超高效液相色譜一串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法測(cè)定苦蕎麥中黃酮類化合物

李 欣，王步軍

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部谷物品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)檢測(cè)中心，北京100081)

超高效液相色譜一串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法測(cè)定苦蕎麥中黃酮類化合物

李 欣，王步軍*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部谷物品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)檢測(cè)中心，北京100081)

建立苦蕎麥中蘆丁、槲皮素和山萘酚含量的超高效液相色譜－串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC－MS－MS)測(cè)定方法。試樣用甲醇超聲波提取，HSSC18超高效液相色譜柱、甲醇－水(0.1%甲酸)流動(dòng)相分離，以電噴霧離子源負(fù)離子檢測(cè)方式進(jìn)行質(zhì)譜分析，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)定量。結(jié)果表明，在0.1～100μg/mL范圍內(nèi)，蘆丁、槲皮素、山萘酚濃度與峰面積均有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.99。在低、中、高3個(gè)濃度添加水平下，三種物質(zhì)的回收率均在94%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.19～12.54范圍內(nèi)。蘆丁檢出限為0.01ng/mL，槲皮素、山萘酚檢出限為0.1ng/mL。

苦蕎麥，超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿質(zhì)譜，黃酮類化合物

苦蕎麥俗稱苦蕎，學(xué)名韃靼蕎麥(Tartarian Buckwheat)，屬雙子葉蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum esculentum)植物，在我國(guó)西南山區(qū)如重慶、四川有廣泛種植［1］?？嗍w麥具有十分豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其中的蛋白質(zhì)、脂肪含量均高于小麥粉和大米;VB2含量高于大米、小麥粉2～10倍;鉀、鎂、鐵明顯高于大米、小麥粉;蘆丁(VP)和葉綠素更是谷類作物所沒(méi)有的。與甜蕎相比，苦蕎麥蛋白質(zhì)高1.7倍，脂肪含量高1.6倍，VB2含量高1.7倍，VP含量高12～14倍［2］。苦蕎麥所含營(yíng)養(yǎng)成分當(dāng)中，特別值得注意的是它所含有的其它禾谷類糧食中所沒(méi)有的生物類黃酮物質(zhì)。黃酮類化合物是一組存在于植物中的天然產(chǎn)物，屬于植物次級(jí)代謝產(chǎn)物［3－4］，研究表明這些活性成分有防治心腦血管疾病、降低血脂、防治糖尿病等多種療效［5－6］。本研究應(yīng)用UPLC－MS－MS聯(lián)用技術(shù)研究了苦蕎麥中的黃酮類成分提取、分離和分析方法，目的是建立苦蕎麥中蘆丁、槲皮素和山萘酚的測(cè)定方法，為深入研究苦蕎麥營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎麥皮粉 購(gòu)自西昌航飛苦蕎麥開(kāi)發(fā)中心;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;槲皮素和山萘酚標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)于北京益利生物制品有限公司，甲醇(色譜純) 美國(guó)Fisher公司;甲酸 分析純;水 超純水。

ACQUITY Ultra Performance LC－Xevo TQ MS質(zhì)譜儀 美國(guó)Waters公司，配有ESI源，Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);超聲波清洗器(昆山KQ－300DE) 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備 稱取蘆丁對(duì)照品10mg(精確到0.0001g)，置于50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(每1mL中含蘆丁0.2mg);稱 取 槲 皮 素 標(biāo) 準(zhǔn) 品 2.5mg(精 確 到0.00001g)，溶于100mL甲醇，即得槲皮素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(每1mL中含槲皮素25μg);稱取山萘酚標(biāo)準(zhǔn)品0.5mg(精確到0.00001g)，溶于50mL甲醇，即得山萘酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(每1mL中含山萘酚0.01mg)。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 用甲醇:0.1%甲酸水(90∶10)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.1.3 苦蕎麥黃酮提取液的制備 稱取苦蕎麥粉1.0g(精確到0.001g)于50mL三角瓶中，加入30mL 80%甲醇，60℃進(jìn)行超聲提取30min，趁熱減壓抽濾，定容，取1mL濾液，用微孔濾膜(0.2μm)過(guò)濾。

由于樣品中蘆丁、槲皮素、山萘酚含量不同，測(cè)定時(shí)將黃酮提取液分別稀釋為10000、100、10倍，用于測(cè)定蘆丁、槲皮素和山萘酚。

1.2.2 分析條件

1.2.2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱(2.1×50mm，粒徑1.8μm);流動(dòng)相甲醇(A)－水(0.1%甲酸)(B)梯度洗脫(見(jiàn)表1);柱溫35℃;流速0.6mL/min;樣品進(jìn)樣量10μL。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2.2 質(zhì)譜條件 儀器采用負(fù)離子接口模式，毛細(xì)管電壓2.0kV;離子源溫度150℃;錐孔反吹氣流量30L/h;脫溶劑氣溫度500℃;脫溶劑氣流量1000L/h。應(yīng)用Xevo TQ的IntelliStart技術(shù)建立相應(yīng)的質(zhì)譜方法(MRM)，分別進(jìn)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品選擇最優(yōu)條件。母離子和子離子的質(zhì)量數(shù)和碰撞能量參數(shù)詳見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)量條件參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件的選擇

應(yīng)用ACQUITY UPLC HSS C18柱，以甲醇－0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，流速0.60mL/min，每一次進(jìn)樣的分析時(shí)間為3.0min，蘆丁、槲皮素、山萘酚出峰時(shí)間分別為1.19、1.68、1.83min。

蘆丁 (C15H30O16)分子量為 610.52，槲皮素(C15H10O7)分子量為302.24，山萘酚(C15H10O6)分子量為286.24，其在ESI負(fù)離子模式下均具有較強(qiáng)的離子化效率，m/z 609.06、m/z 301.95、m/z 285.02分別是其準(zhǔn)分子離子峰［M－H］－。對(duì)其進(jìn)行子離子掃描得到碎片離子峰，分別選擇豐度較高的兩個(gè)特征離子m/z 300.15和271、m/z 150.91和178.98、m/z 187.45和92.85，對(duì)0.5ng/mL蘆丁、槲皮素、山萘酚進(jìn)行同時(shí)定性定量檢測(cè)，其總離子流和定量離子流MRM圖見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁、槲皮素、山萘酚的MRM圖

2.2 方法的線性關(guān)系考察

將配制好的蘆丁、槲皮素、山萘酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋為0.1、1、10、50、100μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣10μL，以峰面積y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，回歸方程分別為 Y=867.136X+57.0508，Y=132.72X+104.713，Y=1737.43X+11043.5。結(jié)果表明，在0.1～100μg/mL范圍內(nèi)，三種標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999、0.999、0.990，線形關(guān)系如圖2～圖4。

圖2 蘆丁線性關(guān)系圖

圖3 槲皮素線性關(guān)系圖

圖4 山萘酚線性關(guān)系圖

2.3 方法的檢測(cè)限

實(shí)驗(yàn)確定蘆丁檢測(cè)限為 0.01ng/mL(S/N=25.90)，槲皮素檢測(cè)限為0.1ng/mL(S/N=22.49)，山萘酚檢測(cè)限為0.1ng/mL(S/N=61.30)。

2.4 方法的精密度

對(duì)同一黃酮提取液分別進(jìn)行6次進(jìn)樣測(cè)定，其結(jié)果如表3所示。

表3 方法的精密度測(cè)定結(jié)果

從表3中可以看出，該方法的精密度很好。

2.5 方法的重復(fù)性

對(duì)苦蕎麥樣品按照1.2.1.3方法制備黃酮提取液5份，分別進(jìn)樣測(cè)定蘆丁、槲皮素和山萘酚含量，結(jié)果如表4。

表4 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

表中結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性較好。

2.6 回收率

以苦蕎麥樣品作為基質(zhì)，分別對(duì)蘆丁、槲皮素、山萘酚進(jìn)行低、中、高三個(gè)水平添加回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定5次，各添加回收水平、平均回收率與精密度見(jiàn)表5。

表5 添加回收率結(jié)果(n=5)

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)11個(gè)苦蕎麥品種進(jìn)行蘆丁、槲皮素、山萘酚含量的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 樣品中蘆丁、槲皮素、山萘酚含量測(cè)定結(jié)果

環(huán)境因素對(duì)苦蕎生物黃酮類物質(zhì)含量有著十分重要的影響，這些環(huán)境因素主要包括海拔、光照、土壤、氣候等，是形成不同品種苦蕎生物類黃酮物質(zhì)含量差異的重要因素［7－8］。測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的高效液相色譜測(cè)定的數(shù)值較接近，表明超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜方法能用來(lái)對(duì)苦蕎麥中的蘆丁、槲皮素、山萘酚進(jìn)行含量測(cè)定。相對(duì)于HPLC法，具有更短的分析時(shí)間和更高的檢測(cè)靈敏度。

3 結(jié)論

超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定苦蕎麥中蘆丁、槲皮素和山萘酚含量，具有前處理方法簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、回收率穩(wěn)定的特點(diǎn)，且電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的MRM掃描方式抗干擾強(qiáng)，使方法的靈敏度更高，選擇性強(qiáng)，適用于同時(shí)進(jìn)行定性定量快速測(cè)定苦蕎麥中蘆丁、槲皮素、山萘酚的含量。

［1］唐宇，王安虎.苦蕎的成分功能研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，19(4):355－358.

［2］張振福，羅文森.苦蕎麥的化學(xué)成分與特殊功能［J］.糧食與飼料工業(yè)，1998(2):40－41.

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［8］張瑞，楊楠，等.苦蕎核心種質(zhì)蘆丁含量測(cè)定及成因分析［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24(4):157－161.

Determination of flavonoids in tartary buckwheat by UPLC－MS－MS

LI Xin，WANG Bu－jun*
(Institute of Crop Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences/The Cereal Quality Supervision and Testing Center，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China)

The objective of this research was to establish a method for detecting Rutin，Quercetin and Kaempferol in tartary buckwheat by UPLC－MS－MS.Tartary buckwheat samples were extracted with methanol in a ultrasonic cleaner，and Rutin，Quercetin and Kaempferol were separated by a HSS C18UPLC column，with methanol－0.1%formic acid as mobile phase，electrospray ionization was applied and operated in the negative ion mode，then quantified with multiple reaction monitoring(MRM).Results:Good linearities were observed in the range from 0.1～100μg/mL，with correlation coefficients above 0.99.The mean recoveries of three levels were all above 94%and the relative standard derivations were between 2.19 and 12.54.The detection limit of Rutin，Quercetin and Kaempferol were 0.01，0.1，0.1ng/mL，respectively.

tartary buckwheat;UPLC－MS－MS;flavonoids

TS211.7

A

1002－0306(2011)04－0383－04

2010－03－30 *通訊聯(lián)系人

李欣(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測(cè)技術(shù)。