異硫氰酸芐酯對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌作用的研究

鄧 群，許曉曦，*，卓志國(guó)，滕國(guó)新

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)成人教育學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040;3.北京三元食品有限公司，北京100085)

DENG Qun1，XU Xiao－xi1，*，ZHUO Zhi－guo2，TENG Guo－xin3

(1.College of Food，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China;3.Beijing Sanyuan Food Co.，Ltd.，Beijing 100085，China)

異硫氰酸芐酯對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌作用的研究

鄧 群1，許曉曦1，*，卓志國(guó)2，滕國(guó)新3

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)成人教育學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040;3.北京三元食品有限公司，北京100085)

研究了異硫氰酸芐酯(BITC)對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)的抑菌作用。結(jié)果表明:BITC對(duì)供試菌的最小抑菌濃度(MIC值)為400μL/L;在不同pH(4～8)條件下，隨pH的降低，MIC值變小，抑菌作用增強(qiáng);在不同糖、鹽濃度(1%～5%)條件下，隨糖、鹽濃度的升高，MIC值變小，抑菌作用增強(qiáng);在透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，BITC破壞了菌體的莢膜和細(xì)胞壁。

異硫氰酸芐酯(BITC)，抑菌作用，MIC值，透射電鏡(TEM)

DENG Qun1，XU Xiao－xi1，*，ZHUO Zhi－guo2，TENG Guo－xin3

(1.College of Food，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China;3.Beijing Sanyuan Food Co.，Ltd.，Beijing 100085，China)

異硫氰酸酯是對(duì)一類具有N=C=S結(jié)構(gòu)的小分子化合物總稱，它是十字花科及其近緣植物白花菜科中大量存在的硫苷酶解產(chǎn)物［1］。異硫氰酸酯的抗菌活性早已得到證實(shí)，它對(duì)大腸埃希菌屬、沙門菌屬、金黃色葡萄球菌等都具有很強(qiáng)的殺菌力［2］。十世紀(jì)六七十年代，因異硫氰酸酯對(duì)細(xì)菌、真菌、寄生蟲等病原生物有抗性作用，科學(xué)家們對(duì)其進(jìn)行了大量研究。其中，異硫氰酸芐酯是抗性較強(qiáng)的一種［3］。產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)是人和動(dòng)物腸道中的正常菌群，亦是條件性致病菌，它是環(huán)境中最常出現(xiàn)的厭氧菌，也是梭狀芽孢桿菌中最常分離到的菌種［4］。Hagan等［5］指出，A型產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌存在于土壤，而B、C、D和E型更適應(yīng)于腸道環(huán)境，并且這些毒型常出現(xiàn)在塵埃、水、乳、蔬菜、新鮮肉、魚和昆蟲中。當(dāng)寄主內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生適宜于產(chǎn)氣莢膜梭菌大量增殖的條件時(shí)導(dǎo)致疾病，最常見的就是“猝死癥”［4］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定最低抑菌濃度(MIC值)，研究不同pH、鹽及糖濃度對(duì)抑菌作用的影響以及利用透射電鏡觀察細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)變化等方法，探討異硫氰酸芐酯(BITC)對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌作用，為開發(fā)新型的天然食品防腐劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)氣莢膜梭菌64609 黑龍江省疾病控制與預(yù)防中心;異硫氰酸酯(98%)、異硫氰酸烯丙酯(95%)

SIGMA;哥倫比亞培養(yǎng)基(用于活化供試菌)、厭氧菌增菌液(用于實(shí)驗(yàn)中供試菌的生長(zhǎng))、厭氧袋(用于供試菌培養(yǎng)) 北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司。

麥?zhǔn)媳葷醿x 上海精密儀表廠;H－7650型透射電鏡 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命中心提供;培養(yǎng)箱 Heal Froce。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 使用產(chǎn)氣莢膜梭菌保存菌株活化，挑取菌落接種于哥倫比亞培養(yǎng)基中，將接種后的培養(yǎng)皿放入附有厭氧袋的盒中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，傳代兩次。

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC值)的測(cè)定

1.2.2.1 菌液濃度的選擇 經(jīng)活化后的產(chǎn)氣莢膜梭菌，利用麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)菌液濃度至106cfu/mL待用。1.2.2.2 配藥 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，將AITC和BITC純品分別用無(wú)菌生理鹽水(加與異硫氰酸酯等體積的助溶劑 DMSO)稀釋成八個(gè)濃度梯度800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、0μL/L。

1.2.2.3 MIC值的測(cè)定 準(zhǔn)備兩組滅菌試管，每組9支，排成一排編號(hào)，用微量移液器向每個(gè)試管中加入1.8 mL的濃度為106cfu/mL的菌液。分別向兩組試管中加入0.2mL濃度為800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、0μL/L的AITC、BITC純品，用振蕩器快速混勻后，每只試管加硅膠塞并用封口膜封住管口，放到附有厭氧袋的盒中37℃厭氧培養(yǎng)24h。每組做三次平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

采用比濁法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定:增菌液清亮透明表示無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)(－)，增菌液渾濁表示有細(xì)菌生長(zhǎng)(+)，以能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的異硫氰酸酯純品的最高稀釋度作為最低抑菌濃度(MIC)。以生理鹽水作對(duì)照，通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較兩種異硫氰酸酯的抑菌活性。

1.2.3 不同pH對(duì)抑菌效果的影響

1.2.3.1 不同pH菌液的配制 取等體積無(wú)菌厭氧菌增菌液5份，分別調(diào)增菌液pH為4、5、6、7、8，將活化后的產(chǎn)氣莢膜梭菌盡可能多地接種到5個(gè)不同pH的增菌液中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，使菌種適應(yīng)不同的pH環(huán)境，然后用麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)菌液濃度至106cfu/mL，待用。

1.2.3.2 配藥 將BITC純品分別用無(wú)菌生理鹽水(加與異硫氰酸酯等體積的助溶劑DMSO)稀釋成八個(gè)濃度梯度800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、0μL/L。

1.2.3.3 測(cè)定不同pH條件下的MIC值 準(zhǔn)備5組滅菌試管，每組9支，排成一排編號(hào)，依次向各組試管中加入pH為4、5、6、7、8的濃度為106cfu/mL的菌液，每只試管1.8 mL。每組試管中分別加入0.2mL濃度為800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、0μL/L的BITC純品，用振蕩器快速混勻后，每只試管加硅膠塞并用封口膜封住管口，放到附有厭氧袋的盒中37℃厭氧培養(yǎng)24h。每組做三次平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，采用比濁法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。通過(guò)對(duì)pH條件下MIC值的測(cè)定，來(lái)觀察不同pH對(duì)抑菌效果的影響。1.2.4 不同鹽、糖濃度對(duì)抑菌效果的影響

1.2.4.1 不同鹽、糖濃度菌液的配制 取等體積無(wú)菌厭氧菌增菌液10份，分別配成含鹽、糖濃度各為1%、2%、3%、4%、5%的增菌培養(yǎng)液，將活化后的產(chǎn)氣莢膜梭菌盡可能多地接種到各鹽、糖不同濃度的增菌液中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，然后用麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)菌液濃度至0.5×108cfu/mL，再用無(wú)菌的厭氧菌增菌液將不同pH的菌液稀釋至106cfu/mL，待用。

1.2.4.2 配藥 同1.2.3。

1.2.4.3 測(cè)定不同鹽、糖濃度條件下的MIC值 準(zhǔn)備10組滅菌試管，每組9支，排成一排編號(hào)，依次向各組試管中加入鹽、糖濃度為1%、2%、3%、4%、5%的濃度為106cfu/mL的菌液，每只試管1.8mL。每組試管中分別加入0.2mL濃度為800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、0μL/L的BITC純品，用振蕩器快速混勻后，每只試管加硅膠塞并用封口膜封住管口，放到附有厭氧袋的盒中37℃厭氧培養(yǎng)24h。每組做三次平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。采用比濁法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，通過(guò)對(duì)不同鹽、糖濃度條件下MIC值的測(cè)定，來(lái)觀察不同鹽、糖濃度對(duì)抑菌效果的影響。

1.2.5 透射電鏡實(shí)驗(yàn) 根據(jù)MIC值實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將200μL/L的BITC處理過(guò)的產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌懸液滴到formvar被膜的銅網(wǎng)上，吸附1min洗干后，用2%磷鎢酸(pH6.7)負(fù)染色1min，H－7650型透射電鏡下觀察，Gatan832型CCD記錄圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 最低抑菌濃度(MIC值)的測(cè)定

最低抑菌濃度(MIC)被定義為一定條件下使微生物在培養(yǎng)介質(zhì)中不再生長(zhǎng)的抗菌劑的最低濃度。不同條件下的MIC值不同，本研究中MIC測(cè)定條件:菌液濃度約為106cfu/mL，培養(yǎng)周期24h。異硫氰酸芐酯(BITC)、異硫氰酸烯丙酯(AITC)對(duì)產(chǎn)氣夾膜梭菌的最低抑菌濃度(MIC值)由表1可知，為400、800μL/L，通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知，異硫氰酸芐酯(BITC)的抑菌活性要稍好于異硫氰酸烯丙酯(AITC)。這可能是由于BITC的分子量大于AITC，其揮發(fā)性比AITC較弱些，因此在溶液中更穩(wěn)定，抑菌效果更好。

表1 最低抑菌濃度(MIC值)

2.2 不同pH對(duì)抑菌效果的影響

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，pH對(duì)異硫氰酸芐酯(BITC)的抑菌作用有一定影響。由圖1可知，pH越小，其MIC值越小，抑菌效果越好。pH4、5時(shí)，其 MIC值為200μL/L，低于pH7時(shí)，而在pH8時(shí)其抑菌作用受到了影響，MIC值高于正常值。Tsao R.［6］研究發(fā)現(xiàn)AITC在酸性 pH條件下具有高穩(wěn)定性。而后Fernando B，Luciano等［7］研究發(fā)現(xiàn)AITC對(duì)大腸桿菌O157∶H7的抑制作用隨pH的降低而增強(qiáng)。這些研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較高的一致性，這可能與BITC、AITC同屬于異硫氰酸鹽類，它們的分子中都具有－N=C=S這一結(jié)構(gòu)有關(guān)，－N=C=S中的C有高度的親電性，能與親核試劑發(fā)生親電反應(yīng)［8］。Kawakishi，S.，Namiki等［9］研究證明AITC在水溶液中的降解作用是由于水分子與AITC發(fā)生了親核攻擊。這似乎也說(shuō)明了活躍的氫氧根負(fù)離子直接影響了AITC了降解作用，因?yàn)檫@些負(fù)電荷也可作為共用電子［10］。因此，在低pH條件下，異硫氰酸鹽類物質(zhì)的穩(wěn)定性更好，抑菌性能更強(qiáng)。

圖1 不同pH對(duì)抑菌效果的影響

2.3 不同鹽、糖濃度對(duì)抑菌效果的影響

為使食品具有良好的風(fēng)味，通常其中會(huì)添加鹽、糖等風(fēng)味物質(zhì)。研究表明，鹽、糖對(duì)BITC的抑菌作用產(chǎn)生了一定的影響。由圖2、圖3所示，鹽濃度在1%、2%時(shí)，BITC的抑菌作用不受影響;而鹽濃度在3%時(shí)，其MIC值有明顯的變化;在鹽濃度為5%時(shí)，其MIC值達(dá)到最低，僅為50μL/L。另外，蔗糖濃度的變化對(duì)BITC抑菌作用的影響也較為明顯，隨蔗糖濃度的增大，其MIC值逐漸減小，蔗糖濃度為4%、5%時(shí)，其MIC值最低，僅為50μL/L。

隨著鹽、糖濃度的增加，BITC的抑菌作用受到影響，這可能與鹽、糖本身也可以作為食品防腐劑有關(guān)［7］。另外，從圖3中可以看出，當(dāng)鹽的濃度較低時(shí)，MIC值無(wú)變化。這可能與產(chǎn)氣夾膜梭菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)，產(chǎn)氣夾膜梭菌細(xì)胞壁的外面包裹著一層莢膜，使其結(jié)構(gòu)變得極為致密，即使在高滲透壓存在的情況下，部分菌體細(xì)胞內(nèi)的水分也不能滲出。

圖2 不同糖濃度對(duì)抑菌效果的影響

圖3 不同鹽濃度對(duì)抑菌效果的影響

2.4 透射電鏡觀察菌體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

透射電鏡是一種高分辨率、高放大倍數(shù)的顯微鏡，能提供極微細(xì)材料的組織結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分等方面的信息。近年來(lái)，透射電鏡在天然抑菌劑抑菌作用研究方面應(yīng)用比較廣泛，耿曉玲、李巍偉、石珊珊等［11－13］將透射電鏡應(yīng)用在對(duì)白藜蘆醇、楊梅果實(shí)提取物、大豆異黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌等的抑制作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其通過(guò)電鏡圖片直觀清晰地觀察到了抑菌劑對(duì)菌體結(jié)構(gòu)作用變化的效果。

本實(shí)驗(yàn)采用負(fù)染色法通過(guò)透射電鏡對(duì)產(chǎn)氣夾膜梭菌的超微結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行觀察。在未加BITC的對(duì)照組中，如圖4A顯示，菌體結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞壁邊緣整齊，仔細(xì)觀察能清楚得看到細(xì)胞壁周圍裹著的一層莢膜。與BITC作用后，可以從透射電鏡負(fù)染色照片中看到產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌體周圍包裹著一層片狀晶體物質(zhì)，可能是BITC附著在菌體上(圖4B、C、D)與其莢膜或是細(xì)胞壁上的化學(xué)物質(zhì)發(fā)生作用。而在圖4E、F中，有些菌體細(xì)胞壁已經(jīng)不完整，細(xì)胞內(nèi)溶物滲出。

圖4 透射電鏡照片

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)異硫氰酸芐酯(BITC)與異硫氰酸烯丙酯(AITC)的抑菌實(shí)驗(yàn)比較，可以看出:

3.1 異硫氰酸芐酯(BITC)對(duì)產(chǎn)氣夾膜梭菌的抑菌活性更顯著，其最低抑菌濃度為400μL/L。

3.2 在不同pH條件下，BITC的抑菌作用隨pH的下降，抑菌作用隨之增強(qiáng)，pH4時(shí)MIC值為200μL/L;在不同鹽、糖濃度條件下，BITC的抑菌作用隨鹽、糖濃度的增加，其抑菌作用增強(qiáng)，鹽、糖濃度為5%時(shí)，MIC值均為50μL/L。

3.3 通過(guò)透射電鏡負(fù)染色照片中觀察到，與BITC作用后，菌體細(xì)胞壁受到破壞，部分菌體細(xì)胞內(nèi)溶物滲出。

隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們對(duì)防腐劑之類的食品添加劑在安全性上提出更高的要求。異硫氰酸酯因其為十字花科植物中的天然成分，成為國(guó)內(nèi)外開拓食品防腐新領(lǐng)域的研發(fā)熱點(diǎn)，D.Nadarajah、Pedro A.Chacon、李學(xué)紅等［14－16］研究了異硫氰酸烯丙酯對(duì)冷藏牛肉中大腸桿菌的抑菌作用及在肉制品保藏中的應(yīng)用方式，發(fā)現(xiàn)其明顯延長(zhǎng)了肉品的保鮮期。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BITC對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌有明顯的抑制作用，這為開發(fā)新型天然食品防腐劑提供了理論依據(jù)。

［1］甘永祥，陳文，等.異硫氰酸酯研究概況［J］.農(nóng)墾醫(yī)學(xué)，2009(6):261－263.

［2］Fahey，Jed W MS，et al.Dietary Physiochemical Delivery;Glucosino－lates/Isothiocyanates［J］.Nutrition Today，2002，37(5):214－217.

［3］孫世春，趙錫光，孫建華，等.異硫氰酸芐酯(BITC)防污損效果研究－對(duì)3種海洋細(xì)菌的抑菌作用［J］.海洋科學(xué)，1999(2):49－52.

［4］柴同杰，馬瑞華，等.產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌病的流行與致病機(jī)制［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，23(1):70－72.

［5］Hagan W A.Hagan and Bruner’s microbiology and infectious disease of domestic animals［M］.Bruner，1988(8):112－113.

［6］Tsao R，Yu Q，F(xiàn)riesen I，et al.Factors affecting the dissolution and degradation of oriental mustard－derived sinigrin and allyl isothiocyanate in aqueous media［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，2000，48:1898－1902.

［7］Fernando B，Luciano，Richard A.Holley Enzymatic inhibition by allyl isothiocyanate and factors affecting its antimicrobial action against Escherichia coli O157∶H7［J］.International Journal of Food Microbiology，2009，131:240－245.

［8］MARSH R E，WASER J.Refinement of the Crystal Structure of Sinigr in［J］.Acta Crystallow Graphica Section B，1970，2(6):1030－1037.

［9］Kawakishi S，Namiki M.Decomposition of allyl isothiocyanate in aqueous solution［J］.Agricultural and Biological Chemistry，1969，33:452－459.

［10］Ohta Y，Takatani K，Kawakishi S.Decomposition rate of allyl isothiocyanate in aqueous solution［J］.Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，1995，59:102－103.

［11］耿曉玲.楊梅果實(shí)提取物的抑菌作用研究［D］.江南大學(xué)，2007.

［12］李巍偉.白藜蘆醇抑菌作用及其機(jī)制研究［D］.河北醫(yī)科大學(xué)，2008.

［13］石珊珊.大豆異黃酮抑菌活性的研究及抑菌機(jī)制的初步探討［D］.遼寧師范大學(xué)，2003.

［14］D Nadarajah，J H Han.Inactivation of Escherichia coli O157∶H7 in packaged ground beef by allyl isothiocyanate［J］.International Journal of Food Microbiology，2005，99:269－279.

［15］Pedro A Chacon，Roberto A Buffo.Inhibitory effects of microencapsulated allyl isothiocyanate(AIT)against Escherichia coli O157∶H7 in refrigerated，nitrogen packed，finely chopped beef［J］.International Journal of Food Microbiology，2006，107:231－237.

［16］李學(xué)紅，金征宇.異硫氰酸烯丙酯及其包合物在冷卻牛肉片保藏中的應(yīng)用［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2007，23(7):253－256.

Study on antimicrobial action of benzyl isothiocyanate against Clostridium perfringens

The antimicrobial action of benzyl isothiocyanate(BITC)against Clostridium perfringens were studied.The results showed that the minimum inhibitory concentration(MIC value)of BITC against the tested strains was 400μL/L.The MIC values became smaller with pH values lower at different pH values(4～8)conditions，while the antimicrobial action was enhanced.The MIC values were smaller with the sugar，salt concentration higher under different sugars，salt(1%～5%)conditions，while the antimicrobial action was enhanced as well.Transmission electron microscope(TEM)photos showed that BITC destroyed the capsule and the cell wall of bacteria.

benzyl isothiocyanate;antimicrobial action;MIC value;transmission electron microscope(TEM)

TS201.2

A

1002－0306(2011)04－0125－04

2010－04－06 *通訊聯(lián)系人

鄧群(1982－)，女，碩士研究生，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。

北京市優(yōu)秀人才資助計(jì)劃(20071D0108100034);北京市科委科技新星計(jì)劃(2006B29);北京科委專項(xiàng)資助(Z0706002)。