大果少沙棘果渣黃酮對(duì)HT29腫瘤細(xì)胞活性抑制及DNA損傷作用研究

焦 巖，常 影，王振宇

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006;2.齊齊哈爾大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006;3.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

大果少沙棘果渣黃酮對(duì)HT29腫瘤細(xì)胞活性抑制及DNA損傷作用研究

焦 巖1，2，常 影1，王振宇3，*

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006;2.齊齊哈爾大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006;3.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

目的:研究大果沙棘果渣黃酮(Seabuckthorn residue flavonoids，SRF)對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和DNA損傷的作用。方法:利用MTT比色法測(cè)定大果沙棘果渣黃酮對(duì)HT29結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率;用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(SCGE)觀察大果沙棘果渣黃酮對(duì)HT29細(xì)胞DNA的損傷情況。結(jié)果:大果沙棘果渣黃酮在濃度20～200mg/L時(shí)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞有明顯的抑制作用，作用72h最大抑制率為81.28%;單細(xì)胞凝膠電泳顯示大果沙棘果渣黃酮作用細(xì)胞48h后可見明顯的彗星狀拖尾。結(jié)論:大果沙棘果渣黃酮可抑制HT29細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)其DNA有致?lián)p效應(yīng)。

大果沙棘果渣，黃酮，HT29腫瘤細(xì)胞，DNA損傷

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)為胡頹子科(Elaeagnaceae)酸刺屬的灌木或小喬木，主要分布在歐亞大陸東經(jīng)2°～115°，北緯27°～68.5°的廣大地區(qū)，以前蘇聯(lián)、蒙古、中國(guó)分布最多［1］，我國(guó)主要分布在西北、華北、東北及西南等十多個(gè)省區(qū)，主要有中國(guó)沙棘亞種(通常稱為中國(guó)沙棘)，還有少量的柳葉沙棘、西藏沙棘、云南沙棘、中亞沙棘等亞種。大果沙棘是從沙棘栽培品種篩選培育出來的果［2］。沙棘中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，研究表明，沙棘黃酮具有清除自由基、抗衰老、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、抗疲勞、改善心腦血管等多項(xiàng)生理功能［3－5］。其中對(duì)大果沙棘黃酮對(duì)HT29腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和DNA損傷的研究還未見報(bào)道。本文研究經(jīng)大孔樹脂純化后的大果沙棘果渣總黃酮對(duì)HT29腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和DNA損傷的作用，為沙棘黃酮抗腫瘤作用研究和保健食品及抗癌輔助藥品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大果沙棘果渣 黑龍江省孫吳縣林業(yè)局提供;大果沙棘總黃酮 首先用超臨界CO2萃取設(shè)備將大果沙棘果渣脫脂，然后用75%的乙醇做溶劑，將脫脂后的大果沙棘果渣粉以10∶1液固比進(jìn)行3次超聲波提取，將提取得到的黃酮液經(jīng)離心、過濾、濃縮、除去乙醇得到SRF溶液，將SRF溶液用X－5大孔樹脂層析柱進(jìn)行純化，純化后真空凍干得橙黃色固體粉末，最后用0.5%DMSO溶解，DMEM培養(yǎng)基配制成總黃酮含量分別為20～200mg/L濃度的SRF溶液，進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn);人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29 哈爾濱市腫瘤醫(yī)院;DMEM培養(yǎng)基、FBS胎牛血清 美國(guó)Hyclone公司;低熔點(diǎn)、正常熔點(diǎn)瓊脂糖、溴化乙錠 上海生工;Triton X－100、MTT sigma公司;其它生化試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

CO2培養(yǎng)箱 Thermo Forma公司;倒置顯微鏡、熒光顯微鏡 Nikon公司;酶標(biāo)儀 Biocell公司;100mL培養(yǎng)瓶 美國(guó)Promega公司;6孔培養(yǎng)板 德國(guó)Greiner;SW－CJ－IF超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;DYY－12型電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MTT比色法測(cè)定人結(jié)腸癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制率［6］將HT29腫瘤細(xì)胞以105個(gè)/mL濃度接種于96孔板，每孔100μL，24h后更換培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入20～100μg/mL濃度的SRF溶液，空白對(duì)照只加培養(yǎng)液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2、飽和濕度下分別培養(yǎng)24、48、72h，將培養(yǎng)后的96孔板每孔加入5g/L的MTT 10μL，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱孵育4h后，小心吸出上清，加入DMSO 150μL/孔，微量振蕩器振蕩5min后，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀讀取實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)620nm的吸光值(OD)，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

抑制率(%)=(對(duì)照組OD值－實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%

1.2.2 普通倒置顯微鏡觀察 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29腫瘤細(xì)胞以105個(gè)/mL濃度接種于6孔板，每孔1.0mL，24h后更換培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入50、100、200μg/mL濃度的SRF溶液，空白對(duì)照只加培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2、飽和濕度下分別培養(yǎng)48h，后于倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.3 單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)［6］

1.2.3.1 制片 取0.5%常溫熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，加熱熔化后，冷卻至45℃。取100μL滴于潔凈的載玻片上，立即蓋上蓋玻片，使瓊脂糖均勻地敷在載玻片上，置4℃下10min，待瓊脂糖冷卻變硬，為第一層。取下蓋玻片，分別取經(jīng)空白對(duì)照和經(jīng)SRF處理后的細(xì)胞104個(gè)，與75μL 0.5%的瓊脂糖溶液在37℃下混勻，迅速滴在第一層瓊脂糖上，加上蓋玻片，4℃、10min使瓊脂糖硬化。

1.2.3.2 電泳 取下蓋玻片，將玻片立即浸入預(yù)冷的裂 解 液 (2.5mol/L NaCl，100mmol/L Na2EDTA，10mmol/L Tris，1%Triton X－100及10%DMSO組成，臨用前配制，pH為10)中，4℃下放置2h。取出玻片，用蒸餾水洗兩次后，放置在水平電泳槽中，加入電泳液(1mmol/L Na2EDTA，300mmol/L NaOH)，液面高出玻片0.25cm，靜置20min，待DNA解螺旋后，以25V 200mA電泳30min。

1.2.3.3 中和與染色 電泳后取出玻片，置于pH7.5、0.4mol/L Tris溶液中洗滌 3次，每次 5min。再以25mg/mL的溴化乙錠(EB)75μL進(jìn)行染色，加上蓋玻片，盡快觀察結(jié)果。以上步驟均在暗室中進(jìn)行，以防止光線對(duì)DNA的損傷。1.2.3.4 結(jié)果觀察 觀察EB染色需用熒光顯微鏡，激發(fā)波長(zhǎng)510～560nm，濾過波長(zhǎng)690nm，以400倍拍攝單細(xì)胞影像。

拖尾細(xì)胞率:每張片子計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，記錄拖尾細(xì)胞數(shù)。

拖尾細(xì)胞率(%)=拖尾細(xì)胞數(shù)/100×100%

拖尾細(xì)胞尾長(zhǎng):CASP軟件測(cè)量拖尾細(xì)胞的總長(zhǎng)和頭長(zhǎng)。

拖尾細(xì)胞尾長(zhǎng)(μm)=總長(zhǎng)－頭長(zhǎng)

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。對(duì)每一濃度100個(gè)細(xì)胞DNA的遷移率進(jìn)行分析。彗星圖像由casp軟件分析細(xì)胞DNA拖尾率和尾長(zhǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRF對(duì)HT29腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用

由表1可見，經(jīng)20～200μg/mL SRF分別處理HT29腫瘤細(xì)胞后，隨著SRF濃度的升高，對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率逐漸增強(qiáng)。濃度為200μg/mL SRF處理72h后，抑制率最高可達(dá)81.28%，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系;在SRF作用細(xì)胞24、48、72h后，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，增殖抑制率逐步增高，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性抑制。

表1 SRF對(duì)HT29腫瘤細(xì)胞增值抑制作用

2.2 SRF對(duì)HT29腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響

HT29腫瘤細(xì)胞經(jīng)不同濃度的SRF作用48h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，由圖1(B、C、D)中可以看出，和對(duì)照組相比(圖1A)，細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，細(xì)胞間隙增加，細(xì)胞變圓、細(xì)胞縮小，細(xì)胞周圍有數(shù)個(gè)圓形小體(凋亡小體)圍繞，部分細(xì)胞從瓶壁脫落懸浮于培養(yǎng)液中，隨著提取物濃度增大和時(shí)間延長(zhǎng)，這種變化越來越明顯;而對(duì)照組(圖1A)中細(xì)胞呈梭形、多角形，生長(zhǎng)旺盛，貼壁良好。

2.3 SRF對(duì)HT29腫瘤細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果的影響

HT29腫瘤細(xì)胞經(jīng)50、100、200μg/mL SRF作用48h后，可見明顯的彗星狀拖尾，如圖2(F、G、H)，而對(duì)照組呈現(xiàn)明亮的圓點(diǎn)，幾乎看不到拖尾現(xiàn)象(圖2E)，說明SRF能夠損傷HT29細(xì)胞的DNA。從表2可以看出，和對(duì)照組比較，SRF組細(xì)胞的DNA損傷細(xì)胞率和細(xì)胞拖尾長(zhǎng)度隨著藥物濃度的升高而增大，且都具有極顯著差異(P＜0.01)。說明不同濃度的SRF對(duì)HT29腫瘤細(xì)胞DNA有不同程度的損傷，200μg/mL SRF損傷細(xì)胞最多，細(xì)胞拖尾長(zhǎng)度最長(zhǎng)。

圖1 不同濃度的SRF對(duì)HT29腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2 不同濃度SRF對(duì)HT29腫瘤細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果的影響

表2 單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)SRF對(duì)HT29腫瘤細(xì)胞的影響(±s，n=100)

表2 單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)SRF對(duì)HT29腫瘤細(xì)胞的影響(±s，n=100)

注:**:P＜0.01，*:P＜0.05，與對(duì)照組相比。

組別(μg/mL)DNA損傷細(xì)胞率(%)細(xì)胞拖尾長(zhǎng)度(μm)對(duì)照組8.24±1.45 6.2±1.6 50 48.64±4.82** 35.3±5.5**100 87.68±6.74** 63.5±8.2**200 96.41±9.81** 101.2±11.8**

3 討論

沙棘黃酮類化合物具有抗腫瘤功能國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)報(bào)道［7－9］。本研究首先考察了不同濃度大果沙棘果渣黃酮在不同時(shí)間內(nèi)對(duì)HT29腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，MTT法檢測(cè)到細(xì)胞的凋亡;同時(shí)，觀察到了細(xì)胞形態(tài)上的改變(圖1):細(xì)胞變圓、細(xì)胞縮小，細(xì)胞周圍有數(shù)個(gè)圓形小體等凋亡的現(xiàn)象，說明了不同濃度SRF對(duì)HT29腫瘤細(xì)胞具有抑制生長(zhǎng)和促進(jìn)凋亡作用。

單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(SCGE)又稱彗星實(shí)驗(yàn)(cometassay)，是近年來發(fā)展起來的一種檢測(cè)單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA斷裂的方法，具有所需樣品量少、快速、靈敏、簡(jiǎn)便、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，近年來廣泛用于檢測(cè)人和動(dòng)物各種細(xì)胞DNA損傷情況［10］，其原理是動(dòng)物細(xì)胞核DNA損傷的嚴(yán)重程度與尾部的長(zhǎng)度和熒光強(qiáng)度成正比。因此，測(cè)定DNA遷移部分的光密度或遷移長(zhǎng)度可定量單個(gè)細(xì)胞的損傷程度［11］。從圖2可以看出，未經(jīng)SRF處理的HT29細(xì)胞幾乎沒有或極少產(chǎn)生彗星狀拖尾，隨著藥物濃度的增加，出現(xiàn)彗尾的細(xì)胞數(shù)越來越多，細(xì)胞彗星狀拖尾變長(zhǎng)。說明了SRF可能是通過對(duì)腫瘤細(xì)胞的DNA損傷來抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和促使細(xì)胞凋亡的。

本研究應(yīng)用MTT法檢測(cè)到SRF對(duì)HT29細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，且呈明顯的量效關(guān)系;單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)到SRF作用于HT29細(xì)胞可引起細(xì)胞核DNA的損傷，這對(duì)SRF抗腫瘤作用和作用機(jī)制的研究有重要意義，但細(xì)胞凋亡機(jī)理和凋亡途徑尚不清楚，需進(jìn)一步深入研究。

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Inhibition and DNA damage of seabuckthorn residue flavonoids on colon HT29 cancer cells

JIAO Yan1，2，CHANG Ying1，WANG Zhen－yu3，*
(1.College of Food and Biological Engineering，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China;2.Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China;3.Forestry Department，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China)

Objective:To study the inhibition and DNA damage effects of seabuckthorn residue flavonoids(SRF)on colon HT29 cancer cells.Methods:The inhibition of SRF on human colon HT29 cancer cells was measured with MTT colorimetic method.The DNA damage of HT29 cell was studied in vitro by single cell gel electrophoresis(SCGE).Result:With SRF 20～200mg/L for 72h，the cell inhibition was significant，the optimized inhibition rate was 81.28%.SCGE showed comet－like tails.Conclusion:SRF can inhibit the growth of HT29 cancer cells and damage cells DNA.Key words:seabuckthorn residue;flavonoids;HT29 cancer cells;DNA damage

TS201.4

A

1002－0306(2011)04－0362－03

2009－12－25 *通訊聯(lián)系人

焦巖(1981－)，男，博士，研究方向:生物活性物質(zhì)與功能食品。

黑龍江省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(GB06B404－1)。