旁路移植靜脈段血管壁再狹窄的形態(tài)學(xué)研究

李勝,王圣剛,戈小虎

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,石河子832002;2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院,烏魯木齊 830001)

旁路移植靜脈段血管壁再狹窄的形態(tài)學(xué)研究

李勝1,王圣剛1,戈小虎2

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,石河子832002;2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院,烏魯木齊 830001)

觀察自體靜脈旁路移植后移植靜脈段的血管壁的變化。新西蘭大白兔18只,取右側(cè)頸外靜脈旁路移植至同側(cè)頸總動脈為實驗組,僅游離左側(cè)頸外靜脈為假實驗組,正常左側(cè)頸外靜脈為正常對照組,術(shù)后6周取材光鏡下觀察、測量、比較各血管段內(nèi)膜、中膜變化差異,電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。游離的靜脈與正常靜脈相比無明顯變化(P

＞0.05);移植靜脈段內(nèi)膜明顯增厚(P＜0.01)。由此可知,自體靜脈旁路移植術(shù)后內(nèi)膜明顯增厚,并與移植損傷和局部血流動力學(xué)改變密切相關(guān)。

自體靜脈;旁路移植;再狹窄

自體靜脈旁路移植術(shù)是目前醫(yī)學(xué)界普遍采用的治療缺血性疾病、改善血液供應(yīng)的重要手段和基本方法,是血管外科最常見的術(shù)式之一。然而,由于移植損傷、靜脈與動脈的組織結(jié)構(gòu)、血流動力學(xué)差異,自體靜脈移植術(shù)后的通暢率仍不容樂觀。

現(xiàn)有研究表明,下肢靜脈旁路移植術(shù)后1年內(nèi)40%的移植靜脈發(fā)生狹窄或閉塞,冠脈搭橋術(shù)后1年內(nèi)移植靜脈的狹窄率高達(dá)75%以上[1]。移植血管病變的高發(fā)生率嚴(yán)重影響手術(shù)的遠(yuǎn)期療效,從而引發(fā)廣大學(xué)者對其的研究,既往的研究以“間置移植”模型為主,往往不能如實反映臨床以“旁路移植(搭橋)”為主的實際情況。

本實驗將通過建立兔自體靜脈旁路移植動物模型,來研究術(shù)后早中期移植靜脈段血管壁的變化,以及可能參與的發(fā)病因素。

1 材料與方法

1.1 動物來源與分組

動物來源:新西蘭大白兔18只(新疆實驗動物研究中心,實驗動物使用許可證號:SYXK(新)2003-0003),雄雌各9只,年齡 16～18周,體重 2.5±0.5 kg。

實驗分組:右側(cè)頸外靜脈旁路移植至同側(cè)頸總動脈為實驗組(共18只);僅游離左側(cè)頸外靜脈為假實驗組(9只);正常左側(cè)頸外靜脈為正常對照組(9只)。

1.2 模型建立

術(shù)前8h禁食水,稱重,以3%戊巴比妥鈉行耳緣靜脈注射麻醉(用量30 mg/kg,總量2/3靜推,1/3緩慢注射,以后根據(jù)兔角膜反射用戊巴比妥鈉腹腔注射維持麻醉狀態(tài)。

實驗組:顯露游離右側(cè)頸外靜脈,長約2.0～2.5 cm,徹底清除靜脈兩端外膜。沿肌間隙入氣管旁溝尋及右側(cè)頸總動脈及迷走神經(jīng)主干,游離頸總動脈,清除前壁外膜,長度約2.5 cm。斜行(角度約30°～45°)切斷頸外靜脈遠(yuǎn)端,以肝素鹽水20 mL從斷端緩慢注入頸外靜脈、頸總靜脈,使全血肝素化,靜脈夾斜行夾閉近端頸外靜脈。在頸總動脈近端吻合口附近兩端上動脈夾,用顯微剪刀縱行剪開近端吻合口(長度約為頸總動脈直徑的1.5倍,2.0～2.5 mm),將頸外靜脈遠(yuǎn)端用9-0無損傷線采用二點褥式固定連續(xù)縫合法吻合近端吻合口。同法剪斷頸外靜脈近端吻合至頸總動脈遠(yuǎn)端吻合口。于第二吻合口縫線打結(jié)前開放近心端動脈夾,放血排氣后打結(jié),并檢查吻合口有無漏血,漏血處補(bǔ)縫1～2針,滲血處按壓3 min即可,于二吻合口之間結(jié)扎頸總動脈。游離左側(cè)頸外靜脈為假實驗組;取正常左側(cè)頸外靜脈為正常對照組。

1.3 飼養(yǎng)與管理

術(shù)后7d,每天給予20 mL肝素鹽水腹腔注射防止早期血栓形成,常規(guī)飼料飼養(yǎng)。

1.4 標(biāo)本采集

術(shù)后6周獲取標(biāo)本。麻醉方法同上,切開頸部皮膚后,觀察移植靜脈充盈狀況,阻斷移植靜脈的兩端血流,自頸總動脈穿刺向移植靜脈管腔內(nèi)先后灌注肝素生理鹽水和4%多聚甲醛固定液對血管進(jìn)行原位固定(使其直徑維持在取標(biāo)本前水平),取下移植靜脈段置于預(yù)冷的2.5%戊二醛內(nèi),以備光、電鏡制樣。同時取左側(cè)頸外靜脈作為對照。

1.5 光鏡標(biāo)本制備

標(biāo)本用10%甲醛固定后,取近、中、遠(yuǎn)段移植靜脈各0.4 mm,分別石蠟包埋、切片(4μm),所有切片均行HE染色及彈力纖維染色。HE染色觀察血管壁三層結(jié)構(gòu)的變化。彈力纖維染色(EVG法,珠海貝索生物技術(shù)有限公司,許可證號20010407):彈力纖維染藍(lán)黑色,膠原纖維呈紅色,肌纖維、紅細(xì)胞呈黃色。

光鏡觀察形態(tài)學(xué)變化,采用“杰軟病理圖像分析系統(tǒng)”進(jìn)行圖像分析。測量內(nèi)膜、中膜厚度、內(nèi)彈力周徑(C)、新生內(nèi)膜面積(S),計算內(nèi)彈力膜圍繞面積(S=C2/4π)及管腔狹窄程度(新生內(nèi)膜面積/內(nèi)彈力膜圍繞面積×100%)。

1.6 透射電鏡標(biāo)本制備

標(biāo)本用2.5%戊二醛前固定,1%鋨酸后固定,梯度酒精脫水,Epon812包埋,超薄切片,鈾、鉛雙重染色,Hitachi-600電鏡觀察拍照。觀察血管3層結(jié)構(gòu)及內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

成功吻合新西蘭大白兔右側(cè)頸外靜脈-頸總動脈旁路移植18只,吻合成功后,移植靜脈段明顯擴(kuò)張,近端吻合口靠移植靜脈外側(cè)可見明顯渦流形成。術(shù)后6周取材:3只(1雌2雄)移植靜脈閉塞,余15只(雄7雌8)移植靜脈通暢,進(jìn)入結(jié)果分析。通暢移植靜脈周圍粘連明顯,游離時滲血明顯,移植靜脈段明顯膨脹,觸之血管壁明顯增厚,彈性差。而移植閉塞靜脈明顯變細(xì),鏡下可見吻合口血栓形成,閉塞靜脈管腔內(nèi)大量巨噬細(xì)胞聚集。

2.2 光鏡下血管壁的病理改變

彈力纖維染色結(jié)果(圖1、圖2)顯示:移植靜脈段內(nèi)膜明顯增厚,內(nèi)可見大量膠原纖維及少量彈力纖維。靜脈內(nèi)膜、中膜分界清晰,中膜、外膜分界不清。

移植靜脈段內(nèi)膜厚度及管腔狹窄程度比較結(jié)果(表1)表明:移植靜脈近、中、遠(yuǎn)3段內(nèi)膜均明顯增厚,與正常靜脈相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.815,P＜0.01),內(nèi)膜增厚以移植靜脈近段外側(cè)增厚最為顯著,三段新生內(nèi)膜面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.792,P＞0.05)。游離的左側(cè)靜脈與正常靜脈相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(T=0.717,P＞0.05)。

HE染色結(jié)果(圖3)顯示:血管3層結(jié)構(gòu)分界不清楚,高倍鏡下隱約可見內(nèi)彈力膜,結(jié)合彈力纖維染色分層定位,可見新生內(nèi)膜由大量的胞外基質(zhì)、血管平滑肌細(xì)胞構(gòu)成,偶可見巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。中層平滑肌細(xì)胞明顯增多,細(xì)胞排列紊亂。外膜可見豐富的微小血管形成。2例(1雌1雄)移植靜脈段有附壁血栓形成,但吻合口未見明顯血栓。

圖1 正常靜脈 (彈力纖維染色 ×10)Fig.1 Normal vein(EVG×10)

圖2 移植靜脈(彈力纖維染色 ×10)Fig.2 Grafted vein(EVG×10)

圖3 移植靜脈 (HE染色 ×40)Fig.3 Grafted vein(HE×40)

表1 移植靜脈段內(nèi)膜厚度及管腔狹窄程度比較 n=15Tab.1 Comparison of the intima thickness and the extent of stenosis in normal,dissociated and grafted vein n=15

2.3 透射電鏡下細(xì)胞改變

透射電鏡下細(xì)胞改變的照片見圖4。

圖4 移植靜脈 (電鏡 ×8000)Fig.4 Grafted vein(EM×8000)

由圖4可見:正常頸外靜脈內(nèi)膜由內(nèi)皮和薄層的內(nèi)皮下組織構(gòu)成,內(nèi)皮細(xì)胞呈細(xì)長的梭形,排列較緊密,未見微絨毛,細(xì)胞外基質(zhì)較少;中膜由2～3層平滑肌細(xì)胞構(gòu)成,呈收縮(靜止)型,長條形,細(xì)胞核細(xì)長,含有豐富的肌絲和致密體,不含粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。移植靜脈段內(nèi)皮細(xì)胞呈類圓形或多邊形凸向管腔,表面有少量細(xì)長的胞漿突起,細(xì)胞核大不規(guī)則,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)育,核蛋白體及線粒體較多,細(xì)胞外基質(zhì)豐富,內(nèi)膜中可見大量合成(分泌)型平滑肌細(xì)胞;平滑肌細(xì)胞以合成(分泌)型為主,胞體顯著增大,表面有不規(guī)則胞漿突起,胞漿內(nèi)肌絲和致密體明顯減少,充滿了大量平行排列的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),核糖體和線粒體等與分泌有關(guān)的細(xì)胞器,胞核內(nèi)染色質(zhì)聚集,核仁明顯增大,細(xì)胞間縱橫交錯的膠原纖維明顯增多。

3 討論

移植術(shù)后再狹窄的形成是一個多因素參與的極其復(fù)雜的病理生理過程[2],包括早期血栓形成、中期內(nèi)膜過度增生和晚期血管粥樣硬化3個獨立而又相互關(guān)聯(lián)的重要環(huán)節(jié)[3]。靜脈移植的失敗的主要病理生理學(xué)改變?yōu)榧毙匝軗p傷、靜脈移植到動脈環(huán)境后對變化的血流動力學(xué)所做出的適應(yīng)性反應(yīng),以及二者之間的相互作用[4]。移植損傷和術(shù)后血流動力學(xué)改變被認(rèn)為是導(dǎo)致血管重構(gòu)與再狹窄的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]。它們主要通過調(diào)節(jié)基因、細(xì)胞因子的表達(dá)以及炎癥反應(yīng),從而最終導(dǎo)致血管再狹窄的發(fā)生。

移植損傷包括機(jī)械損傷和缺血再灌注損傷,主要參與早期內(nèi)皮細(xì)胞的損害和血栓的形成。術(shù)中解剖、游離、結(jié)扎、暴牽拉等機(jī)械操作均可造成血管壁的直接損傷,而廣泛的游離和顯露致使血管壁營養(yǎng)血管以及血管周圍自主神經(jīng)嚴(yán)重?fù)p傷,從而中斷其神經(jīng)支配和營養(yǎng)來源,經(jīng)歷缺血損傷[6];術(shù)后隨著血流的恢復(fù)及營養(yǎng)血管的再生,血管壁組織細(xì)胞將再次遭受再灌注的打擊。血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)損傷后可引起多種黏附分子、炎癥因子和免疫介質(zhì)表達(dá)紊亂,增加血小板和VEC、白細(xì)胞間的黏附,并通過細(xì)胞或體液途徑激活補(bǔ)體和凝血、纖溶系統(tǒng),促進(jìn)血小板和凝血系統(tǒng)激活。同時,血管壁損傷減弱VEC合成和分泌抗血栓物質(zhì)的作用,從而誘發(fā)大規(guī)模的血小板聚集和血栓形成,導(dǎo)致移植術(shù)后發(fā)生血管閉塞[7]。研究表明,術(shù)后4周 VEC層才能完全修復(fù),而術(shù)后1周是VEC損傷最嚴(yán)重的時期,也是早期血栓形成高發(fā)時期[8]。本實驗中,盡管術(shù)后1周給予肝素鹽水20mL/d腹腔注射,仍有3例出現(xiàn)吻合口血栓形成最終致移植失敗,考慮主要由于移植損傷及吻合口狹窄所致,因此在仔細(xì)手術(shù)操作的同時應(yīng)加強(qiáng)術(shù)后抗凝治療。

VEC損傷是血管內(nèi)膜過度增生發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ),而持續(xù)復(fù)雜的血流動力學(xué)改變是導(dǎo)致血管最終狹窄的決定性因素。由于靜脈與動脈在組織結(jié)構(gòu)與血液動力學(xué)方面的差異,靜脈移植到動脈環(huán)境后立即出現(xiàn)局部擴(kuò)張、血流動力學(xué)改變,甚至局部低剪切力及渦流形成。在持續(xù)復(fù)雜的血流動力學(xué)作用下,VEC表達(dá)血小板衍生生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、一氧化氮合酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等大量平滑肌細(xì)胞(SMC)有絲分裂原,同時增加內(nèi)皮素-1和血管緊張素-Ⅱ的釋放,從而促進(jìn)SMC由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?并不斷增殖、活化、遷移,并釋放大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)[9],引起內(nèi)膜的顯著增厚。另外,在持續(xù)低剪切力的作用下,血液成分沿血管壁停留時間延長,從而上調(diào)凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體[10]。VEC代謝紊亂,也可激活生物合成酶,增加VEC過氧化陰離子含量,使被氧化修飾的脂質(zhì)在內(nèi)皮下大量聚集,增殖遷移到內(nèi)膜的SMC在吞噬脂質(zhì)后形成平滑肌源性泡沫細(xì)胞。另外,在動脈高壓力環(huán)境下,移植靜脈內(nèi)膜完整性的破壞導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng),單核細(xì)胞大量黏附于VEC并轉(zhuǎn)入內(nèi)皮下,吞噬被氧化修飾的脂質(zhì)形成單核細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞。并進(jìn)一步增多、融合,最終形成粥樣斑塊[11]。本實驗中,術(shù)后6周可見移植靜脈段內(nèi)膜明顯增厚,內(nèi)膜下可見大量增生的ECM、血管SMC,偶可見巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,電鏡下可見大量合成型SMC,實驗結(jié)果與既往研究相一致。另外,本實驗中發(fā)現(xiàn)血管各部位內(nèi)膜增厚程度并不完全一致,與局部血流緩慢、渦流形成密切相關(guān)。移植靜脈近端吻合口外側(cè)為低剪切力、渦流形成區(qū)域,此處內(nèi)膜增厚最為明顯[12]。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示自體靜脈旁路移植術(shù)后移植靜脈段內(nèi)膜明顯增厚,并與移植損傷和局部血流動力學(xué)改變密切相關(guān)。

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Restenosis after Autos Vein-To-Artery Grafted Bypass

LI Sheng1,WANG Shenggang1,GE Xiaohu2
(1 Medical College,Shihezi University,Shihezi 832002,China;2 People’s Hospital of Xinjiang,Urumqi 830001,China)

To observe the restenosis after the vein-to-artery grafted bypass.18 New Zealand Rabbits were endured the experiment.To transplant the right external-jugular-vein to the right arteria-carotis-communis bypass as the experiment group;To dissociate the left external-jugular-vein as the provided experiment group;And to choose the normal wein as the compared group.6 weeks after the operation,kill the rabbits and get the specimen.To observe,measure and compare the different change of the vessels by light microscope,and observe the Morphologic change of the VECs and the SMCs by electron microscope.The change of the dissociated vessels are similar to the normal veins(P＞0.05);The endomembranes of the grafted veins are much more thicker than the normal veins’(P ＜ 0.01).After the vein-to-artery transplanting operation bypass,the grafted veins’intima are thickened remarkably,And the location of he thickened intima are extremely related with the changed hemodynamics.

autos vein-to-artery grafted;bypass;restenosis

R654.4 < class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

A

2010-03-20

李勝(1982-),男,碩士生,專業(yè)方向為血管外科學(xué)。

戈小虎(1962-),男,教授,從事血管外科學(xué)研究;e-mail:gexiaohu136@163.com。