基于RSM酶法提高蛋清ACE抑制活性

羅賢慧，唐銘鮮，于志鵬，趙文竹，劉博群，董 鑫，馬紅燁，劉靜波

(吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與功能食品研究室，吉林長(zhǎng)春130062)

基于RSM酶法提高蛋清ACE抑制活性

羅賢慧，唐銘鮮，于志鵬，趙文竹，劉博群，董 鑫，馬紅燁，劉靜波*

(吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與功能食品研究室，吉林長(zhǎng)春130062)

研究胰蛋白酶提高蛋清ACE抑制活性的最優(yōu)條件。在單因素實(shí)驗(yàn)(加酶量、pH、溫度、底物濃度)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Design－Expert軟件結(jié)合4因子3水平的Box－Behnken模型響應(yīng)面設(shè)計(jì)，建立胰蛋白酶酶解蛋清制備ACE抑制肽的三元二次回歸正交模型。結(jié)果表明:胰蛋白酶酶法提高蛋清ACE抑制活性的最佳參數(shù)為:加酶量8%、底物濃度3%、溫度39℃、pH 8.0，水解3h，蛋清ACE抑制活性為54%，活性提高近10倍。

胰蛋白酶，蛋清，酶解，響應(yīng)面設(shè)計(jì)

高血壓嚴(yán)重影響著人們的身體健康［1］。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)在調(diào)節(jié)血壓中具有很重要的作用，ACE將無(wú)活性的血管緊張素I轉(zhuǎn)化為有升壓活性的血管緊張素Ⅱ，是引起高血壓的原因之一［2］，抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性可有效降低血壓，可減少高血壓及其他相關(guān)疾病的發(fā)病率和死亡率［3］，近年來(lái)，大量研究表明食物蛋白質(zhì)除了有為機(jī)體提供能量和營(yíng)養(yǎng)等功能以外，還可以分解出不同氨基酸序列的多肽保護(hù)ACE抑制劑而抑制ACE活性的作用［4－7］。這種肽一般隱藏在蛋白質(zhì)序列中沒(méi)有活性，一旦被釋放出來(lái)就表現(xiàn)出ACE抑制活性。目前已經(jīng)成功地從魚(yú)貝類(lèi)、大豆、酪蛋白、玉米、酒糟等眾多食物蛋白質(zhì)中獲得了ACE抑制肽［8］。大量食源性蛋白質(zhì)經(jīng)酶解得到不同氨基酸序列的多肽［9］，其降壓活性不一。本文研究蛋清粉在胰蛋白酶作用條件下酶解得到的ACE抑制肽的最優(yōu)條件及其ACE抑制活性。蛋清含有人體需要的多種營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)，是良好的蛋白質(zhì)來(lái)源［10］，并且有利于人體吸收［11］。胰蛋白酶是腸胃消化道內(nèi)由胰腺分泌的一種消化酶，對(duì)堿性氨基酸具有高度專(zhuān)一性，是一種內(nèi)切酶［12］。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究，胰蛋白酶可酶解大豆蛋白產(chǎn)生不同片段的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性肽［13］。但是胰蛋白酶對(duì)雞蛋蛋清粉的酶解和酶解液的降壓活性目前都還沒(méi)有研究，所以本文研究了體內(nèi)消化酶酶解蛋清粉的最佳條件和在最佳條件下酶解液的ACE抑制活性，為蛋清粉作為制備ACE抑制肽的原料提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋清粉 北京金健力公司;乙腈、三氟乙酸 色譜純，天津市博迪化工有限公司;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、卡托普利(captopriL)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)、馬尿酸(Hippuric acid)、GLy－GLy－GLy、GLy－GLy－Tyr－Arg、胰蛋白酶 均購(gòu)于美國(guó)SIGMA公司;其它試劑 均為分析純;鄰苯二甲酸氫鉀，混合磷酸鹽。

CS－501型超級(jí)恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;ZD－2型自動(dòng)電位滴定儀 上海雷磁;JJ－1精密增力電動(dòng)攪拌器 江蘇省金壇市精城國(guó)用儀器制造廠(chǎng);天平 AG204 瑞士 METTLER TOLEDO;LC－2010高效液相分析儀 配有紫外檢測(cè)器、C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)和LC solution工作站，日本島津 SHIMADZU;超速冷凍離心機(jī) 德國(guó)SIGMA公司;100～1000μL移液器、10～100μL移液器

pipette公司;HJ－6型多頭磁力加熱攪拌器 江蘇金壇榮華儀器有限公司;B－191噴霧干燥機(jī) 瑞士BUCHI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 影響水解效果的單因素實(shí)驗(yàn) 取蛋清粉溶入300mL去離子水中，磁力攪拌15min，置90℃水浴下變性10min，然后在一定溫度條件下加胰蛋白酶酶解2h，并在酶解過(guò)程中不斷攪拌，用0.1mol/L NaOH溶液保持酶解過(guò)程中pH一定。最后以水解度作為酶解程度的指標(biāo)，根據(jù)酶解過(guò)程消耗的NaOH溶液量，采用pH－stat法測(cè)定水解度。在蛋清蛋白質(zhì)酶解過(guò)程中，底物濃度、加酶量、酶解溫度、pH等因素對(duì)酶解均有一定的影響，本實(shí)驗(yàn)以水解度為指標(biāo)依次考察了如下因素對(duì)酶解效果的影響。

1.2.1.1 加酶量對(duì)水解效果的影響 以底物濃度1%，pH為8，溫度37℃為條件因素，加酶量(g/g)為1%、2%、3%、4%、5%的胰蛋白酶進(jìn)行酶解。

1.2.1.2 底物濃度對(duì)水解效果的影響 以0.15g胰蛋白酶，pH8，溫度37℃為條件因素，底物濃度分別為1%、3%、5%、7%進(jìn)行酶解。

1.2.1.3 pH對(duì)水解效果的影響 以底物濃度5%，加酶量(g/g)為1%，溫度37℃為條件因素，分別以pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0進(jìn)行酶解。

1.2.1.4 溫度對(duì)水解效果的影響 以底物濃度5%，加酶量(g/g)為1%，pH8為條件因素，分別以溫度為32、37、42、47℃進(jìn)行酶解。

1.2.2 酶法提高蛋清降壓活性的響應(yīng)面設(shè)計(jì) 在加酶量、底物濃度、pH、溫度四個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Design－Expert軟件，采用4因素3水平的Box－Behnken模型響應(yīng)面設(shè)計(jì)，考察了這3個(gè)因素(表1)的交互作用對(duì)水解度的影響，進(jìn)行6次中心點(diǎn)空白實(shí)驗(yàn)，總計(jì)30次實(shí)驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表

1.2.3 水解度的測(cè)定 pH－stat法。

1.2.4 ACE活性測(cè)定 在Cushman［6］等人方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些修改。取30μL HHL底物液，加入10μL抑制劑混合均勻，在(37±0.5)℃恒溫水浴中預(yù)熱3～5min，然后加入20μL ACE液充分混合，37℃保溫30min后，再加入60μL的1mol/L HC1終止反應(yīng)，得到反應(yīng)液。同時(shí)用10μL pH為8.3的硼酸緩沖液替代抑制劑溶液作為空白對(duì)照組。該反應(yīng)液用0.45μm濾膜過(guò)濾后直接用HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析。色譜條件:柱溫25℃，流速0.5mL/min，流動(dòng)相乙腈/水(0.05%TFA)比例為25/75等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)228nm。ACE抑制活性計(jì)算公式如下:

ACE抑制活性(%)=100(M－N)/M×100%

式中:M為空白對(duì)照組中馬尿酸的峰面積;N為添加抑制劑組中馬尿酸的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果與分析

由圖1可知，隨著加酶量的增加，水解度升高，并且在加酶量達(dá)到一定比值時(shí)，水解度的上升趨勢(shì)有減緩的趨勢(shì);由圖2可以看出，在底物濃度為1%～7%范圍內(nèi)，隨著底物濃度的升高，水解度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，水解度達(dá)到最大;由圖3可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著pH的升高，水解度增大，當(dāng)水解度達(dá)到最大時(shí)，繼續(xù)升高pH，水解度隨著pH的升高而降低。在其他影響水解度的因素一定時(shí)，胰蛋白酶水解蛋清粉的最佳pH在8～8.5之間;由圖4可以看出，水解度先隨著溫度的升高而增加，當(dāng)溫度升高到40℃左右時(shí)，水解度達(dá)到最高值，隨著溫度的繼續(xù)升高，水解度相應(yīng)地逐漸降低。

圖1 加酶量對(duì)水解度的影響

圖2 底物濃度對(duì)水解度的影響

圖3 pH對(duì)水解度的影響

2.2 響應(yīng)面結(jié)果及最優(yōu)工藝

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 根據(jù)各個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)確定的顯著性因素的最優(yōu)參數(shù)，及各個(gè)較優(yōu)條件的低水平和高水平，進(jìn)行Box－Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考查底物濃度、酶用量、pH、溫度四個(gè)因素的交互作用對(duì)蛋清蛋白質(zhì)的酶解情況。如圖5～圖10所示，下面根據(jù)各圖具體情況進(jìn)行分析。

從圖5可以看出，底物濃度不變時(shí)，隨著pH的升高，水解度也增加，當(dāng)pH升高到一定值時(shí)，酶解隨著pH的繼續(xù)升高而降低，pH在8.25左右，酶解達(dá)到最高;將pH固定，酶解隨著底物濃度的增加而降低。

圖4 溫度對(duì)水解度的影響

圖5 底物濃度與pH對(duì)水解度影響的響應(yīng)面圖

由圖6可以看出，底物濃度恒定時(shí)，隨著加酶量的增加，水解度相應(yīng)升高且升高的趨勢(shì)慢慢減小;當(dāng)加酶量固定不變時(shí)，水解度隨著底物濃度的升高而降低。

圖6 底物濃度與加酶量對(duì)水解度影響的響應(yīng)面圖

由圖7可以看出，加酶量一定時(shí)，水解度隨著pH的增大而增加，當(dāng)pH增大到8.25左右時(shí)，水解度達(dá)到最大值，隨著pH的繼續(xù)增大，水解度反而相應(yīng)減小;當(dāng)pH一定時(shí)，隨著加酶量的增加，水解度也增加且增加速率有減小的趨勢(shì)。

圖7 底物濃度與加酶量對(duì)水解度影響的響應(yīng)面

由圖8可以看出，底物濃度不變時(shí)，水解度隨著溫度在37～42℃之間的增加而先增加后減小;當(dāng)溫度不變時(shí)，水解度隨著底物濃度的增加而減小。

圖8 底物濃度與溫度對(duì)水解度影響的響應(yīng)面圖

從圖9可以看出，當(dāng)溫度一定時(shí)，水解度隨著pH的增加先增大后減小，而pH達(dá)到8.25左右，水解度達(dá)到最大;當(dāng)pH一定時(shí)，水解度在37～42℃之間隨著溫度的增加也先增大后減小。

圖9 pH與溫度對(duì)水解度影響的響應(yīng)面圖

從圖10可以看出，當(dāng)加酶量一定時(shí)，水解度隨著溫度37～42℃之間的增加而先增加后減小;當(dāng)溫度一定時(shí)，水解度隨著加酶量的增加而增加，并且隨著加酶量的增加，水解度的增加速率慢慢減小。

圖10 加酶量與溫度對(duì)水解度影響的響應(yīng)面圖

2.2.2 最優(yōu)工藝的確定 根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法，應(yīng)用Design－Expert軟件得到編碼空間四元二次函數(shù)模型為:

DH=－582.99415+6.00723A+5.09358B+120.26967C－20.98508D+0.10925AB+0.44100AC+0.13025AD－0.70750BC+0.43063BD+1.66250CD－0.13768A2－0.31052B2－8.48833C2－0.16177D2

其中:A為溫度;B為加酶量;C為pH;D為底物濃度。通過(guò)方差分析，該方程擬合較好，對(duì)方程求偏導(dǎo)確定最優(yōu)酶解條件為加酶量8%、底物濃度3%、溫度39℃、pH8.0，此條件下水解度實(shí)際值為9.8%，理論值與實(shí)際值擬合較好。在最優(yōu)酶改性條件下，考察了酶改性時(shí)間分別為1、2、3、4h的ACE抑制活性的變化(圖11)，最終確定時(shí)間為3h。

3 結(jié)論

圖11 酶解時(shí)間對(duì)ACE抑制活性的影響

ACE抑制肽的抗胰蛋白酶等體內(nèi)消化酶裂解能力制約其產(chǎn)業(yè)化。體內(nèi)消化酶的裂解造成ACE抑制肽體外具有抑制活性而灌胃后無(wú)降壓活性，因此本文利用胰蛋白酶作為工具酶進(jìn)行酶法改性，提高蛋清ACE抑制活性，同時(shí)旨在提高其酶穩(wěn)定性。本文通過(guò)Box－Behnken模型響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法優(yōu)化體內(nèi)消化酶酶法提高蛋清ACE抑制活性的最優(yōu)條件:加酶量8%、底物濃度3%、溫度39℃、pH8.0，水解時(shí)間3h，ACE抑制活性為54%。

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Study on ACE inhibitory activity of egg white improved by RSM enzymic method

LUO Xian－h(huán)ui，TANG Ming－xian，YU Zhi－peng，ZHAO Wen－zhu，LIU Bo－qun，DONG Xin，MA Hong－ye，LIU Jing－bo*
(Laboratory of Nutrition and Functional Food，College of Quartermaster Technology，Jilin University，Changchun 130062，China)

The study to improve egg white trypsin inhibitory activity of ACE optimal conditions was carried out.Based on the single factor(the amount，pH，temperature，substrate concentration)of the enzyme，Response surface Box－Behnken model design with four factors three levels was evaluated by Design－Expert software processing，and the ternary quadratic regression orthogonal model of egg white powder prepared by trypsin digestion was obtained.The results showed that:the best conditions of egg white trypsin digestion for enzymes 8%，substrate concentration 3%，temperature 39℃，pH8.0，hydrolysis for 3h，the angiotensin converting enzyme inhibitory activity was 54%.

trypsin;egg white;enzymolysis;RSM

TS201.2+5

A

1002－0306(2011)04－0173－04

2010－02－04 *通訊聯(lián)系人

羅賢慧(1989－)，女，本科，研究方向:食品科學(xué)與工程。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)項(xiàng)目(2007AA10Z329);吉林大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃”。