配解核桃蛋白制備抗氧化肽的研究

林 燕，陳計巒，胡小松，廖小軍，張 燕，吳繼紅，*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，教育部果蔬加工工程研究中心，北京100083;2.石河子大學，新疆石河子832003)

配解核桃蛋白制備抗氧化肽的研究

林 燕1，陳計巒2，胡小松1，廖小軍1，張 燕1，吳繼紅1，*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，教育部果蔬加工工程研究中心，北京100083;2.石河子大學，新疆石河子832003)

利用木瓜蛋白酶酶解核桃分離蛋白制備小分子活性肽，并研究了不同分子量段核桃小分子肽的抗氧化性能。通過單因素實驗和正交實驗，確定了木瓜蛋白酶制備抗氧化肽的最佳酶解條件為:pH8.5，溫度50℃，酶與底物濃度之比［E］/［S］=3∶100，底物濃度［S］=3.5g/100mL，酶解時間5h。用截留分子量分別為3kDa和10kDa的超濾膜將核桃粗肽液分離成＜3kDa、3～10kDa及>10kDa 3個分子量段，并對不同分子量段核桃多肽的抗氧化性進行了研究，結果表明，分子量＜3kDa的核桃多肽的抗氧化性大于其他兩個分子量段。

核桃蛋白，核桃小分子肽，抗氧化性

核桃(Juglans regia L.)又名胡桃、羌桃、合桃等，是胡桃科核桃科屬多年生落葉喬木的果實，與扁桃、腰果、榛子并列為世界4大干果。核桃仁富含油脂、蛋白質(zhì)及維生素等營養(yǎng)成分，其中蛋白質(zhì)含量15%左右。核桃蛋白由四種蛋白質(zhì)組成，為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白，分別占核桃蛋白總量的6.81%、17.57%、5.33%和70.11%。核桃蛋白含有18種氨基酸，其中有8種必需氨基酸，氨基酸組成中，精氨酸、谷氨酸、組氨酸、酪氨酸等含量相對較高［1］。近年來科學研究發(fā)現(xiàn)，人類攝取蛋白質(zhì)經(jīng)消化酶作用后，并非主要以氨基酸的形式吸收，而是以肽的形式吸收［2－3］。國外已經(jīng)有大量的生物活性肽通過蛋白酶水解營養(yǎng)或貯藏蛋白釋放和辨別出來［4－6］。我國水解蛋白制備生物活性多肽的研究相對滯后，直至20世紀90年代才有一些研究報道。對植物蛋白的有效利用，開發(fā)生物活性短肽具有巨大的產(chǎn)業(yè)化價值和市場潛力，必將會產(chǎn)生顯著的社會效益和經(jīng)濟效益。因此，本實驗目的在于優(yōu)化酶解核桃蛋白制備生物活性短肽的工藝，并通過超濾分離獲得不同分子量段的小分子肽，對其抗氧化性進行比較研究，以期為更好地開發(fā)利用核桃生物活性短肽提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高溫核桃餅粕、低溫核桃餅粕 河北石家莊萬晶干果有限公司，餅粕經(jīng)粉碎后過60目篩，水分9.98%、蛋白質(zhì)51.24%、灰分10.98%;木瓜蛋白酶、Fe3+－三吡啶－三吖嗪(TPTZ)、1，1－二苯基苦基苯肼(DPPH·) Sigma公司，色譜純。

TDL－5－A低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠;pH計 美國奧立龍公司;LGJ－10冷凍干燥機 北京松原華興科技發(fā)展有限公司;T6紫外－可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 核桃分離蛋白的提取 將10g核桃粕溶解在100mL磷酸緩沖液(pH7.5～10.0)中，調(diào)節(jié)溫度至60℃，pH至9.0，并滴加1mol/L NaOH維持pH不變。在酶解過程中不斷進行攪拌，1h后提取結束，將混合液在轉(zhuǎn)速為4800r/min的條件下離心20min，利用0.5N HCl將獲得的上清液pH調(diào)至4.0～5.0。pH的調(diào)節(jié)導致大部分蛋白質(zhì)沉淀，利用離心的方法將蛋白質(zhì)分離(25℃，20min，4800r/min)并進行冷凍干燥，獲得核桃分離蛋白。

1.2.2 核桃蛋白的酶解

1.2.2.1 單因素實驗 按不同的底物濃度(2.0～4.5g/mL)配成核桃分離蛋白溶液，勻漿1min，升溫至所需溫度(40～60℃)后調(diào)節(jié)初始pH(7.0～10.0)，加入適量酶(1∶100～6∶100)進行水解并恒溫磁力攪拌。達到設定的酶解時間(120～360min)后，將酶解液于沸水浴中滅酶20min，離心20min(4800r/min)，過濾，所得濾液即為核桃蛋白水解液，然后測定濾液的水解度。所得濾液經(jīng)冷凍干燥得到核桃小分子肽，以備后續(xù)超濾分離及抗氧化性能測定。

1.2.2.2 正交實驗 為了獲得核桃蛋白的最優(yōu)水解條件，在單因素實驗的基礎上，選取pH、酶與底物濃度之比［E］/［S］、底物濃度［S］(g/mL)、時間(min)為四個因素，各取3個水平，以水解度為主要指標做正交實驗，因素水平設計如表1。

表1 核桃蛋白酶解的正交實驗設計

1.2.3 水解度的測定 茚三酮法［7］。

1.2.4 核桃小分子肽的超濾分離 實驗采用超濾設備，板式膜組件，膜材料為親水性聚醚砜膜，帶負電，分子截留量分別為10kDa和3kDa。核桃肽溶液pH為7.0，高于核桃蛋白等電點pH4.5，帶負電，在膜上吸附較少。配制核桃肽溶液，用截留分子量為10kDa的超濾膜對其進行一級超濾，一級超濾的基本條件為壓力200Pa，溫度25℃，核桃肽溶液濃度為5%，超濾后得到分子量＜3kDa的核桃小分子多肽溶液;采用截留分子量為3kDa的超濾膜對濾過液進行二級超濾處理，二級超濾實驗的基本條件為150Pa，溫度25℃，得到分子量為3～10kDa及>10kDa的核桃小分子肽，分別收集各階段的核桃多肽溶液并濃縮，經(jīng)冷凍干燥得到核桃多肽粉。

1.2.5 抗氧化性的測定

1.2.5.1 鐵還原能力測定 參照Aljadi等［8］的研究方法，采用鐵離子還原法(FRAP)測定樣品的鐵還原能力，并略作修改。其基本原理為:Fe3+－三吡啶－三吖嗪(TPTZ)可被試樣中還原物質(zhì)還原為Fe2+而呈現(xiàn)藍色，并于593nm處有最大吸收值，根據(jù)吸光度的大小，計算出試樣抗氧化活性的強弱。

樣品測定:取250μL樣品加入到4mL TPTZ工作液中(該工作液由25mL 0.3moL/L醋酸鹽緩沖液，2.5mL 10mmoL/L的 TPTZ溶液，2.5mL 20mmoL/L FeCl3組成)，于37℃反應10min后，測定其在593nm處的吸光值。樣品的鐵還原能力以每毫升樣品相當于μg VC的鐵還原能力表示。

VC標準曲線制作:配制含量為 17.61、35.23、105.68、176.13μg/mL的 VC溶液，分別取100μL與TPTZ工作液在相同條件下反應，制作標準曲線。所得標準曲線如圖1所示，計算樣品的總抗氧化能力。所有實驗重復3次。

圖1 VC含量與鐵還原能力的對應關系

1.2.5.2 清除DPPH·能力測定 參照Miller等［9］的研究方法測定樣品清除DPPH·的能力。DPPH·溶于有機溶劑，在517nm處有最大吸收。試樣與DPPH·發(fā)生反應生成黃色物質(zhì)，在517nm處吸光值降低，根據(jù)加入試樣前后的吸光值變化計算試樣對DPPH·的清除率。

0.1 00 1g DPPH·用甲醇溶解定容至50mL。取7mL定容至50mL，最終濃度為0.14mmol/L。樣品測定:4mL DPPH·溶液中加入20μL樣品，常溫避光條件下放置45min后，測定吸光值。以不加樣品的DPPH·溶液為對照。清除DPPH·的能力以每毫升樣品相當于μg VC清除DPPH·的能力表示。

標準曲線:配制濃度為 35.23、70.45、105.68、176.13、246.58μg/mL的VC溶液。4mL DPPH·溶液中加入100μL VC溶液，常溫避光條件下放置45min后，測定吸光值。以不加樣的DPPH·溶液為對照。以VC含量為橫坐標，DPPH·的清除率為縱坐標，作標準曲線，如圖2所示。所有實驗重復3次。

圖2 VC含量與DPPH·清除率的對應關系

2 結果與討論

2.1 影響核桃蛋白的酶解因素

2.1.1 pH對水解度(DH)的影響 在溫度為40℃，酶與底物濃度之比［E］/［S］=2∶100，底物濃度［S］=2.0g/100mL的條件下，酶解1h，測定不同pH下核桃蛋白的水解度。由圖3可知，當pH為8.0時，酶解反應所得到的水解度為最大。pH低于8.0時，核桃蛋白水解度隨pH的升高而上升，但pH高于8.0后，核桃蛋白的水解度隨pH的升高而下降。這是因為酶作為一種特殊的蛋白質(zhì)分子，其催化反應的能力與環(huán)境中的pH密切相關。隨著pH的變化，酶分子的構象及酶分子與底物分子的解離狀態(tài)也表現(xiàn)不同，從而影響酶與底物的結合與催化，促進或抑制酶的活性和酶促反應速度。pH過高或過低對酶促反應均產(chǎn)生不利影響［12］。

圖3 pH對水解度(DH)的影響

2.1.2 溫度對水解度(DH)的影響 在pH8.0，酶與底物濃度之比［E］/［S］=2∶100，底物濃度［S］=2.0g/100mL的條件下，酶解1h，測定不同溫度下的核桃蛋白的水解度。溫度對酶促反應的影響有兩個方面，一方面溫度提高可使反應速度加快;另一方面隨著溫度的升高，酶失活速度也開始加快。如果反應體系中溫度超過酶的最適溫度，酶分子吸收了過多的能量，引起維持酶分子結構的次級鍵解體，導致變性，因而使酶活性降低甚至喪失。這兩方面的綜合影響導致酶促水解反應存在著最適溫度，偏離最適值會降低酶解效果［12］。另外，在高溫環(huán)境中的小分子肽、氨基酸等其他物質(zhì)容易發(fā)生副反應，影響實驗結果。由圖4可知，在溫度較低的范圍內(nèi)，水解度隨著溫度的升高而上升;但當水解溫度達到50℃以上，水解度隨著溫度的上升反而下降。由此可以確定木瓜蛋白酶水解核桃蛋白的最適溫度為50℃。

圖4 溫度對水解度(DH)的影響

2.1.3 酶與底物濃度之比［E］/［S］對水解度(DH)的影響 在pH8.0，溫度50℃，底物濃度［S］=2.0g/100mL的條件下，酶解1h，測定不同酶與底物濃度之比(［E］/［S］)下的核桃蛋白的水解度。由圖5可以看出，隨著［E］/［S］的升高，核桃蛋白的水解度呈現(xiàn)遞增的趨勢;但在［E］/［S］大于4∶100后，水解度的增幅不明顯，這是因為當［E］/［S］較低時，底物過量，酶與底物完全結合，水解程度增大;當［E］/［S］較高時，底物濃度低，酶分子過飽和，有一部分分子沒有機會與底物結合，所以水解度變化不大，所以最適［E］/［S］為4∶100。

圖5 酶與底物濃度之比［E］/［S］對水解度(DH)的影響

2.1.4 底物濃度［S］對水解度(DH)的影響 在pH8.0，溫度50℃，酶與底物濃度之比［E］/［S］=2∶100的條件下，酶解1h，測定不同底物濃度下的核桃蛋白的水解度。由圖 6可知，底物濃度低于3.5g/mL時，核桃蛋白的水解度隨著底物濃度的增大而升高，處于一級反應狀態(tài);但之后隨著底物濃度的增大，水解度緩慢上升甚至有下降的趨勢，開始向零級反應狀態(tài)過渡，因此可以認為高于3.5g/mL的底物濃度會產(chǎn)生底物抑制。考慮工業(yè)化生產(chǎn)及其經(jīng)濟效益，木瓜蛋白酶酶解核桃蛋白的最佳底物濃度為3.5g/mL。

圖6 底物濃度［S］對水解度(DH)的影響

2.1.5 提取時間對水解度(DH)的影響 從圖7可以看出，前4h水解度隨時間增加上升很快，4h后水解度上升緩慢，最后趨于平緩，這是由于隨著反應的進行，酶的濃度逐漸降低，活性降低，酶的活性部位已被核桃蛋白所飽和，反應趨于平衡。究其原因，隨著酶解反應的進行，底物濃度減小，反應位點逐漸被酶分子飽和，可能被酶作用的肽鍵數(shù)量減少;酶解產(chǎn)物濃度增加，其競爭性抑制變強;酶活性隨反應進行而降低;中間復合物［ES］經(jīng)歷了初始階段后趨于恒定，上述因素綜合作用的結果使得酶解速度均隨時間延長而逐漸下降，所以從節(jié)約能源角度考慮，最適酶解時間為4～5h。

2.1.6 正交實驗 按表1進行核桃蛋白酶解的正交實驗，得到核桃蛋白酶解的正交實驗結果如表2。由極差分析可知，影響核桃蛋白酶解的因素由大到小依次是:A>B>D>C，即pH>酶與底物濃度之比［E］/［S］>提取時間>底物濃度［S］。較優(yōu)的提取工藝條件為A3B1C2D3，即pH 8.5，酶與底物濃度之比［E］/［S］=3∶100，底物濃度［S］=3.5g/mL，提取時間5h，可獲得核桃蛋白酶解的最高水解度，即28.15%。胡鑫等［13］同樣利用木瓜蛋白酶對核桃蛋白進行酶解，得到最佳酶解條件為:pH9.0，溫度40℃，酶量150U/g，底物濃度4g/100mL，酶解時間為2h，水解度約為20%。丁曉雯［14］等研究了五種蛋白酶對核桃蛋白的水解作用，發(fā)現(xiàn)AS.1398中性蛋白酶為水解核桃蛋白最佳酶，最佳酶解條件為:pH7.5，溫度40℃，酶與底物濃度之比［E］/［S］=7∶100，底物濃度［S］=2.5%，酶解時間3h，水解度高達45.37%，遠遠高于本實驗的最高水解度。因此，影響水解度大小的因素有很多，從酶的選擇到酶解條件的優(yōu)化，只有通過全面分析，才能得到目標多肽。

表3 核桃小分子肽的抗氧化性

圖7 提取時間對水解度(DH)的影響

表2 核桃蛋白酶解的正交實驗結果

2.2 核桃蛋白的抗氧化性

蛋白質(zhì)解離為肽段后，可解離基團數(shù)增加，導致親水性和凈電荷數(shù)增加;同時，分子結構改變使原本埋藏的疏水中心暴露在溶液環(huán)境中。這種結構改變相應帶來功能特性和生物活性改變，從而使肽段具備螯合金屬離子、清除自由基和促進過氧化物分解等作用［15］。

本實驗分別測定了不同分子量段核桃小分子肽的鐵還原能力(FRAP)、清除DPPH·、·OH、O－2·的能力，得出的結果具有一致性，當一種活性指標高時，其他兩個活性指標也高，由表3可知，超濾原液中分子量 ＜3kDa的組分體外鐵還原能力、清除DPPH·能力、清除·OH能力、清除·能力均大于其他組分，分子量>10kDa的組分體外抗氧化性最差，甚至不及未進行超濾的超濾原液。其中，分子量＜3kDa的核桃小分子肽清除DPPH·的能力比分子量為3～10kDa高67.75%，是分子量>10kDa的8倍。而分子量 ＜3kDa的核桃小分子肽在鐵還原能力、·OH清除能力及·清除能力方面均比分子量3～10kDa的高出50%以上，是>10kDa的3～8倍，這與前人的研究是一致的。石康寧［16］等研究了大豆活性肽的抗氧化性，發(fā)現(xiàn)抗氧化能力大小與大豆活性肽的分子量有關，分子量小的大豆肽普遍比分子量大的抗氧化力大。Yamaguchi［10］酶解大豆分離蛋白6h后也發(fā)現(xiàn)分子量小的肽具有較強抗氧化活性，易被腸道吸收，故可直接在機體中發(fā)生作用。Andre’s Moure［17］等在研究超濾法分離大豆蛋白對酶解肽段抗氧化性影響時提出結論:分子量小于10kDa肽段顯示出最佳抗氧化性，分子量介于30～50kDa肽段顯示出較強清除羥基自由基能力，分子量大于50kDa肽段Trolox當量抗氧化能力較強(高達6.6mmol/L Trolox)。

由各超濾組分的體外抗氧化活性可知，核桃小分子肽的抗氧化性與其分子量大小密切相關，小分子量短肽的抗氧化性比較明顯。由此可見，超濾可對核桃小分子肽的抗氧化性起到一定的富集作用，采用蛋白酶水解與超濾法結合制備的核桃小分子肽的抗氧化性遠高于核桃酶解的粗產(chǎn)物。另外，小分子量肽段抗氧化性更強，在水解時應盡可能提高水解度，以提高小肽含量。

3 結論

以核桃分離蛋白為原料，選用木瓜蛋白酶水解制備核桃小分子肽，通過一系列的單因素實驗和正交實驗，經(jīng)極差分析得到了水解的最佳工藝條件:pH8.5，溫度50℃，酶與底物濃度之比［E］/［S］=3∶100，底物濃度［S］=3.5g/100mL，酶解時間為5h。

小分子肽的抗氧化性與其分子量的大小密切相關，本實驗中分子量段為＜3kDa的核桃小分子肽的鐵還原能力、清除DPPH·能力、清除·OH及清除·的能力均比其他分子量段的高出50%，甚至達倍數(shù)以上，說明，分子量越小的短肽抗氧化性越強。水解程度是影響多肽分子量大小的主要因素，為了進一步研究核桃小分子肽的抗氧化性，本實驗的下一步目標將研究不同水解度及分子量大小與抗氧化性大小的關系。

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Preparation of antioxidant peptide from walnut protein by enzymatic hydrolysis

LIN Yan1，CHEN Ji－luan2，HU Xiao－song1，LIAO Xiao－jun1，ZHANG Yan1，WU Ji－h(huán)ong1，*
(1.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Key Laboratory of Fruits and Vegetables Processing，Ministry of Agriculture，Engineering Research Centre for Fruits and
Vegetables Processing，Ministry of Education，Beijing 100083，China;2.Food College of Shihezi University，Shihezi 832003，China)

It was studied that the technique of the enzymatic hydrolysis of walnut to prepare the peptide with lowmolecular weights，antioxidant activities of which were also determined.The optimum hydrolysis conditions(pH8.5，temperature 50℃，the ratio of enzyme concentration to substrate concentration［E］/［S］=3∶100，substrate concentration［S］=3.5g/100mL，time 5h)were obtained through single factor test and orthogonal test.Walnut peptides were isolated into 3 parts by ultrafiltration membranes with 3kDa MWCO(Molecular Weight Cutoff)，10kDa MWCO respectively.The antioxidant activities of different parts of walnut peptides were studied，which revealed that the part of walnut peptides with molecular weight＜3kDa showed the best antioxidant activities.

walnut protein;walnut peptide;antioxidant activities

TS255.6

A

1002－0306(2011)04－0204－05

2010－03－25 *通訊聯(lián)系人

林燕(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:果蔬加工與貯藏。