasminogen activator receptor,u PAR)表達(dá)明顯高于其他炎癥性關(guān)節(jié)[1]。但有關(guān)uPA、uPAR及纖溶酶原抑制劑(plasminogen activator inhibitor,PAI-1)在單關(guān)節(jié)RA滑膜組織中表達(dá),尚未見(jiàn)報(bào)道。我們選擇本院于1998年9月至2006年5月,單關(guān)節(jié)RA患者13例,采用免疫組織化學(xué),檢測(cè)滑膜組織中 uPA、uPAR、PAI-1的分布及表達(dá),報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

單膝關(guān)節(jié) RA13例,男 7例,女5例,年齡12～70歲,平均年齡34.6歲。全部以單膝關(guān)節(jié)滑膜炎就診,其中左膝8例,右膝5例。關(guān)節(jié)鏡檢結(jié)合滑膜病檢符合 RA。隨訪3～11年,平均6.9年,隨訪過(guò)程中出現(xiàn)多關(guān)節(jié)發(fā)病,符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ARA)1987年診斷標(biāo)準(zhǔn),確診為RA。另取典型RA19例滑膜標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照組。正常20例滑膜組織,均取自無(wú)關(guān)節(jié)病變的膝關(guān)節(jié)外傷患者。

1.2 標(biāo)本分組

A組:單關(guān)節(jié) RA13例;B組:典型 RA19例;C組:正?；?0例。

1.3 組織學(xué)檢測(cè)

常規(guī)蘇木素、伊紅(HE)染色。

1.4 免疫組化檢測(cè)

主要試劑為 SP試劑盒(武漢博士德公司),抗uPA、uPAR、PAI-1單克隆抗體,工作濃度分別為1∶100、1∶150、1∶150,DAB 顯色液濃度為 0.04%。采用SP免疫組織化學(xué)技術(shù):石蠟切片常規(guī)脫蠟,10%的正常羊血清室溫封閉20 min,依次加入一抗,生物素標(biāo)記二抗,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 SP,DAB-H2O2顯色溶液,蘇木素復(fù)染,中性樹(shù)脂封片,每個(gè)步驟間用 PBS沖洗3次,每次5 min,顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5 結(jié)果判斷

1)細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜中出現(xiàn)明顯的棕色或棕黃色顆粒為uPA、uPAR、PAI蛋白陽(yáng)性細(xì)胞。

2)參照 Szekanecz等[2-3]方法:400倍高倍鏡視野下滑膜組織中的陽(yáng)性細(xì)胞占全部細(xì)胞的比例分為:陰性(-):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%;陽(yáng)性(+):陽(yáng)性細(xì)胞占10%～40%;陽(yáng)性(++):40%～70%;陽(yáng)性(+++)＞70%。其中染色陽(yáng)性包括(+)、(++)和(+++),強(qiáng)陽(yáng)性包括(++)和(+++)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 10.0軟件包,采用兩樣本構(gòu)成比(率)比較的χ2檢驗(yàn)。P＜0.05:差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE結(jié)果

由圖1可知:A組滑膜襯里層細(xì)胞明顯增生,部分滑膜增生形成絨毛。大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),部分有淋巴小結(jié)形成。由圖2可知:B組:鏡下 HE結(jié)構(gòu)同A組。C組:滑膜表面為3層襯里層細(xì)胞,無(wú)明顯增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織HE染色Fig.1 Rheumatoid artenitis synorium tissue

圖2正?；そM織HE染色Fig.2 Normal synovium tissue

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

uPA、uPAR、PAI-1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在滑膜襯里層和滑膜下層,其中滑膜襯里細(xì)胞、單核細(xì)胞和部分漿細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中呈陽(yáng)性染色,滑膜下層的小血管內(nèi)皮細(xì)胞亦呈陽(yáng)性染色。各組抗原陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組滑膜組織uPA、u PAR、PAI-1的表達(dá)Tab.1 Expnession of various synovium tissues such as uPA、u PAR、PAI-1

2.3 uPA、uPAR、PAI-1蛋白陽(yáng)性結(jié)果比較

結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知:A組與B組相比,3種蛋白陽(yáng)性表達(dá)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);A組與C組相比,3種蛋白陽(yáng)性表達(dá)數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),uPA強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),而 uPAR、PAI-1蛋白強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。此外,本實(shí)驗(yàn)還觀察到凡在 uPA表達(dá)陽(yáng)性的病例,uPAR、PAI-1蛋白多呈陽(yáng)性,但表達(dá)強(qiáng)度稍低于uPA組。

表2 各組滑膜組織中uPA、u PAR、PAI-1蛋白陽(yáng)性率比較Tab.2 Comparision of protein positiuty rates in various syrovium tissues such as uPA、u PAR、PAI-1

3 討論

1)RA是一種慢性進(jìn)行性結(jié)締組織病變,侵犯全身多個(gè)關(guān)節(jié),滑膜組織最先受累。其基本病理學(xué)特征是滑膜組織增生,伴有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及血管翳形成。過(guò)度增殖的滑膜細(xì)胞分泌大量的蛋白裂解酶,對(duì)軟骨及骨基質(zhì)的降解起著關(guān)鍵作用。參與基質(zhì)降解過(guò)程的蛋白裂解酶有4類(lèi),目前研究最多的為絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)。

uPA屬于絲氨酸蛋白酶家族,主要介導(dǎo)細(xì)胞周?chē)|(zhì)蛋白的降解,從而直接降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜[4],同時(shí)可以激活其他蛋白酶,協(xié)同參與軟骨及骨基質(zhì)降解過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn),uPA在RA、骨性關(guān)節(jié)炎(osteroarthritis,OA)等炎癥性關(guān)節(jié)病的軟骨、滑膜、滑液及血漿中均有表達(dá)。uPA、uPAR、PAI-1蛋白在RA滑膜組織中表達(dá)明顯高于正常人及OA滑膜組織[4]。

本文19例RA滑膜標(biāo)本免疫組化染色結(jié)果提示:uPA、uPAR、PAI-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯高于正常組,表達(dá)強(qiáng)度明顯高于單關(guān)節(jié)RA組,結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。RA滑膜中 uPA、uPAR、PAI-1蛋白強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),可能與RA類(lèi)似于局限侵襲性生長(zhǎng)的腫瘤有關(guān)。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),RA滑膜組織中 uPA、uPAR、PAI-1蛋白具有良好的協(xié)同性。在uPA表達(dá)陽(yáng)性的病例中、uPAR及PAI-1多呈陽(yáng)性表達(dá),這說(shuō)明在uPA系統(tǒng)介導(dǎo)的纖溶降解過(guò)程中,uPA與uPAR具有相互促進(jìn)的作用,以適應(yīng)其蛋白溶解活動(dòng)的需要。而PAI-1與uPA的協(xié)同增高,可能與細(xì)胞膜表面的uPAR上調(diào)有關(guān),以適應(yīng)同時(shí)表達(dá)增強(qiáng)的uPA與uPAR。

2)uPA通常是以無(wú)活性的單鏈形式從細(xì)胞中釋放出來(lái),再轉(zhuǎn)變成有活性的雙鏈分子。研究證實(shí)RA病變滑膜組織中的滑膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、炎性浸潤(rùn)細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞均能表達(dá)uPA、uPAR等多種成分[5]。且RA患者滑液中uPA、uPAR抗原活性的增高程度與臨床上RA的病情活動(dòng)性和軟骨及骨破壞的放射線表現(xiàn)密切相關(guān)[6]。

單關(guān)節(jié) RA病變僅累及一個(gè)關(guān)節(jié),它是典型RA的初始階段,還是應(yīng)用非甾體類(lèi)藥物而使病變局限,值得進(jìn)一步研究。

有關(guān)uPA、uPAR、PAI-1在單關(guān)節(jié) RA滑膜表達(dá),尚未見(jiàn)報(bào)道。我們選擇13例以單關(guān)節(jié)發(fā)病,關(guān)節(jié)鏡檢結(jié)合病理檢查符合 RA,隨訪中確診 RA,檢測(cè)其滑膜中uPA、uPAR、PAI-1蛋白表達(dá)。研究結(jié)果表明,組織學(xué)上單關(guān)節(jié)RA滑膜組織與典型RA無(wú)明顯區(qū)別,表現(xiàn)為滑膜組織增生及大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),部分病例可見(jiàn)淋巴小結(jié)形成。92%滑膜組織中表達(dá)uPA、uPAR蛋白,77%表達(dá)PAI-1蛋白。陽(yáng)性細(xì)胞主要為滑膜襯里層細(xì)胞、滑膜下層單核細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞,陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)部位與典型RA滑膜相似。單關(guān)節(jié)RA滑膜組織中uPA、uPAR、PAI-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與RA組相比差異無(wú)顯著性,較正?；っ黠@增高,但表達(dá)強(qiáng)度明顯低于典型 RA。這可能與單關(guān)節(jié)RA為典型RA的早期階段,病情活動(dòng)相對(duì)局限,滑膜組織中 uPA、uPAR、PAI-1抗原尚處于低水平表達(dá)階段有關(guān)。

[1]郭曉蘭.尿激酶型纖溶酶原激物受體及炎性關(guān)節(jié)病[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)內(nèi)科學(xué)分冊(cè),2005,32(3):123-129.

[2]Szekanecz Z,Haines G K,Koch A E.Differential expression of the urokinase receptor(CD87)in arthritic and normal synovial tissue[J].J Clin Pathol,1997,50:314-319.

[3]李寬新,王鑫,史晨輝.骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織中 uPA、uPAR、PAI-1表達(dá)及意義[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2008,26(6):728-731.

[4]何斌,史晨輝,王永明。尿激酶型纖溶酶原激物系統(tǒng)與軟骨降解[J].農(nóng)墾醫(yī)學(xué),2005,27(3):229-231.

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[6]周京國(guó),郭曉蘭,唐中,等.可溶性尿激酶型纖溶酶原激物受體在 RA患者血漿和滑液的水平及其臨床意義[J].中華風(fēng)濕學(xué)雜志,2006,10(12):713-716.

Expression of Urokinase Type Plasminogen Activator and its Receptor and Plasminogen Activator Inhibitor in Rheumatoid Arthritis with Solitary Joint

SUN Jianhua1,LI Zihui2,SHI Chenhui1,PAN Xiaolin1,CHEN Lei1,WANG Yongming1,LI Lin1,LI Kuanxin1
(1 The First Affiliated Hospital of Shihezi University,Shihezi 832002,China;;2 The Ren Min Hospital of Shihezi City,Shihezi 83000,China)

To study the expression of urokinase-type plasminogen activator(uPA),its receptor(uPAR)and plasminogen activator inhibitor(PAI-1)in synovial tissues of rheumatoid arthritis with solitary joint.Immuneohistochemical analysis was used in synovial tissues from 13 patients with RA in solitary joint,19 patients with RA and 20 from normal synovial tissues.For 13 patients with RA in solitary joint,Positive expression of uPA,uPAR and PAI-1proteins were found in synovial lining cells,mononuclear cells and endothelial cells.The sites of positive expression of uPA,uPAR and PAI-1 proteins were similar to RA(P＜0.05).But its positive rate was significantly higher compare with the normal synovial tissues(P＜0.05).There were low expressions of uPA,uPAR and PAI-1 proteins in RA with solitary joint synovial tissues,which indicated that RA with solitary joint might occur at the early stages of RA.So the expressions of uPA,uPAR and PAI-1 in RA with solitary joint synovial tissues were at the stages of low expression.

arthritis;rheumatoid;urokinase;immunohistochemistry

R36 < class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

A

2010-03-20

孫建華(1972-),男,副主任醫(yī)師,從事骨科學(xué)研究。