土雷素完全抗原抗原的制備與鑒定

徐桂連，代翠紅，馬 鶯

(哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150001)

土雷素完全抗原抗原的制備與鑒定

徐桂連，代翠紅，馬 鶯*

(哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150001)

為了建立土霉素完全抗原的制備方法，實驗以土霉素為半抗原，牛血清白蛋白(BSA)為載體蛋白，利用N，N，－二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)、鄰聯(lián)甲苯胺(o－tolidine)為偶聯(lián)劑，將牛血清白蛋白與土霉素偶聯(lián)制備土霉素人工完全抗原。通過偶聯(lián)率的計算確定鄰聯(lián)甲苯胺為最佳偶聯(lián)劑。隨后利用紅外光譜分析和免疫原性測定實驗鑒定了土霉素、牛血清白蛋白和鄰聯(lián)甲苯胺的偶聯(lián)情況。結果表明，制得的土霉素完全抗原在免疫健康的Balb/c小鼠體內能刺激小鼠機體產生最高效價為25600(ELISA)的抗血清。

土霉素，完全抗原，鑒定

土霉素屬于四環(huán)素類抗生素，是一種廣譜高效的抗菌素，廣泛地應用于水產品以及畜禽的疾病防治中。長期以來由于土霉素的大量使用，造成其在畜產品中殘留超標問題非常嚴重，土霉素在水產品以及畜禽體內的殘留會嚴重危害消費者健康以及生態(tài)環(huán)境［1－2］。目前，土霉素殘留檢測常用方法有高效液相色譜法［3－4］、高效液相色譜－ 質譜法［5］、免疫方法［6］等。上述儀器分析方法雖然準確靈敏，但是需要昂貴的儀器，復雜的樣品處理過程，并且耗時較長，因而不適用于適時、快速的檢測。而免疫分析方法具有靈敏度高、簡單、省時等特點，正好彌補上述方法的缺陷［6－7］。如免疫金標試紙條法，該法準確、快速、靈敏，適合適時實地快速檢測。但是由于土霉素是小分子半抗原，不具有免疫原性，因而要建立檢測土霉素的免疫方法，首先要制備出高效的土霉素完全抗原。目前用于完全抗原的制備方法主要有混合酸酐法［8］、重氮化法［9］、碳化二亞胺法［10］、戊二醛法等。而文獻報道的用于制備土霉素完全抗原的方法只有水溶性碳化二亞胺法和戊二醛法。因而本實驗選用鄰聯(lián)甲苯胺、脂溶性碳化二亞胺(DCC)作為偶聯(lián)劑，分別將牛血清白蛋白與土霉素偶聯(lián)，合成了土霉素人工免疫抗原。通過偶聯(lián)率的計算確定出了最佳偶聯(lián)劑，并進一步利用紅外光譜以及小鼠免疫實驗鑒定偶聯(lián)結果，為建立高效、準確的土霉素殘留免疫檢測方法奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土霉素半鈣鹽標準品、鄰聯(lián)甲苯胺、弗式完全佐劑(cFA)、弗式不完全佐劑(iFA)、牛血清白蛋白(BSA)、吐溫－20、卵清蛋白(OVA)、N，N，－二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)、N－羥基琥珀酰亞胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF) Sigma;羊抗鼠辣根過氧化物酶標記抗體 北京金杉化學試劑有限公司;3，3，5，5－四甲基聯(lián)苯胺 Amerisco;5周齡Balb/c小鼠 健康雄性，購于中國哈爾濱獸藥研究所;PBS NaCl 8.00g，KCl 0.20g，KH2PO40.20g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，加蒸餾水至1000mL;包被緩沖液(0.05mol/L，pH9.6) Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加蒸餾水1000mL;封閉液 1g酪蛋白，包被緩沖液100mL;洗滌液 PBST(0.0lmol/L，pH7.4):NaCl 8.00g，KCl 0.20g，KH2PO40.20g，Na2HPO4· 12H2O，2.9g Tween－20 0.5mL，加蒸餾水至1000mL;抗體稀釋液明膠0.10g，洗滌液100mL;終止液(2mol/L，H2SO4)濃硫酸(98%)22.2mL，蒸餾水177.8mL;底物緩沖液(SB，0.05mol/L pH5.0磷酸－檸檬酸溶液)

0.2 mol/L Na2HPO4· 12H2O(71.63g/L)25.7mL，0.1mol/L檸檬酸·H2O(42.028g/L)24.3mL，加蒸餾水至100mL;TMB底物儲存液 TMB 6mg溶解于無水乙醇1mL，混勻后置于－20℃存放;TMB測定液(現(xiàn)用現(xiàn)配) 用時取TMB儲存液100μL，加入底物緩沖液10mL，30%H2O215μL，混勻。

96孔酶標板 Costar;透析袋 Union Carbide;酶標儀 Bio－Rad450;紫外掃描儀 北京普析通用儀器公司;FTIR－7600傅里葉紅外光譜儀 天津港東科技股份發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 土霉素完全抗原的制備

1.2.1.1 DCC法 在Nuria和Shen報道方法的基礎上進行了修改。將0.25g對氨基苯甲酸溶于8mL，2mol/L 4℃的HCl中，加入1mL 155mg/mL的亞硝酸鈉溶液，置于4℃攪拌10min。將上述反應所得溶液加入土霉素溶液中(0.9g溶于 30mL 0.2mol/L的NaOH中)，混合物pH保持在8～9之間，并在10℃攪拌2h，取出冷卻至室溫，弱酸化后，濾除液用濃鹽酸調節(jié)至3.0，然后過濾得沉淀，沉淀用冷蒸餾水洗滌，最后冷凍干燥獲得對氨基苯甲酸土霉素。

稱取對氨基苯甲酸土霉素0.315g、NHS 0.057g和DCC 0.11g溶解于2mL的N，N－二甲基甲酰胺中，在室溫下攪拌5h，離心得上清。將100mg的BSA溶解于10mL 0.05mol/L(pH8)的磷酸緩沖液中，在4℃緩慢攪拌24h，以使偶聯(lián)充分完成。反應后所得的溶液用0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液充分透析至透析液在190～600nm無紫外吸收，所獲得的土霉素人工免疫完全抗原記為OTC－D－BSA。

1.2.1.2 鄰聯(lián)甲苯胺法 在Zhang報道方法的基礎上進行了修改。將125mg O－tolidine溶解于22.5mL的0.2mol/L冰冷的HCl溶液中，然后向O－tolidine溶液中逐滴加入35mg/mL的NaNO2溶液2.5mL，置于4℃，避光反應1h，得到溶液A，備用。

稱取土霉素半鈣鹽0.08g，先溶解于830μL的0.2mol/L硫酸溶液中，取上清備用。稱取牛血清白蛋白0.145g溶解于10mL的硼砂緩沖液中，將所有土霉素上清及5mL A液同時加入到牛血清白蛋白中，將反應液置于避光條件下反應2h，得到土霉素免疫原溶液。用PBS緩沖液在0～4℃透析，每隔6～8h換透析液，至PBS透析液在190～600nm不再有紫外吸收為止。將透析袋后的反應溶液5000r/min離心5min，棄去沉淀，將上清冷凍干燥，獲得的土霉素完全抗原(OTC－o－olidine－BSA)，存于－20℃。

1.2.2 土霉素完全抗原紫外掃描和偶聯(lián)率的分析1.2.2.1 土霉素完全抗原的紫外掃描 分別配制濃度為40μg/mL的土霉素溶液及520μg/mL的牛血清白蛋白溶液，并將OTC－D－BSA和OTC－o－olidine－BSA稀釋100倍。分別將4份樣品在190～600nm波長范圍內進行紫外掃描。把OTC－D－BSA和OTC－o－olidine－BSA的紫外掃描圖譜同時與土霉素及牛血清白蛋白的標準譜圖對比，判定土霉素與牛血清白蛋白的偶聯(lián)反應效果。

1.2.2.2 土霉素完全抗原的偶聯(lián)率的測定 作土霉素與牛血清白蛋白在278nm處濃度對吸光度的標準曲線。將上述制得的兩種土霉素完全抗原稀釋100倍后，測定該濃度下其在278nm處的吸光值A0。近似認為在反應和透析過程中牛血清白蛋白不發(fā)生損失，通過Bradford法測得完全抗原溶液中牛血清白蛋白濃度C，依據牛血清白蛋白的紫外吸收標準曲線，可得到蛋白濃度為C時，牛血清白蛋白的紫外吸收值A2。按照吸光值可疊加原理，合成的土霉素完全抗原中土霉素對總吸光值A0的貢獻(A1)應為土霉素完全抗原的吸光值減去BSA對A0的貢獻:A1=A0－A2，由A1和土霉素標準曲線可知土霉素在完全抗原中的濃度。將牛血清白蛋白和土霉素的質量濃度比轉換為摩爾濃度比，該比值即為偶聯(lián)率［14］。

1.2.3 土霉素完全抗原的紅外光譜檢測 分別將OTC－o－olidine－BSA和土霉素以及牛血清白蛋白在4000～500cm－1進行紅外光譜測定，以鑒定牛血清白蛋白與土霉素偶聯(lián)情況。

1.2.4 土霉素完全抗原免疫原性的測定

1.2.4.1 小鼠免疫實驗 選取5只健康的Balb/c小鼠飼養(yǎng)兩周，無異樣，尾靜脈采血，取血清做陰性對照。

將土霉素完全抗原、生理鹽水、弗式佐劑混合物在漩渦混合器上乳化完全，以滴于水面上聚滴不擴散為準。首次免疫采用皮下多點注射，注射劑量為每只小鼠1mL。其后采用腹腔注射方法進行小鼠免疫，每次免疫劑量為0.3mL。首次免疫間隔時間為2周，其后間隔時間為一周。

第3次免疫后，尾靜脈采血，血液置于4℃靜置24h，然后5000r/min離心10min，取上清，測定效價或分裝置于－20℃保存。

1.2.4.2 間接非競爭 ELISA測定抗血清效價 在Aga和Burkin的測定方法基礎上做了改進［6－7］。將土霉素包被抗原稀釋100倍后，每孔加入100μL，置于4℃的冰箱中包被12h。包被完畢后，棄去孔內液體，用洗滌液洗滌三次，每次20s。洗滌完畢后，在濾紙上拍干后加入封閉液150μL每孔，置于37℃的溫箱中溫育2h，取出洗滌5次，每次20s。洗滌完畢后加入待測稀釋血清溶液，將所取血清按倍比稀釋，然后按順序加到酶標板中，50μL每孔(每個稀釋度設3個平行對照孔)。設空白、陰性對照。然后置于37℃的溫箱中溫育1h，棄去液體，洗滌完畢后加入酶標二抗。將1∶5000倍稀釋的辣根過氧化物酶加入各孔，每孔50μL。置于37℃的溫箱中溫育30min。而后洗滌拍干加入顯色液，隨后置于37℃的溫箱中顯色10min。顯色完畢后取出，每孔加入0.2mol/L H2SO4終止液50μL。最后利用酶標儀測定讀數(shù)。以待測抗血清OD值大于陰性對照的2.1倍以及大于0.1，判斷為陽性，以判定值對應的最大血清稀釋倍數(shù)為血清效價。

2 結果與討論

2.1 土霉素完全抗原的制備

土霉素是四環(huán)素類抗生素的一種，具有并四苯環(huán)結構。在D環(huán)上含有酚羥基結構，如圖1。由于土霉素的分子量只有460.44，為小分子半抗原，在將其與載體蛋白的偶聯(lián)制備完全抗原的過程中，常利用其D環(huán)上的酚羥基結構，對其進行修飾改造。本實驗所涉及的兩種方法——DCC法和鄰聯(lián)甲苯胺法也利用到了該官能團。

圖1 土霉素結構式

2.1.1 DCC法 DCC法用于含有羧基和氨基的化合物的偶聯(lián)，在半抗原和載體蛋白之間形成肽鍵。土霉素完全抗原按照圖2所示的反應步驟順序進行。土霉素結構中并不含有羧基，因而首先通過重氮化法，引入羧基。對氨基苯甲酸在酸性條件下被重氮化，重氮化的對氨基苯甲酸與土霉素酚羥基對位發(fā)生偶氮化，進而引入羧基官能團。引入羧基后的土霉素在DCC的作用下，首先與NHS生成活潑酯衍生物，后者與BSA賴氨酸殘基上的氨基反應，形成以酰胺鍵連接的偶合物。土霉素完全抗原制備方法報道的很多［13，17］，而本法未見報道。Alexander和楊曉姣采用DCC法分別合成了二氯苯二甲脲完全抗原和氯霉素完全抗原［15－16］。本實驗通過對DCC法用于土霉素完全抗原的研究，為建立高效的制備土霉素安全抗原的方法奠定基礎。

圖2 碳化二亞胺法制備土霉素完全抗原合成路線

2.1.2 鄰聯(lián)甲苯胺法 實驗利用雙官能團試劑鄰聯(lián)甲苯胺作為偶聯(lián)劑，將土霉素與BSA連接，反應過程按照圖3所示的步驟進行。首先鄰聯(lián)甲苯胺在酸性條件下重氮化，由于重氮化物不穩(wěn)定，溫度必須保持在4℃以下。重氮化后的鄰聯(lián)甲苯胺在pH=8.5條件下與BSA的酪氨酸殘基的酚羥基鄰位、土霉素酚羥基的對位發(fā)生偶氮反應［18］。該法在反應過程中產生偶氮化物，可見明顯的顏色變化，合成的土霉素完全抗原呈血紅色，透析過程顏色不變化，說明偶合反應確有發(fā)生。與現(xiàn)有的土霉素完全抗原合成方法相比［17］，該法為一步偶合反應，反應過程簡單易操作，反應現(xiàn)象明顯，并且該法以前未被用于土霉素完全抗原的合成研究中。Zhang等人采用該法成功合成了四環(huán)素完全抗原［13］。

圖3 鄰聯(lián)甲苯胺法制備土霉素完全抗原合成原理

式(2)為重氮化的鄰聯(lián)甲苯胺與BSA及土霉素連接。

2.2 土霉素完全抗原的紫外掃描與偶聯(lián)率的測定

2.2.1 土霉素完全抗原紫外掃描圖譜 圖3、圖4為土霉素、土霉素完全抗原、牛血清白蛋白在190～600nm波長下的紫外掃描圖譜。由圖可知，土霉素在270nm和355nm有最大吸收峰，牛血清白蛋白在278nm下有最大吸收峰。OTC－D－BSA最大吸收峰為270nm和415nm，OTC－o－tolidine－BSA最大吸收峰為275nm和485nm，與牛血清白蛋白和土霉素相比，土霉素完全抗原的紫外最大吸收峰都發(fā)生了明顯的紅移。這是由于土霉素完全抗原引入了偶氮基團，增強了分子的共軛效應，而導致其吸收峰向長波長移動。

圖4 土霉素、牛血清白蛋白、OTC－D－BSA的紫外掃描圖譜

圖5 土霉素、牛血清白蛋白、

2.2.2 土霉素完全抗原的偶聯(lián)率的測定 牛血清白蛋白與土霉素在278nm處濃度對吸光度的標準曲線分別為 y=0.6793x+0.0427(R2=0.9999)和 y=0.0214x+0.0759(R2=0.9993)。

根據土霉素與牛血清白蛋白的標準曲線以及OTC－D－BSA中的蛋白濃度8.75mg/mL和OTC－otolidine－BSA中蛋白濃度9.82mg/mL，計算得到OTC－D－BSA中OTC與BSA的偶聯(lián)摩爾率為15.6∶1，而OTC－o－tolidine－BSA中BSA與土霉素的偶聯(lián)摩爾率為8.5∶1。本實驗利用碳化二亞胺法和o－tolidine法所制備的土霉素完全抗原中BSA與土霉素偶聯(lián)率較文獻報道的高［17］。但是研究表明，半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)率并不是越高越好，過高的偶聯(lián)率會抑制載體蛋白對機體的免疫刺激作用，而最佳的偶聯(lián)率為1∶5～1∶10之間［19－20］。因而本實驗選用鄰聯(lián)甲苯胺法所制備的土霉素完全抗原可以進行下一步實驗。

2.3 土霉素完全抗原紅外光譜圖

分別配制濃度為 40μg/mL的土霉素溶液及520μg/mL的牛血清白蛋白溶液，并將 OTC－otolidine－BSA稀釋100倍。分別將3份樣品在4000～500cm－1進行紅外光譜測定，其紅外光譜圖如圖6中a、b、c所示。

由圖6a牛血清白蛋白的紅外光譜圖可知，載體蛋白BSA具有蛋白質類共有的譜帶，3429.75cm－1處為N－H伸縮振動，而1646.59cm－1與1543.09cm－1處分別為蛋白質所特有的酰胺譜帶Ⅰ和酰胺譜帶Ⅱ，2931.81cm－1為－CH2－的弱伸展譜帶，可在1457.86cm－1處找到其面內彎曲振動區(qū)［21］。

圖6 牛血清白蛋白(a)、土霉素(b)、OTC－o－tolidine－BSA(c)的紅外光譜

由土霉素的紅外光譜(圖 6b)可知，其在3421.06cm－1處有 N－H 伸 縮 振動區(qū)，1602.88、1510.51、1456.12cm－1為苯環(huán)C=C鍵的伸縮振動譜帶，1323.27cm－1為土霉素叔胺基的特征譜帶。

由OTC－o－tolidine－BSA(圖6c)紅外光譜可知，其在1646.03cm－1處具有吸收，這是蛋白質中氨基酸產生的特征峰。此外，在OTC－o－tolidine－BSA的紅外光譜(圖6c)2924.47cm－1和2854.78cm－1處出現(xiàn)了－CH2的伸縮振動，同時在1457.41cm－1可見其面內彎曲振動，該官能團在土霉素中是沒有的，而在BSA有該官能團。這說明合成的 OTC－o－tolidine－BSA引入了BSA。將OTC－o－tolidine－BSA的紅外光譜與土霉素的紅外光譜(圖6b)相比較:1314.12cm－1處產生了土霉素特有的叔胺基光譜吸收，而BSA中不含有叔胺基，因此在此處無明顯吸收，說明 OTC－otolidine－BSA具有土霉素的特征官能團的存在，由此說明土霉素與BSA偶聯(lián)反應的發(fā)生，因此OTC－otolidine－BSA可以作為免疫原進行小鼠免疫實驗。

2.4 完全抗原免疫原性的測定

如圖7所示，免疫次數(shù)在3～9次時，抗體效價隨免疫次數(shù)的增加而顯著上升，免疫第63d后，抗血清最高效價達到25600(ELISA)，在相同的免疫時間內，實驗所達到的抗血清效價比文獻報道的效價高［17］，這說明本實驗用o－tolidine法所制備土霉素完全抗原是可行的。但是當免疫次數(shù)大于9次后，抗體效價并不如預期那樣持續(xù)升高，而是有所降低。因而該結果表明，免疫次數(shù)與免疫效價不呈正相關性。

圖7 土霉素抗體產生曲線

免疫次數(shù)的增加，使得小鼠健康情況下降，出現(xiàn)脫毛、干瘦等現(xiàn)象。此外免疫時間的增加會導致小鼠耐受能力的增強，甚至出現(xiàn)耐藥性。

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Production and identification of oxytetracycilne complete immunogen

XU Gui－lian，DAI Cui－h(huán)ong，MA Ying*
(Harbin Institute of Technology，Harbin 150001，China)

Oxyteracycline complete immunogen was synthesized by using oxytetracycline as a half－immunogen，bovine serum albumen as a carrier protein，and DCC，o－tolidine as cross－linking agents.The conjugantion rate analyzation results showed that the best cross－linking agent was o－tolidine.Then infrared spectrum identification and mice immunization experiment were employed to identify whether oxytetracycline，BSA and o－tolidine were conjugated successfully.Finally，healthy Balb/C mice immunized with oxytetracycline complete antigen produced antisera with the highest ELISA titer up to 25600.

oxytetracycilne;complete immunogen;identification

TS201.3

A

1002－0306(2011)04－0192－05

2010－03－31 *通訊聯(lián)系人

徐桂連(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:食品安全。

哈爾濱市重大攻關項目(2007AA6CN099)。