枳實、枳殼中辛弗林含量比較分析

黃偉，劉友平，趙祎姍，施學驕，張杰紅，彭月

枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L．及其栽培變種或甜橙 C．sinensis Osbeck的干燥幼果［1］;目前，市場上銷售的枳實主流品種為酸橙枳實［2－3］。枳殼為蕓香科植物酸橙C．a(chǎn)urantium L．及其栽培變種的干燥未成熟果實［1］?，F(xiàn)代研究表明枳實、枳殼類藥材中富含生物堿類成分，主要有脫氧腎上腺素(即對羥基福林，又名辛弗林(Synephfine))、乙酰去甲辛弗林(又名乙酰真蛸胺(N－aeetyloetopamine))、N－甲基酪胺(N－methyltyramine)、去甲腎上腺素(Noradrenaline)，喹諾啉(Qinoline)、那可汀(Nareotine)等［4］，其中以辛弗林、N－甲基酪胺含量較高。辛弗林是間接β－腎上腺素激動劑，它具有強心、增加心輸出量、改善心泵血功能及提高外周阻力、升高血壓的作用［5－8］;其化學結(jié)構(gòu)和麻黃堿近似，意大利學者通過動物實驗證實辛弗林對人的身體健康存在潛在威脅，其毒副作用引人關(guān)注。枳實、枳殼藥材中辛弗林是其升壓作用的功效成分，但關(guān)于其質(zhì)量控制方面的研究較少，特別是枳殼中辛弗林的質(zhì)量控制急待研究。因此如何在保證藥效的前提下，制定該類藥材的標準，確保臨床用藥安全有效值得進一步研究。本文對枳實、枳殼中辛弗林含量進行比較研究，以期為二者的質(zhì)量控制和臨床用藥提供現(xiàn)代科學參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

島津LC－10ATVP高效液相色譜儀(日本島津公司)，CLASS－VP工作站;紫外－可見分光光度計(上海天美科學儀器有限公司UV1100型);BP211D(十萬分之一)，BP121S(萬分之一)型電子分析天平(德國Sartorius公司)。

1．2 試劑

辛弗林對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用，批號0727－200004)，乙腈為色譜純(國藥集團化學試劑有限公司)，水為高純水，其余試劑為分析純。

1．3 樣品

枳實、枳殼藥材均由成都中醫(yī)藥大學標本館盧先明教授鑒定，鑒定結(jié)果、樣品采集時間、采集地及產(chǎn)地見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

大連依利特BDS C18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流動相乙腈－磷酸水(取十二烷基硫酸鈉0.5 g，0.5 mL磷酸加水溶解并稀釋至500 mL，加入5 mmol·L－1三乙胺調(diào)pH值至2.5)(50:50)，流速1.0 mL·min－1，柱溫30℃，檢測波長225 nm。在上述條件下，辛弗林色譜峰能完全分離，色譜圖見圖1。以辛弗林峰計算理論板數(shù)不低于3000。

圖1 圖中A為樣品，B為辛弗林對照品

2.2 供試品溶液的制備

取樣品粗粉1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，通過聚酰胺(60－90 目，2.5 g，內(nèi)徑為1.5 cm，干法裝柱)，用水25 mL洗脫，收集洗脫液，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.3 對照品溶液的制備

取辛弗林對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成濃度為 0.188 mg·mL－1的溶液，即得。

2.4 測定波長的選擇

取辛弗林對照品溶液在200～400nm波長范圍進行掃描，在225 nm處有最大吸收峰，故選擇225 nm作為檢測波長。

2.5 線性關(guān)系的考察

精密吸取“2.1.3”項下對照品溶液 2、6、10、12、16 μl注入液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積積分值(y)為縱坐標，質(zhì)量(x)為橫坐標進行線性回歸，得y=50522x－8041.6(R=0.9998)，結(jié)果表明:辛弗林的進樣量在0.376 mg～3.384 mg范圍內(nèi)與各自的峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗

取同一份供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜流出信號。以辛弗林含量為考察對象，計算6次分析所得辛弗林含量，RSD小于0.5%。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取 S－1 號樣品供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8，12 h測定辛弗林含量，結(jié)果辛弗林的RSD為1.28%。表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重現(xiàn)性試驗

取同一批號藥材，按供試品方法制備供試品溶液6份，記錄色譜流出信號，計算6份樣品中辛弗林含量，RSD小于1.0%。

2.9 回收率試驗

取K－1號藥材粉末約0.25 g(含辛弗林1.65 mg)6份，精密稱定。各份中加入辛弗林對照品溶液10 mL(含辛弗林1.88 mg)，按“2.2”項下供試品制備方法制備樣品，測定辛弗林含量，計算回收率。所得回收率分別為 99.1%、99.8%、100.8%、99.0%、100.9% 和102.7%，RSD為1.4%。

2.10 樣品含量測定

分別取供試品溶液及辛弗林對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定，記錄峰面積，按外標一點法計算樣品中辛弗林含量，結(jié)果見表1。

表1 枳實、枳殼樣品收集與辛弗林含量測定結(jié)果(n=2)

3 結(jié)果與討論

3.1 本實驗參考文獻報道以及藥典對枳實生物堿的純化方法，在枳殼樣品的處理上也通過聚酰胺進行了處理，在處理后枳殼中生物堿能夠得到很好的分離和富集。辛弗林為有機胺類生物堿，極性較大，用普通的色譜法無法達到良好的分離。因此采用離子對反相高效液相色譜法對其進行分離，流動相中加入十二烷基硫酸鈉、三乙胺作為離子對試劑，能達到良好的分離效果［9－10］。我們發(fā)現(xiàn)辛弗林在乙腈－磷酸水(取十二烷基硫酸鈉0.5 g，0.5 mL磷酸加水溶解并稀釋至500 mL，加入5 mmol·L－1三乙胺調(diào) pH 值至2.5)(50:50)作為流動相時，與相鄰組分的分離度達到分離要求，能完全滿足色譜峰定量要求。

3.2 含量測定結(jié)果表明所測枳實樣品中辛弗林含量變化范圍為0.28% ～2.53%，平均含量為1.1%;枳殼樣品中辛弗林含量變化范圍為0.10% ～1.10%，平均含量為0.58%，枳實中辛弗林含量明顯高于枳殼。不同批次、產(chǎn)地枳實和枳殼間辛弗林含量差異較大，所測枳實、枳殼樣品中辛弗林含量高者是辛弗林含量低者的10倍多，如:購于四川省西南藥都藥材市場的S－1枳實樣品辛弗林含量為2.53%，S－2枳實樣品辛弗林含量為0.28%;購于四川省西南藥都K－2枳殼樣品辛弗林含量為1.12%，重慶璧山自采K－6枳殼樣品辛弗林含量為0.1%。不同采收期的枳殼樣品中辛弗林含量差異也較大，如:榮昌種植基地K－7枳殼10月份自采樣品中辛弗林的含量0.25%低于榮昌種植基地K－3枳殼8月份自采樣中辛弗林的含量0.45%。以上結(jié)果表明:不同批次、產(chǎn)地和不同采收時期的枳實、枳殼樣品中辛弗林含量差異均較大。目前枳殼中還未建立辛弗林的控制指標，因而枳殼中辛弗林的質(zhì)量標準急待建立。本文對枳實、枳殼藥材中辛弗林含量進行比較分析，以期為制定該類藥材的質(zhì)量標準提供現(xiàn)代科學依據(jù)。

3.3 辛弗林其化學結(jié)構(gòu)近似麻黃堿，其毒副作用已有學者報道，該毒副作用應(yīng)該引起重視。枳實、枳殼中均含有辛弗林，而且該類藥材中辛弗林的含量差異較大，含量高者可達2.53%，含量低者只有0.1%，因而在建立該類藥材的質(zhì)量標準時應(yīng)同時考慮辛弗林的臨床療效和毒副作用。本文的研究結(jié)果，對該類藥材安全有效的臨床應(yīng)用具有參考價值。

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