DLL1-ICD基因真核表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染鑒定

郭政,崔麗娟,黃瑾

(石河子大學醫(yī)學院生化教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室,石河子832002)

DLL1-ICD基因真核表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染鑒定

郭政,崔麗娟,黃瑾

(石河子大學醫(yī)學院生化教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室,石河子832002)

通過克隆DLL1-ICD(Delta-like1細胞內(nèi)區(qū)域)的cDNA及測序鑒定,構(gòu)建pEGFP-C1-DLL-ICD真核表達載體并進行細胞轉(zhuǎn)染,為研究Notch信號通路與Neuritin的關系奠定基礎。首先根據(jù)小鼠全長DLL1 cDNA序列,設計DLL-ICD PCR引物,以小鼠胎腦cDNA文庫為模板,利用PCR技術(shù)擴增DLL1-ICD cDNA。將擴增出的基因片段克隆至pEGFP-C1載體,進行DNA序列測定。并進一步將測序正確的pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表達載體轉(zhuǎn)染HEK293細胞。結(jié)果顯示:成功克隆了DLL1-ICD的cDNA片段,測序結(jié)果與基因文庫中的DLL1-ICD序列一致,并在轉(zhuǎn)染真核細胞后獲得了較好地表達。表明pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表達載體構(gòu)建成功,并在293細胞中成功表達了DLL1-ICD-EGFP融合蛋白。研究結(jié)果為進一步探討Notch信號通路與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的分子機制奠定基礎。

DLL1-ICD;真核表達載體;轉(zhuǎn)染Notch信號通路

Notch最初是在果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn),該基因的部分功能缺失會在果蠅翅膀的邊緣造成一些缺刻[1]。后續(xù)的研究表明,Notch基因位點突變導致果蠅在胚胎期死亡,在死亡的胚胎中,神經(jīng)組織完全取代了上皮組織從而使神經(jīng)組織異常豐富;雌性的雜合子果蠅翅膀發(fā)生多種缺刻,次剛毛發(fā)育異常。1983年,果蠅的Notch基因被克隆[2-3]。

Notch信號途徑是一種連接并調(diào)節(jié)細胞之間的通訊方式,通過側(cè)抑制和信號誘導實現(xiàn)對相鄰細胞命運的控制,參與了細胞的增殖,分化和凋亡等重要過程,被認為在多細胞生物細胞發(fā)育的細胞分化中起中心作用[4-5]。已有研究表明Notch途徑某些分子的基因突變或功能缺失與腫瘤,遺傳性疾病,阿爾茨海默癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關[6-9]。

迄今為止,多細胞生物有機體的研究表明,Notch信號途徑都包括配體-受體-轉(zhuǎn)錄因子三聯(lián)體,一般認為這就是Notch信號通路的核心組件[10]。Notch是一個進化過程中高度保守的跨膜受體蛋白家族,在脊椎和無脊椎動物中均存在且廣泛分布和表達在多種組織。Deltal(又稱delta-like 1,DLL1)是脊椎動物Notch的兩個配體之一,Delta1(又稱delta-like 1或DLL1)是脊椎動物Notch的兩個配體之一,它與Notch受體結(jié)合激活 Notch信號通路,決定細胞分化的命運,參與調(diào)控許多組織的生長發(fā)育。DLL1為單次跨膜糖蛋白,屬于DSL(Delta,Serrate,Lag-2)蛋白家族,小鼠Delta1基因全長2.86 kb,ORF編碼722個氨基酸,包括一個545個氨基酸的胞外區(qū),27個氨基酸的跨膜區(qū)和一個150個氨基酸的細胞質(zhì)區(qū)。人類DLL1基因定位于染色體6q27,全長3.04 kb中,ORF編碼723個氨基酸,與小鼠Delta-1蛋白有88%同源性。DLL1的細胞內(nèi)區(qū)域與 E3泛素連接酶特異結(jié)合,是DLL1泛素化和內(nèi)吞,激活Notch信號通路所必須的結(jié)構(gòu)域[11]。

本實驗擴增了DLL1細胞內(nèi)區(qū)域(Delta-like1 inter cell domain,DLL1-ICD)的 cDNA并測序,構(gòu)建了真核表達載體pEGFP-C1-DLL1-ICD,為進一步探討Notch信號通路與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生機制提供了重要的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

PCR儀(Bio-RAD);凝膠圖像分析儀(Bio-RAD);高速離心機(Kendro Laboratory Products Germany);超高速離心機(Beckman Coulter,Inc.);搖床(DHZ-032 SHA KER)。

1.2 主要試劑

DNA純化回收試劑盒和質(zhì)粒DNA小量純化抽提試劑盒(BioDev);質(zhì)粒pEGFP-C1(Clontech);受體菌 DH5α由本室保存;DNA電泳槽(Bio-RAD);HEK293細胞由本實驗室保存;Lipofectamine 2000(Invitrogen)。

1.3 方法

1.3.1 引物

根據(jù)小鼠cDNA文庫中DLL1全基因序列,設計擴增DLL1-ICD的引物,引物由上海生工合成。5′端引物 :5′-CG gaattc T ATGTGCGTCCGGCTGAAGCT-3′Tm=64加 EcoRI酶切位點。3′端引物 :5′-CG ggatcc CACCTCAGTCGCTATAACACA-3′Tm=62加BamHI酶切位點。

1.3.2 PCR擴增

反應物為:Primer1,Primer2,10×PCR buffer,25mmol/L dNTP,template,Pfu DNA polymersase,MiliQH2O,總反應體系50μL。PCR條件:94℃5 min預變性,94℃30 s,62℃30 s,72℃45 s,35個循環(huán);72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,切膠回收目的DNA片段。

1.3.3 pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表達載體的克隆

EcoRI/BamHI雙酶切pEGFP-C1載體和目的基因片段,載體割膠回收和基因片段 PCR純化,將目的片段連接進pEGFP-C1載體,轉(zhuǎn)化DH5α菌,菌落PCR初步鑒定陽性克隆后測序驗證。

1.3.4 pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表達載體轉(zhuǎn)染HEK293細胞

在96孔板中以1×104/孔接種細胞,24 h后用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-DLL1-ICD,6 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)36 h,在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 DLL1-ICD cDNA的克隆與pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表達載體的構(gòu)建

DLL1-ICD cDNA基因編碼序列為465bp。采用PCR以小鼠cDNA文庫為模板克隆出DLL1-ICD cDNA。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離,在500 bp稍下方可見一條特異性條帶(圖1)。

圖1 DLL1-ICD cDNA的PCR擴增結(jié)果Fig.1 DLL1-ICD cDNA amplitied by PCR

與預測目的基因片段大小相近。泳道1為DNA分子量標準,泳道2～7為 PCR產(chǎn)物。該465 bp條帶被純化出,并被克隆至載體pEGFP-C1(圖2)。共選抗生素重劃篩選的 16個陽性菌落用DLL1-ICD特異性引物煮菌 PCR鑒定,結(jié)果(圖3)表明16個菌落均為陽性。選7號菌落抽提質(zhì)粒,用pEGFP-C1通用測序引物正向,反向測定了DLL1-ICD cDNA 的 5′和 3′端 ,經(jīng) BLAST 分析 ,與已知的DLL1-ICD基因序列一致,結(jié)果(圖4)表明所克隆的DLL1-ICD cDNA是正確的。

圖2 pEGFP-C1質(zhì)粒圖譜Fig.2 The map of pEGFP-C1Plasmid frolile

圖4 Dll1-ICD cDNA序列測定Fig.4 Dll1-ICD cDNA sequence analysis

2.2 pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表達載體轉(zhuǎn)染HEK293細胞

將pEGFP-C1-DLL1-ICD瞬時轉(zhuǎn)染至 HEK293細胞,培養(yǎng)36 h,在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果,圖片顯示293細胞整個胞漿呈現(xiàn)綠色熒光(圖5),表明pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表達載體在 HEK293細胞中成功表達了DLL1-ICD-EGFP融合蛋白。

圖5 DLL1-ICD-EGFP融合蛋白在HEK293中的表達Fig.5 DLL1-ICD-EGFP fusion protein expressed in HEK293

3 討論

Notch信號通路在生物發(fā)育的整個階段對細胞的分化、遷移和增殖起著至關重要的作用。Notch蛋白家族成員是進化過程中非常保守的跨膜受體,它與配體DLL1結(jié)合通過細胞間的相互作用調(diào)控多種組織細胞的命運[12-13]。

DLL1蛋白是脊椎動物Notch家族的配體之一,從生物學結(jié)構(gòu)上看,是單次跨膜糖蛋白,包括細胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細胞內(nèi)區(qū)。當細胞表面的DLL1配體結(jié)合Notch后,使Notch發(fā)生兩次蛋白裂解,第一次裂解使內(nèi)外區(qū)斷裂分開,第二次裂解釋放Notch胞內(nèi)區(qū)(NICD),使其從細胞膜上脫離。

NICD是Notch的活性形式,它被轉(zhuǎn)運進入細胞核并與CSL結(jié)合,而后形成NICD-CSL復合物,該復合物可激活Notch誘導基因(Notch-inducible genes)的轉(zhuǎn)錄。直接誘導轉(zhuǎn)錄的靶基因是 E(spl)(Enhancer of Split),E(spl)是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,bHL H)類轉(zhuǎn)錄因子,它又激活了轉(zhuǎn)錄抑制因子 HES1和 HES2,下調(diào)了proneural基因的表達,從而抑制了神經(jīng)元祖細胞的分化。而 HES1的失活就會導致proneural基因的表達上調(diào),加速神經(jīng)元祖細胞的分化[14-15]。同時,有研究表明DLL1可以激活Notch信號通路,促進祖細胞向樹突狀細胞分化[16-17]。敲除DLL1基因的小鼠在胚胎發(fā)育過程中死亡,表現(xiàn)為體節(jié)與神經(jīng)發(fā)育缺陷[18-19]。因此,可以預見DLL1基因在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究通過DLL1-ICD的克隆和基因序列分析,構(gòu)建了pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表達載體,并進行了轉(zhuǎn)染鑒定,研究結(jié)果為深入研究其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用奠定了基礎。

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Construction of Mammalian Expression Vector of DLL1-ICD and Transfection

GUO Zheng,CUI Lijuan,HUANGJin
(Department of Biochemistry,Shihezi University School of Medicine/Laboratory of Endemic and Ethnic Diseases,Shihezi 832002,China)

To construct and identify mammalian expression vector of DLL-ICD(Delta-like1 inter cell domain)using cloning and transfection technique,the pair of primers were decigned based on musculus cDNA sequence,and the DLL1-ICD was amplified by PCR.And then the PCR product was cloned into the vector pEGFP-C1 which was analyzed by sequence.Finally,mammalian expression vector of pEGFP-C1-Dll1-ICD was transfected into 293 cells.Musculus Dll1-ICD cDNA was cloned and analyzed,and the sequence of gene from pEGFP-C1-Dll1-ICD is identical With DII1-ICD in Genbank.After transfected,Dll1-ICD-EGFP fusino protein was expressed in 293 cells.The results set up the foundation to investigate the mechanism of Notch signaling in nervous system disease.

DLL1-ICD;Mammalian expression vector;Transfection,Notch Signaling pathway

R735.8 < class="emphasis_bold">文獻標識碼:A

A

2010-03-10

國家自然科學基金項目 (30760063)

郭政(1981-),男,碩士生,專業(yè)方向為神經(jīng)營養(yǎng)因子與神經(jīng)再生。

黃瑾(1963-),女,教授,從事神經(jīng)營養(yǎng)因子與神經(jīng)再生的研究;e-mail:huangjin623@163.com。