新疆早熟棉品種SSR分子標記體系的建立

薛艷,李保成,張新宇,沙紅,孫杰

(1石河子大學農學院/新疆兵團綠洲生態(tài)農業(yè)重點實驗室,石河子832003;2新疆農墾科學院,石河子,832003;3新疆農業(yè)科學院經濟作物研究所,烏魯木齊830052)

新疆早熟棉品種SSR分子標記體系的建立

薛艷1,李保成2,張新宇1,沙紅3,孫杰1

(1石河子大學農學院/新疆兵團綠洲生態(tài)農業(yè)重點實驗室,石河子832003;2新疆農墾科學院,石河子,832003;3新疆農業(yè)科學院經濟作物研究所,烏魯木齊830052)

為探索適宜新疆早熟棉的SSR-PCR反應體系,采用L9(34)正交實驗設計,研究了SSR-PCR反應體系的主要成分對擴增結果的影響。結果表明,棉花SSR-PCR最適反應體系為:在10μL的反應體系中,Taq DNA聚合酶用量為0.1 U、dNTP濃度0.2 mmol/L、引物濃度0.4μmol/L、Mg2+濃度2.5 mmol/L和模板DNA 20 ng;在此基礎上,從2300對SSR引物中篩選出多態(tài)性高的引物52條,分別構建了新疆已經審定的42個早熟棉品種的DNA指紋圖譜。該研究為早熟棉品種鑒定、遺傳多樣性分析,分子標記輔助育種和種子質量綜合評價等奠定了基礎。

陸地棉;早熟;SSR;體系優(yōu)化

隨著基因概念的發(fā)展,遺傳標記研究也逐步深入,已從傳統(tǒng)的以等位基因的表型識別為基礎的形態(tài)標記、細胞學標記、同工酶標記等,拓展到如SSR(simple sequence repeat)一類的以DNA多態(tài)性為基礎的分子標記。SSR即簡單序列重復,又稱微衛(wèi)星(microsatellite),是以1～6個堿基為基本單元的串聯重復序列,在植物基因組中廣泛分布。SSR標記具有遺傳上的共顯性和技術上的簡單性等特點[1],被廣泛應用于棉花、水稻、小麥等多種農作物[2-5]及其他植物的遺傳多樣性分析、分子作圖、基因定位和系譜分析等領域。目前,SSR分子標記已應用于棉花品種真實性和純度鑒定[6]、遺傳多樣性分析[2]、雜種優(yōu)勢預測、標記輔助選擇、指紋圖譜構建[7]等方面,已顯示出了良好的應用前景。SSR標記雖有諸多優(yōu)點,但其應用于不同作物及作物的不同類型時會出現較大的差異,如易產生非特異性擴增、干擾因素多、反應體系中成分復雜等。因此,有必要對早熟棉SSR反應體系中各成分的濃度、用量等各因素進行優(yōu)化試驗。

本研究利用正交設計分析法,對新疆早熟棉SSR PCR反應體系進行優(yōu)化,建立適宜新疆早熟棉遺傳分析的高效穩(wěn)定的SSR技術體系,并在此基礎上,篩選多態(tài)性高的SSR引物序列,以期為新疆早熟棉遺傳多樣性分析、圖譜的構建、品種鑒別及QTL定位的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

自1978-2009年新疆審定并推廣的早熟棉新陸早1號至新陸早42號共42個品種,其中新陸早1號～新陸早32號由新疆農業(yè)科學院李雪源課題組提供,新陸早33號～42號由新疆農墾科學院棉花所李保成研究員提供。

1.1.2 SSR引物及試劑

TML、TMK、BNL(brookhaven national laboratory)SSR引物來自CottonDB(http://algodon.tamu.edu)公布的序列,J ESPR(Jenkins,El-Zik,Saha,Pepper and Reddy)SSR引物來自Reddy等[8]發(fā)表的序列。引物由上海博亞公司合成,共2300對。

丙烯酰胺、PVP40、TEMED購自上海生物工程公司,Taq DNA聚合酶和4×dN TPs購自華美生物工程公司,其它試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 棉花基因組DNA的提取

棉花種子硫酸脫絨后播種于滅菌的蛭石中,28℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周后取葉片,采用CTAB法[9]提取棉花基因組總DNA。DNA樣品經濃度和純度測定后,用 TE緩沖液稀釋至26 ng/μL,置入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR擴增反應條件的優(yōu)化

1.2.2.1 單因素試驗

對SSR擴增反應的各影響因素均設置多水平梯度[10]。設計 Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶、模板DNA濃度5個因素各8個水平(表1)。為了避免因品種不同而影響PCR擴增效果,分別選用了新陸早1號、新陸早8號、新陸早12號、新陸早13號、新陸早26號、新陸早33號6個親緣關系較遠的品種進行體系的優(yōu)化。

肝臟核磁共振檢查作為臨床常用檢查手段之一，其清晰反映患者病灶位置詳情及疾病性質，為臨床治療方案提供可靠的數據資料。不過檢查過程中，指導患者調節(jié)呼吸頻率、服用造影劑，緩解心理壓力，給予患者優(yōu)質的臨床護理措施是關鍵[1]。為此，本院為進一步提高肝臟核磁共振檢查圖像質量及工作順利性，以收治的60例肝臟核磁共振檢查患者作為分析對象，給予臨床護理路徑，詳細匯報結果如下。

表1 棉花SSR反應體系條件優(yōu)化試驗設計Tab.1 Test design of condition optimization in cotton SSR reaction system

1.2.2.2 正交設計

選用L9(34)[11]正交設計表,4個因素為Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物,共9個反應體系。試驗設計見表2。為了避免因品種不同而影響 PCR擴增效果,分別選用了新陸早8號、新陸早12號、新陸早13號、新陸早26號、新陸早33號5個親緣關系較遠的品種進行體系的優(yōu)化。

表2 棉花SSR反應體系正交設計Tab.2 Orthogonal design of cotton SSR reaction system

1.2.3 PCR擴增程序及產物的檢測

PCR反應程序為:95℃預變性2 min;94℃變性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸1 min,30個循環(huán);72℃延伸7 min[12]。取擴增產物2μL,9%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(0.5×TBE)電泳分離,200 V恒壓1.5 h,銀染(10%硝酸銀)檢測[13]。

2 結果與分析

2.1 單一因素對SSR-PCR檢測結果的影響

如圖1a所示,當 Mg2+濃度為0.5、1.0 mmol/L時,擴增條帶不清晰,Mg2+濃度為1.5、2.0、2.5 mmol/L時,有較好的擴增條帶;當Mg2+濃度大于3.0 mmol/L時,擴增效果逐漸變差。在10μL反應體系中,Taq酶濃度為0.025～0.05 U時,條帶較弱,Taq酶增加至0.075 U、0.1 U和0.125 U時,條帶亮度增加,較清晰。當 Taq酶增加至0.15 U以上時,出現明顯的非特異性擴增條帶(圖1b);模板DNA濃度為20～80 ng時均有清晰的電泳條帶出現,但結果稍有不同(圖1c)。對dN TPs進行的8個濃度梯度試驗中(圖1d),濃度為0.025～0.150 mmol/L時均可以擴增出清晰的條帶,差異不顯著,在濃度為0.200～0.300 mmol/L時,擴增產物增加,出現非特異性擴增。在供試8個引物濃度中,當引物濃度為0.4～0.8μmol時,條帶清晰,差異不明顯;引物濃度為1.0和1.2時,各品種間差異明顯,有些品種條帶清楚,有些品種模糊不清(圖1e)。

圖1 各影響因素的SSR擴增結果Fig.1 The amplified results of factors

2.2 正交設計SSR-PCR檢測結果

圖2 正交設計SSR-PCR反應體系擴增結果Fig.2 The amplified results of treatments in orthogonal experimental design

2.3 體系穩(wěn)定性鑒定及DNA指紋圖譜的構建

為了驗證體系對不同擴增材料的適應性,利用優(yōu)化后的SSR-PCR反應體系對42個早熟棉花品種進行PCR擴增,檢測結果見圖3;同時,為驗證體系對不同引物的適用性,隨機挑選45對SSR引物,用新陸早38號的基因組DNA為模板進行擴增,結果見圖4。

從圖3、圖4均可看出:擴增條帶清晰,特異性好,反應體系具有較好的穩(wěn)定性和可重復性。這表明優(yōu)化后的體系不僅適用于不同的SSR引物,也適用于不同的棉花品種,且穩(wěn)定可靠。利用這個體系,從2300對引物中篩選出52對多態(tài)性高的SSR引物,并利用這些引物分別構建了42個早熟棉品種的DNA指紋圖譜。

圖3 引物JESPR153對42個棉花品種的擴增結果Fig.3 The PCR amplified results using primer JESPR153 on forty-two varieties of cotton

圖4 不同引物在早熟棉花品種新陸早41號上的DNA指紋圖譜Fig.4 The fingerprinting of cotton varieties(Xinluzao41)by SSR with different primers

3 討論與結論

PCR反應是SSR檢測過程中一個重要環(huán)節(jié),篩選SSR引物和建立穩(wěn)定的反應體系是SSR多態(tài)性應用的基礎[11]。由于SSR反應體系所含組分較多,各組分均可能對擴增的敏感性、特異性和產量產生影響。因此,實行多因素聯合優(yōu)化的正交試驗設計,借助合適的正交表,利用正交表的均衡分散性和整齊可比性,可有效解決理論上需要進行的試驗次數與實際可行的試驗次數的矛盾,以及實際所做的有限量試驗與要求全面掌握事物內在規(guī)律間的矛盾[19]。

本試驗中單因素分析結果顯示,SSR擴增對模板DNA濃度的要求不高,從擴增圖譜(圖1c)來看,模板濃度在10～80 ng時無較大差異,這與前人研究結果一致[2]。因此在設計正交實驗時,我們只設計了個4因素。通過正交實驗,可了解到PCR擴增反應不僅受單個因素的影響,而且還與它們之間的配合力有關。Mg2+、引物、dNTPs、Taq DNA 酶和DNA模板做為PCR擴增的原料,有相對適宜的用量范圍。但在正交實驗中,單因素中表現較好的濃度進行組合,不一定會達到理想效果(圖2)。

目前,關于棉花SSR反應體系的優(yōu)化已有很多的報道,已證明利用正交設計優(yōu)化棉花SSR反應體系是一種有效、適用而且簡便的方法,能較好地識別SSR反應體系中的關鍵影響因素,并優(yōu)化反應條件。本研究主要是針對多個品種的反應體系的優(yōu)化,應用面比較廣。由于品種多,在單因素設計時,各因素的水平設計范圍大,均達到8個水平。為了使該體系在42個早熟棉品種中都能擴增出較好的效果,整個體系優(yōu)化過程中均應用了6個品種,并且這6個品種在早熟棉品種中的遺傳基礎相對較遠。

本研究最終構建的適宜早熟棉遺傳分析的SSR技術體系:10μL的體積中,模板DNA 20 ng,Mg2+濃度2.5 mmol/L,上下游引物各0.4μmol/L,dNTPs 0.20 mmol/L,Taq DNA酶0.1 U。利用這個體系,篩選多態(tài)性高的SSR引物序列,分別構建了42個早熟棉品種的DNA指紋圖譜,還分別構建了每個早熟棉品種的DNA指紋圖譜。這些結果為新疆早熟棉遺傳多樣性分析、圖譜的構建、品種鑒別及Q TL定位研究奠定了基礎。

[1]Bassam B J,Caetano Anoles G,Gresshoff P M.Fast and sentitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels[J].Anal Biochem,1991,196(1):80-83.

[2]Guang Chen,Xiongming D U.G enetic diversityof source germplasm of upland cotton in China as determined by SSR marker analysis[J].Acta G enetica Sinica,2006,33(8):733-745.

[3]劉之熙,陳祖武,朱克永,等.利用 SSR分子標記快速鑒定雜交水稻種子純度技術體系的優(yōu)化[J].雜交水稻,2008,23(1):60-63.

[4]Haiyan Wang,Xiu’e Wang,Peidu Chen,et al.Assessment of genetic diversity of Yunnan,Tibetan,and Xinjiang wheat using SSR marker[J].Journal of Genetics and Genomics,2007,34(7):623-63.

[5]王士磊,李玉鵬,高樹仁.正交設計優(yōu)化玉米 SSR-PCR反應體系的研究[J].基因組學與應用生物學,2009,28(1):119-122.

[6]武耀廷,張?zhí)煺?郭旺珍,等.陸地棉品種 SSR標記的多態(tài)性及用于雜交種純度檢測的研究[J].棉花學報,2001,13(3):131-133.

[7]殷劍美,陳旭升,狄佳春,等.雜交棉蘇雜118的 SSR指紋圖譜構建[J].江蘇農業(yè)科學,2007(4):29-31.

[8]Reddy O U K,Pepper A E,Abdurakhmonov I,et al.New dinucleotide and trinucleotide microsatellite markers resources for cotton genome research[J].Cotton Sci,2001,5:103-113.

[9]葉磊,王茜.一種適于SSR-PCR的棉花基因組DNA提取法[J].分子植物育種,2007,5(5):738-742.

[10]王偉,楊文鵬,關琦,等.玉米 SSR分子標記技術操作規(guī)程的優(yōu)化[J].安徽農業(yè)科學,2008,36(11):4259-4264,4293.

[11]陳浩東,李育強,洪亞輝.棉花SSR-PCR反應體系的優(yōu)化[J].分子植物育種,2007,5(增刊):182-186.

[12]田海燕,田新惠,李艷軍,等.棉花DNA的提取及其SSR分子標記體系的建立[J].石河子大學學報:自然科學版,2007,25(2):150-152.

[13]Zhang J,Wu Y T,Guo W Z.Fast screening of microsatellite markers in cotton with PAGE/silver staining[J].Coton Sci,2000,12:267-269.

Optimization of Amplification Reaction System and Construction of DNA Fingerprinting of Local Upland Cotton Cultivars in Xinjiang

XUE Yan1,LI Baocheng2,ZHANG Xinyu1,SHA Hong3,SUN Jie1
(1 College of Agriculture/The Key Laboratory of Oasis Eco-Agriculture of Xinjiang Production and Construction Group,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 Xinjiang Academy of Farmland Reclamation,Shihezi 832003,China;3 Institute of Industrial Crops,Xinjiang Academy of Agricultural Science,Urumqi 83000,China)

In this study,SSR-PCR reaction conditions of short-season upland cotton in Xinjiang were optimized.The factors that affect SSR results of upland cotton were studied by L9(34)orthogonal design.The results showed that 0.1U Taq Polymerase,0.2 mmol/L dNTP,0.4μmol/L primer,2.5 mmol/L Mg2+and 20 ng template DNA in 10μL SSR reaction system might be the best combination.52 pairs of SSR primers were screened out from 2300 pairs.The DNA fingerprint for 42 local cultivars of upland cotton in Xinjiang was successfully constructed by SSR-PCR amplification.This study lays a firm foundation for cultivars identification,genetic diversity evaluation and marker-assisted selection breeding and seed quality assessment of short-season upland cotton cultivars in Xinjiang.

upland cotton;earliness;SSR;system optimization

S562;Q78 < class="emphasis_bold">文獻標識碼:A

A

2010-01-22

國家科技支撐計劃項目(2007BAD44B07)

薛艷(1983-),女,碩士生,專業(yè)方向為棉花遺傳育種;e-mail:xueyan_8@sina.com。

孫杰(1969-),男,教授,從事棉花遺傳育種研究;e-mail:sunjiezh@yahoo.com.cn。