大豆肽一木糖美拉德反應(yīng)體系中肽的降解與交聯(lián)規(guī)律研究

劉 平，張曉鳴

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122)

大豆肽一木糖美拉德反應(yīng)體系中肽的降解與交聯(lián)規(guī)律研究

劉 平，張曉鳴*

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122)

通過研究大豆肽－木糖美拉德反應(yīng)體系中不同的肽段隨時間的變化，探討大豆肽在美拉德反應(yīng)中的降解與交聯(lián)規(guī)律，以指導(dǎo)美拉德肽的有效制備。結(jié)果表明，在美拉德反應(yīng)中，還原糖對肽的降解和交聯(lián)起促進作用，當(dāng)反應(yīng)時間超過1.0h時，游離氨基酸含量升高，糖促進肽的降解作用突出。隨著反應(yīng)時間的延長，>5000Da和＜1000Da的肽段降解程度逐漸增加，當(dāng)時間超過2.0h時，>5000Da肽段含量增加，糖肽交聯(lián)作用明顯，而1000～5000Da肽段在反應(yīng)達1.0h時增加3.86%，隨后緩慢降低。

大豆肽，美拉德反應(yīng)，降解，交聯(lián)

肽類是純天然食品配料，廣泛存在于食品及蛋白水解物中，本身是一種重要的風(fēng)味增強劑，同時也是美拉德反應(yīng)的前體物，經(jīng)過熱處理如美拉德反應(yīng)之后能為食品帶來不同的風(fēng)味特征或增強其風(fēng)味。肽在美拉德反應(yīng)過程中存在兩種轉(zhuǎn)化方式［1－2］:一種是通過熱降解反應(yīng)生成小肽和游離氨基酸，第二種是直接通過肽糖交聯(lián)發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)。在美拉德反應(yīng)中，由肽的缺失引起的感官不足不能通過簡單地添加氨基酸混合物來彌補。由于肽結(jié)構(gòu)及 Maillard反應(yīng)本身的復(fù)雜性，關(guān)于肽在Maillard反應(yīng)中的研究主要集中于小肽的簡單模擬體系，研究不同的小肽在美拉德反應(yīng)中的變化規(guī)律及小肽或其氨基酸序列對揮發(fā)性風(fēng)味成分的貢獻［3－5］，而對蛋白水解物中肽混合體系的研究較少。大豆肽具有良好的乳化性、溶解性，以及許多獨特的生理活性和較高的營養(yǎng)價值，同時也是良好的風(fēng)味劑和風(fēng)味增強劑的前體物，已被廣泛應(yīng)用于食品加工中。日本協(xié)和發(fā)酵公司研究發(fā)現(xiàn)［6］，由 1000～5000Da的大豆肽制備的1000～5000Da美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(美拉德肽)具有良好的風(fēng)味增強效果，如增加鮮湯溶液的鮮味、醇厚味和持續(xù)性。同時該公司也發(fā)現(xiàn)［7］日本豆醬中提供呈味成分的核心物質(zhì)也是美拉德肽。本文通過分析大豆肽在美拉德反應(yīng)中氨基酸和不同分子量肽組分含量隨時間的變化趨勢，探討大豆肽在美拉德反應(yīng)中的降解與交聯(lián)規(guī)律，為深入研究大豆肽參與美拉德反應(yīng)的機制和美拉德肽的有效制備提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大豆肽 本實驗自制;木糖 中國惠興生化試劑有限公司;其它試劑 均為分析純。

高溫油浴設(shè)備 DF－101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器;酸度計 Mettler Toledo上海有限公司;UNICO UV－1600型可見－紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

表1大豆肽的分子量分布和氨基酸含量

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆肽的美拉德反應(yīng)和熱降解反應(yīng) 將大豆肽溶解配制成10%的肽溶液，初始pH6.5，按肽糖質(zhì)量比6.25∶1的比例加入木糖，在120℃條件下反應(yīng)0～3.0h，反應(yīng)結(jié)束后立刻用冰水冷卻終止反應(yīng)，并置于－18℃貯存，此為大豆肽的美拉德反應(yīng)。在同樣條件下制備大豆肽的熱降解反應(yīng)產(chǎn)物(不添加木糖)。1.2.2 褐變強度(A420)的測定 反應(yīng)液稀釋50倍后于420nm下測定吸光值，重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。1.2.3 游離氨基酸的測定 采用高效液相色譜法。分析條件:安捷倫液相色譜儀1100，ODS HYPERSIL 250×4.6mm，柱溫 40℃，檢測波長 338nm，流速1.0mL/min。

1.2.4 總氨基酸的測定 色譜檢測條件同1.2.3。

肽段氨基酸含量=大豆肽總氨基酸含量×該肽段在大豆肽中占的百分含量

肽段的降解率(%)=(反應(yīng)前肽段氨基酸含量－反應(yīng)后肽段氨基酸含量)/反應(yīng)前肽段氨基酸含量×100%1.2.5 肽分子量分布的測定 采用凝膠滲透色譜法。分析條件:Waters 600高效液相色譜儀(配2487紫外檢測器和Empower工作站)，TSKgel 2000 SWXL 300mm×7.8mm色譜柱，柱溫 30℃，檢測波長 220nm;流速0.5mL/min。分子量標準曲線按以下標準得到:細胞色素C(12，5000Da)、抑 蛋 白 酶 肽(6500Da)、桿 菌 肽(1450Da)、四肽GGYR(451Da)和三肽GGG(189Da)。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆肽的分子量分布和氨基酸含量分析

反應(yīng)前體系中大豆肽的分子量分布和氨基酸含量如表1所示。

由表 1可知，大豆肽中總氨基酸含量高達857.46mg/g，游離氨基酸含量僅占總氨基酸含量的4.02%，表明大豆肽主要由肽和少量游離氨基酸組成。肽中以小肽的比例居多，其中＜1000Da的肽段占78.36%，1000～5000Da的肽段占19.02%，而 >5000Da的肽段比例最低，僅占2.62%。

2.2 pH與褐變強度(A420)的變化

pH下降的程度可看成是衡量美拉德反應(yīng)劇烈程度的一個指標。褐變強度是衡量美拉德反應(yīng)進展最簡單的方法，因為它提供了一個可視化的測量手段，通常用來表征食品中美拉德反應(yīng)進行的程度。肽熱降解反應(yīng)和美拉德反應(yīng)過程中pH和A420的變化如圖1所示。

由圖1可知，隨著反應(yīng)時間的延長，熱降解反應(yīng)過程pH稍有降低，可能是熱降解反應(yīng)過程產(chǎn)生游離氨基酸引起的。美拉德反應(yīng)中，前1.0h反應(yīng)體系的pH明顯下降，隨后下降幅度變緩，這與Kim等［8］的報道一致。隨著加熱反應(yīng)的開始，糖促進了肽的降解，反應(yīng)產(chǎn)生了甲酸和乙酸等有機酸使得pH大幅度下降［9］。隨著反應(yīng)時間的延長，反應(yīng)產(chǎn)生了較多具有緩沖能力的甲酸、乙酸、甲基乙二醛和乙二醛等，能夠抑制美拉德反應(yīng)而使體系pH下降減緩?？偟膩碚f，由于氨基基團的消耗和產(chǎn)生酸性物質(zhì)，整個反應(yīng)體系pH降低［10］。

熱降解反應(yīng)過程中，A420增加不明顯，表明褐變反應(yīng)強度較低;而美拉德反應(yīng)中，隨熱反應(yīng)時間的延長，A420顯著增加，表明褐變程度加深，2.0h時的反應(yīng)產(chǎn)物顏色已接近紅褐色，繼續(xù)延長反應(yīng)時間，色澤的變化從肉眼上看已無法分辨，但吸光度仍逐漸增加，表明褐變程度隨時間的延長而逐漸增加。Benjakul等［11］發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)過程中形成的有紫外吸收的無色中間產(chǎn)物有助于棕色色素的形成。

圖1 不同時間下反應(yīng)產(chǎn)物中pH及A420的變化

2.3 游離氨基酸含量的變化

由圖2可以看出，在不加糖直接加熱的熱降解反應(yīng)中，隨著時間的延長，游離氨基酸含量逐漸增加，表明肽在高溫下發(fā)生熱降解，即由大分子肽降解成小分子肽或游離氨基酸。在加糖的情況下，隨著反應(yīng)時間的延長，游離氨基酸含量呈線性下降，到1.0h時下降幅度最大達12.93%，表明在這一階段主要是游離氨基酸參與美拉德反應(yīng)，使游離氨基酸含量降低。反應(yīng)時間超過1.0h后，游離氨基酸含量隨反應(yīng)時間的變化逐漸增加，這可能是由于還原糖的存在改變了反應(yīng)的平衡或者改變了肽的結(jié)構(gòu)，從而改變其反應(yīng)活性，有助于肽在高溫下降解生成了氨基酸，且在此時間下肽降解作用生成的游離氨基酸大于美拉德反應(yīng)消耗的游離氨基酸［1］。同時隨著溶液中pH的下降，美拉德反應(yīng)可能受到一定的抑制，導(dǎo)致了游離氨基酸的含量有所增加。

2.4 肽分子量分布的變化

2.4.1 ＜1000Da肽段含量的變化 圖3表明，隨著反應(yīng)時間的增加，在熱降解體系中＜1000Da肽段發(fā)生降解，含量明顯降低，當(dāng)時間達到1.0h后，變化趨勢不明顯，這可能是這一過程中大分子的肽降解生成小肽的量和小肽的降解量幾乎相當(dāng)，表觀上表現(xiàn)為小肽的含量不再發(fā)生變化，掩蓋了小肽熱降解現(xiàn)象。在美拉德反應(yīng)中，該組分的含量隨時間的延長明顯下降，反應(yīng)3.0h后其含量下降到45.36mg/mL，減少了27.56%，說明小肽在美拉德反應(yīng)中具有較高的反應(yīng)活性，這與趙謀明等［12］的報道一致。

圖2 不同時間下反應(yīng)產(chǎn)物中總游離氨基酸的變化

圖3 不同反應(yīng)時間下＜1000Da肽段含量的變化

2.4.2 1000～5000Da肽段含量的變化 由圖4可知，隨時間的延長，熱降解反應(yīng)中1000～5000Da肽段含量逐漸降低，在2.0h時，該肽段含量達12.19mg/mL，即降解了22.03%。而在美拉德反應(yīng)中，該肽段的含量逐漸增加，達到1.0h時，其含量從初始值15.20mg/mL增加到15.78mg/mL，增幅達3.86%，表明此階段以小肽與糖的交聯(lián)過程占主要地位，這與此階段反應(yīng)體系中游離氨基酸和小肽含量趨勢相一致;隨后該肽段含量又緩慢降低，達2.5h后的含量幾乎不變化，表明此階段反應(yīng)前期該肽段的降解過程起主要作用，隨后小肽與糖交聯(lián)產(chǎn)生美拉德肽的速度與較大分子量肽段的熱降解形成美拉德肽的速度基本相平衡。

圖4 不同反應(yīng)時間下1000～5000Da肽段含量的變化

2.4.3 >5000Da肽段含量的變化 由圖5可知，在熱降解反應(yīng)中，隨著時間的延長，大于5000Da肽段的含量逐漸降低，當(dāng)反應(yīng)時間超過2.0h后，降解速率減慢，整個反應(yīng)過程中該肽段減少了約60%。在美拉德反應(yīng)的過程中，該組分含量顯著降低，到達2.0h時下降最低點，此時該肽段降解了50.32%，表明此階段反應(yīng)以大分子物質(zhì)的降解為主。隨著反應(yīng)時間的延長，超過2.0h時該組分的含量又逐漸增加，表明此階段小肽與糖的交聯(lián)占主導(dǎo)地位。

總之，大豆肽中不同分子量的肽段在熱反應(yīng)中的降解程度不同。大豆肽熱降解反應(yīng)后，大分子量肽段較小分子量肽段降解程度大，說明熱反應(yīng)中肽的熱降解程度與肽分子量大小存在一定的相關(guān)性。在加糖的美拉德反應(yīng)中，還原糖促進了大豆肽的降解與交聯(lián)，不同分子量的肽段參與美拉德反應(yīng)的活性不同?？傮w上，>5000Da和＜1000Da的肽段在美拉德反應(yīng)中均具有較高的反應(yīng)程度，1000～5000Da肽段的反應(yīng)程度較低。許多研究表明，不同分子量肽段參與美拉德反應(yīng)的活性與很多因素有關(guān)。Lu等［13］報道葡萄糖－甘氨酸/二甘肽/三甘肽的美拉德反應(yīng)體系中，二甘肽的肽鍵水解程度較低，導(dǎo)致其在美拉德反應(yīng)中具有較低的反應(yīng)活性。Oh等［14］發(fā)現(xiàn)肽段直接參與美拉德反應(yīng)的反應(yīng)位點在肽鏈末端，末端氨基酸反應(yīng)活性程度影響肽段的反應(yīng)活性。另外對含有賴氨酸的二肽美拉德反應(yīng)進行研究發(fā)現(xiàn)［5］，鄰位氨基酸的性質(zhì)直接影響肽鏈中賴氨酸糖基化的活性，鄰位為亮氨酸、異亮氨酸與苯丙氨酸等疏水性氨基酸時，賴氨酸的反應(yīng)活性大大增強。總之，肽在美拉德反應(yīng)中的活性不僅與肽鍵穩(wěn)定性、氨基酸的組成及結(jié)構(gòu)有關(guān)，還與肽鏈長度(即分子量大小)及肽段含量有關(guān)。

圖5 不同反應(yīng)時間下>5000Da肽段含量的變化

本研究還發(fā)現(xiàn)，大豆肽中1000～5000Da的肽段在美拉德反應(yīng)前期，隨時間的增加其含量雖有增加但增幅較小，隨后又緩慢降低，這一變化趨勢與Lan等［1］的報道不盡一致，這可能與底物肽中各肽段的組成及含量的高低有關(guān)。本實驗中所用的大豆肽中1000～5000Da的肽段百分含量較高(為19.02%)，在一系列反應(yīng)時間下含量先增加后降低，增幅最大達僅3.86%，反應(yīng)中交聯(lián)和降解過程相互轉(zhuǎn)化，而Lan等研究中所用的原料中該組分所含的百分含量為9.76%，增幅最大可達58.73%，反應(yīng)過程主要以糖肽交聯(lián)為主。經(jīng)實驗研究和初步分析發(fā)現(xiàn)，大豆肽中1000～5000Da肽段含量的高低決定了糖肽交聯(lián)過程或肽的降解過程二者在美拉德反應(yīng)中的主導(dǎo)地位。若此肽段含量過高，產(chǎn)物中該肽段降解程度較高，若含量低于一定的值，則以交聯(lián)為主。因此，在制備美拉德肽的過程中，正確調(diào)控1000～5000Da的肽組分的含量可能更利于美拉德肽的有效制備。

3 結(jié)論

隨著反應(yīng)時間的延長，大豆肽在美拉德反應(yīng)中反應(yīng)程度加劇，糖促進了肽在美拉德反應(yīng)中的交聯(lián)與降解，其中>5000Da和＜1000Da肽段在美拉德反應(yīng)中均具有較高的反應(yīng)活性，1000～5000Da肽段的反應(yīng)活性較低。肽段的降解過程及交聯(lián)過程的主導(dǎo)作用隨著反應(yīng)時間的延長而不斷轉(zhuǎn)化。因此，可通過控制美拉德反應(yīng)條件及氨基底物肽中1000～5000Da的肽組分的含量以指導(dǎo)具有風(fēng)味增強活性的美拉德肽的有效制備。

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Study on the degradation and cross－linking of soy peptides in Maillard reaction with xylose

LIU Ping，ZHANG Xiao－ming*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The degradation and cross－linking of soy peptides were studied by analyzing the changes of the different molecular weight peptides in Maillard reaction derived from soy peptides－xylose system.The results showed that xylose played a catalytic role on the degradation and cross－linking of soy peptides in Maillard reaction.The content of free amino acids increased after the reaction time reached 1.0h，indicating that the catalytic role was marked.With the increasing of reaction time，the degradation of the peptides above 5000Da and below 1000Da increased，while the cross－linking effect of peptides was obvious when the time was more than 2.0h.The content of the peptides between 1000Da and 5000Da increased to 3.86%when the reaction time reached 1.0h and then slightly decreased.

soy peptides;Maillard reaction;degradation;cross－linking

TS201.21

A

1002－0306(2011)04－0091－04+

2011－01－13 *通訊聯(lián)系人

劉平(1979－)，女，博士研究生，研究方向:食品風(fēng)味化學(xué)。

國家自然科學(xué)基金(31071602)。