喜樹堿含量的測定方法研究

方旭東，陳紹宇

（1.天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300402；2.廣西欽州市水利電力勘測設(shè)計院，廣西欽州535000）

喜樹堿含量的測定方法研究

方旭東1，陳紹宇2

（1.天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300402；2.廣西欽州市水利電力勘測設(shè)計院，廣西欽州535000）

本文介紹了喜樹堿含量的分析測定方法。樣品采用了乙醇超聲提取法從喜樹葉中提取喜樹堿，并用薄層層析法和高效液相色譜法分析測定喜樹堿的含量。薄層層析法測定喜樹堿的含量使用硅膠G做固定相，v（氯仿）:v（丙酮）=70∶30、v（甲醇）∶v（氯仿）=10∶90做展開劑。高效液相色譜法用v（甲醇）∶v（水）=55∶45做流動相，并且流動相流速為1.0mL/min。在波長為254 nm，溫度為25℃下檢測。每次進(jìn)樣量為5μL。

喜樹堿；高效液相色譜；薄層層析；分析測定方法

目前，農(nóng)藥殘留、害蟲抗藥性以及作物藥害等農(nóng)藥產(chǎn)生的副作用，是我們需解決的問題之一。生物農(nóng)藥采用天然產(chǎn)物，對人類、環(huán)境和作物是低毒、無毒且殘留時間較短的。喜樹堿是一種具有生物活性可廣泛應(yīng)用于生物農(nóng)藥的物質(zhì)，本文利用薄層層析（TLC）法和高效液相色譜（HPLC）法對喜樹葉中提取的喜樹堿含量進(jìn)行了分析與測定。該法簡便、快捷、準(zhǔn)確性高，為將來該領(lǐng)域研究提供了可靠的依據(jù)。

1 實驗儀器、試劑與材料

1.1 實驗儀器

高效液相儀、紫外光檢測器、色譜工作站、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、高速離心機(jī)、電子天平。

1.2 實驗試劑

甲醇，95%乙醇，無水乙醇，丙酮，氯仿，硅膠G（薄板層析用）。

1.3 植物材料

喜樹葉于2010年8月采自欽州市水利局喜樹園栽培3年生的喜樹幼苗，采集喜樹嫩葉（頂芽，頂芽以下1～2片葉）。

用天平稱取采得的喜樹葉約1000 g，并用自來水將其洗凈后置于恒溫干燥箱內(nèi)，調(diào)整恒溫干燥箱溫度至40℃烘干24 h,直到材料發(fā)脆，再用60目的DWF-TOOA型粉碎機(jī)粉碎，將粉碎好的喜樹葉裝入密封袋后將其置于4℃冰箱中避光保存，待用。

用電子天平精確稱取已經(jīng)烘干及粉碎過的干燥喜樹葉（60目）1.000 g置于25mL容量瓶中，向25mL容量瓶中加入95%乙醇16mL進(jìn)行超聲提取4min后，將其取出并冷卻至室溫，再用LG10—2.4A高速離心機(jī)進(jìn)行離心處理，最后用乙醇定容，待用[1]。

2 喜樹堿含量分析測定方法

2.1 TLC法[2～4]

2.1.1薄層板的制備

用電子天平精確稱取6.3 g硅膠G（在硅膠中加入12%～14%作為粘合劑的石膏）將硅膠G與1%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）調(diào)和成勻漿。用手動將已調(diào)制好的固定相均勻地涂鋪在20 cm×5 cm玻璃板上。將鋪好的薄板水平放置，室溫下晾干，然后將其放入干燥器中，在110℃下活化0.5 h后在干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2點樣

用0.25mm點樣毛細(xì)管吸取用乙醇超聲法提取的提取液，輕輕垂直接觸于點樣線上（點樣線即距離薄層板底邊1～2 cm處），反復(fù)點樣15次，每次點樣必須在上一次點樣干燥后再點。要求點樣直徑不超過2～3mm。

2.1.3展開

層析前將展開劑[展開劑用v（氯仿）∶v（丙酮）=70∶30、v（甲醇）∶v（氯仿）=10∶90]倒入層析缸中，讓展開劑揮發(fā)使層析缸中氣體達(dá)到飽和狀態(tài)，將制好的薄層板并點有樣品的一端浸在展開劑中，選用直立上行法展開，層析，完畢后取出薄層板并用鉛筆標(biāo)明溶劑前沿。

2.1.4定位

由于喜樹堿對多種生物檢測試劑均呈負(fù)反應(yīng)，但在紫外光下有明顯的藍(lán)色熒光，因此，本試驗將薄層板放入暗室中用紫外光來照射，使薄層板上的斑點顯現(xiàn)出來從而檢測樣品中是否有喜樹堿存在。

2.1.5定性

TLC法定性主要依據(jù)的是組分斑點的比移值Rf=該組分斑點到原點的距離/溶劑前沿至原點的距離。

2.1.6定量

將薄層板上的樣斑取下，溶解，再用分光光度法測定。

2.2 HPLC法[5～7]

Waters600高效液相儀，Waters600泵，Waters 486型紫外光檢測器；echsphereODS柱（25cm×4.6 mmID，5μm)，流動相為v（甲醇）∶v（水）=55∶45，流速1.0mL·min-1，檢測波長254nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量5μL；按照面積外標(biāo)法計算。

3 結(jié)果與分析

3.1 薄層層析法分析

根據(jù)溶劑前沿和喜樹堿斑點移動的距離，可以算出喜樹堿在氯仿/丙酮展開劑中的比移值Rf（溶質(zhì)移動距離與流動相移動距離之比）約為0.6；在甲醇/氯仿展開劑中的比移值Rf約為0.80。

3.2 高效液相色譜法分析條件[8～12]

3.2.1檢測波長的確定

喜樹堿在254nm處有最強(qiáng)吸收，大量研究也以254nm作為喜樹堿的檢測波長，因此，本試驗采用254nm作為紫外檢測器的檢測波長。

3.2.2流動相的選擇

乙腈/水、甲醇/水是高效液相色譜常用的流動相，但考慮到乙腈的毒性較大、成本高，且喜樹堿溶于甲醇，所以選擇甲醇/水作為流動相。因此，本試驗選用流動相，v（甲醇）∶v（水）=55∶45，流速1.0mL·min-1，檢測波長254nm，柱溫25℃。在此條件下，喜樹堿的保留時間適中，峰形良好，出峰時間7.5min左右。

3.2.3喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用電子天平精確稱取喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品5.2mg于100mL容量瓶，以100%乙醇為溶劑，超聲溶解并定容至刻度，作為對照品溶液。精確吸取對照品溶液0.1mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、8.0mL置于10mL的容量瓶中，用100%的乙醇溶液分別稀釋定容至刻度，搖勻。按照上述色譜條件，分別進(jìn)樣分析，每個樣品重復(fù)測定3次，分別取峰面積的平均值。標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖見圖1。以峰面積為縱坐標(biāo)，喜樹堿溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（見圖2），進(jìn)行線性回歸，得峰面積（Y）與喜樹堿濃度（X）一元線性回歸方程：y＝6.0×10-5X－2.321，R2=0.998，線性范圍：3.00～44.83mg·L-1。

根據(jù)方程可得喜樹堿提取率的計算公式如下：

提取率‰=（濃度×體積×10-6/樣品質(zhì)量）×103

圖1 喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖

圖2 喜樹堿濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2.4精密度測定

按照3.2.1和3.2.2所確定的色譜條件，取同一濃度的喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣，每次進(jìn)樣5μL。精密度測定當(dāng)峰面積分別為：729347.9和782139.250時，標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為：8425.4和7604.1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為：1.16%和1.01%，可見標(biāo)準(zhǔn)偏差為7604.1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差約為1.01%時，標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均很小，表明試驗結(jié)果精密度良好。

3.2.5儀器穩(wěn)定性試驗

按照3.2.1和3.2.2所確定的色譜條件，取同一濃度的喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別于2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h測定其峰面積，每次進(jìn)樣5μL，重復(fù)操作三次。

求得標(biāo)準(zhǔn)偏差為152129.90，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.76%，見表1，標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均較小，表明儀器的穩(wěn)定性較好，試驗數(shù)據(jù)精確，結(jié)果可靠。

表1 儀器穩(wěn)定性測定結(jié)果

3.2.6重現(xiàn)性試驗

用電子天平精確稱取同一樣品5份，每份1.000 g采用乙醇超聲法提?。阂掖己?0%，超聲提取時間4min。按3.2.1和3.2.2所確定的色譜條件進(jìn)行喜樹堿含量的測定，每個樣品重復(fù)測量3次。

測得標(biāo)準(zhǔn)偏差為86842.3，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.95%（見表2），表明本試驗的重現(xiàn)性較好。

表2 重現(xiàn)性試驗結(jié)果

3.2.7回收率的測定

精確稱取同一樣品5份，采用乙醇超聲法提取，乙醇含量60%，超聲提取時間4min。向提取液中分別加入52mg/L的喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液10mL，按3.2.1和3.2.2所確定的色譜條件測定喜樹堿含量，計算回收率。

回收率(%)=[(加標(biāo)樣后喜樹堿含量－樣品中喜樹堿含量)/加入標(biāo)樣量]×100%

表3 回收率試驗結(jié)果

可見，平均回收率較高，為96.154，且標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均較小，表明以該方法提取喜樹堿結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

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10.3969/j.issn.1008-1267.2011.02.019

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