中江石泉丹參叢枝菌根真菌鑒定

朱毓霞，宋杰，肖文娟

菌根(mycorrhiza)是自然界中一種普遍的植物共 生現(xiàn)象，它是一類土壤真菌與植物根系形成的一種互惠共生體［1］。Harley(1989)根據(jù)參與共生的真菌和植物種類及它們形成共生體系的特點(diǎn)，將菌根分為7種類型，即泡囊－叢枝菌根(VAM)、外生菌根(ECM)、內(nèi)外生菌根(EM)、漿果鵑菌根(ARM)、水晶蘭類菌根(MM)、歐石蘭類菌根(ERM)和蘭科菌根(OM)［2］。其中分布最為廣泛，與農(nóng)林牧業(yè)生產(chǎn)關(guān)系最為密切的是泡囊－叢枝菌根(VAM)，簡(jiǎn)稱叢枝菌根(AM)。許多研究表明，AM真菌可以促進(jìn)植物根系對(duì)磷、銅、鋅等礦質(zhì)元素的吸收，提高植株對(duì)水分脅迫的抗性，增加植物激素的合成和分配，從而能全面改善宿主植物的生長(zhǎng)狀況;AM真菌在穩(wěn)固土壤的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，改善土壤質(zhì)量等方面也有突出作用;同時(shí)，AM真菌對(duì)自然界中植物之間碳的遷移，維持寄主植物的多樣性和植物資源分布，維持生態(tài)系統(tǒng)的功能和穩(wěn)定性也有重要意義［3］。

丹參Salvia miltiorrhiza Bunge為唇形科植物。關(guān)于丹參的叢枝菌根真菌，目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)以中江石泉栽培丹參為研究對(duì)象，對(duì)丹參根系是否有叢枝菌根真菌的侵染、侵染情況、叢枝菌根真菌的種類等方面進(jìn)行研究，以便通過(guò)接種叢枝菌根真菌來(lái)提高丹參的產(chǎn)量和質(zhì)量。

1 實(shí)驗(yàn)材料

丹參根系及根際土壤(采自四川中江石泉)、FAA固定液(70%酒精 90 mL，冰乙酸 5 mL，福爾馬林5 mL)、酸性品紅乳酸甘油染色液(乳酸87.5 mL，甘油6.3 mL，蒸餾水6.3 mL，品紅0.094 g)、棉蘭試劑(苯酚10 g，乳酸10 mL，甘油20 mL，水溶性苯胺藍(lán)0.02 g，蒸餾水10 mL)、Melzer’s試劑(碘 1.5 g，碘化鉀5 g，蒸餾水100 mL)、PVLG試劑(聚乙烯醇8.33 g，蒸餾水50 mL，乳酸50 mL，甘油5 mL)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品的采集及預(yù)處理

S型采樣，選取25株丹參作為取樣點(diǎn)，每個(gè)取樣點(diǎn)間隔2 m，去掉表層2 cm厚的表土，采集距地表2～30 cm土層中丹參的根系與根際土壤。剪取丹參藥材須根，輕輕洗凈泥沙，用純凈吸水紙吸干水分，選擇直徑小于2 cm的須根100～200條，裝入三角瓶?jī)?nèi)，用FAA液固定。將采集的丹參根際土壤置通風(fēng)陰涼處風(fēng)干，裝入大信封內(nèi)封好，并在袋內(nèi)袋外貼上標(biāo)簽，注明編號(hào)、地點(diǎn)、海拔、地形、采樣人、采樣時(shí)間等。

2.2 丹參根系叢枝菌根真菌侵染率測(cè)定

用堿解離－乳酸甘油酸性品紅染色法對(duì)根樣進(jìn)行染色處理［4］。

(1)組織透化:將經(jīng)FAA液固定的根系取出，剪成0.5～1 cm的小段，放入試管中，加入5～10%KOH溶液，90℃水浴解離40 min，對(duì)根段進(jìn)行透明處理;

(2)漂洗:將KOH溶液倒掉，待試管冷卻后用清水沖洗根段2～3次;

(3)酸化:用KOH溶液處理后，根的堿性很強(qiáng)，必須將其酸化，才有利于乳酸甘油酸性品紅試劑對(duì)叢枝菌根結(jié)構(gòu)的良好染色。在試管中加入2%HCl溶液，對(duì)根段進(jìn)行酸化，以促進(jìn)染色，5 min后將HCl倒掉;

(4)染色:在試管中加入適量乳酸甘油－酸性品紅染色液，90℃水浴解離40 min(可回收染色液重復(fù)利用);

(5)鏡檢:將染色后的根系加入注有乳酸的培養(yǎng)皿中脫色，用鑷子挑取15條粗細(xì)一致的根段整齊地排列在干凈載玻片上，加蓋玻片后于光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄根樣中有無(wú)叢枝菌根真菌的侵染及侵染情況(植物細(xì)胞不著色，真菌組織染成紅色)。處理200條根段，按根段頻率標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)定菌根侵染率，即沒(méi)有菌根結(jié)構(gòu)的根段其侵染率為0%，整條根段全被侵染的為100%，只有一半長(zhǎng)度的根段被侵染的為50%，以此類推，并記錄各侵染率下的根段條數(shù)。侵染率計(jì)算公式如下:

侵染率(%)={∑(0%×根段數(shù)+10%×根段數(shù)+20%×根段數(shù)+……+100%×根段數(shù))}÷觀察總根段數(shù)

2.3 叢枝菌根真菌孢子的分離和鑒定

2.3.1 叢枝菌根真菌孢子的分離

采用濕篩傾注－蔗糖離心法［5］從根際土樣中分離叢枝菌根真菌孢子。具體操作為:稱取100 g土樣，倒入大燒杯中，加入500 mL水，浸泡30 min，用玻棒充分?jǐn)噭?，靜置10 s后，將上層的土壤懸浮液慢慢地倒入最上一層土壤篩內(nèi)(最好集中在一小范圍內(nèi)傾倒，以保證篩出的孢子盡量集中，減少損失)過(guò)篩，20/80/150/300/400目(上篩20目，底篩400目)，反復(fù)洗土并過(guò)篩3～4次，用水反復(fù)沖洗各篩面的篩出物，直至沒(méi)有土壤微粒為止。然后用清潔的洗瓶將80/150/300/400目篩面的孢子及雜物分別沖入大離心管內(nèi)加水定容，經(jīng)3000 rpm/min離心3min，去掉上懸液，加入50%蔗糖定容，搖勻管底沉淀物，1500 rpm/min離心1.5min，取出離心管將上懸液馬上過(guò)400目篩，用清潔的洗瓶將各篩面上滯留的篩出物輕輕地洗入潔凈的培養(yǎng)皿內(nèi)。

2.3.2 AMF孢子的鑒定

采用形態(tài)特征分類鑒定法［6～7］。具體操作如下:將濕篩得到的孢子置體視鏡下觀察，按孢子的大小、形態(tài)、顏色等進(jìn)行初步分類。然后，用微吸管或挑針挑取孢子置于載玻片上，加浮載劑PVLG，在顯微鏡下觀察孢子的顏色、形狀、測(cè)量孢子大小，連孢菌絲的有無(wú)及著生方式，附屬結(jié)構(gòu)等，然后將孢子調(diào)整至最佳位置，壓破孢子用油鏡測(cè)量孢壁總厚度，連點(diǎn)形狀及寬度和連孢菌絲寬度，從蓋玻片一側(cè)加入乳酸，重測(cè)上述數(shù)據(jù)。觀察孢壁結(jié)構(gòu)，發(fā)芽方式等特征;孢壁顏色、分層分組情況、各壁層的質(zhì)地類型，內(nèi)含物的性質(zhì)等。鑒定中輔助使用Melzer’s試劑、棉藍(lán)酚試劑，觀察孢子的特異反應(yīng)，對(duì)有代表性或特異性的特征隨時(shí)拍照。綜合以上觀察結(jié)果，參照檢索表(Schenck＆Perez，1988 AM菌根真菌鑒定手冊(cè))和近幾年發(fā)表的新種、新記錄種，同時(shí)參照國(guó)際AM菌種保藏中心(International Culture Collection Center of Vesicular and Arbscular Mycorrhizal Fungi)在internet上(http://invam．caf．wvu．edu)提供的種的描述、圖片及相應(yīng)分類單元的原始發(fā)表進(jìn)行AMF種的鑒定，鑒定到屬和種。

3 結(jié)果與分析

3.1 丹參根系叢枝菌根真菌的侵染率

通過(guò)染色試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所采丹參根系樣品有菌根侵染，且全部屬于AM類型。AMF侵染宿主丹參的根系并形成典型的AM。AMF菌絲在宿主根系外蔓延生長(zhǎng)，形成外生菌絲并產(chǎn)生根外孢子;同時(shí)，菌絲在宿主皮層細(xì)胞間延伸生長(zhǎng)，形成內(nèi)生菌絲，并分支進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)育成叢枝結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間形成多種形狀的泡囊。結(jié)果證明，丹參確有AM存在，侵染率為17.6%，侵染強(qiáng)度不高。丹參根系叢枝菌根真菌侵染情況見(jiàn)圖1。

圖1 丹參根系叢枝菌根真菌侵染

3.2 丹參叢枝菌根真菌種的鑒定

從丹參根際土壤中共分離出13種AM真菌，其中球囊霉屬(Glomus)9種，占已鑒定屬種的69.23%，是丹參根系重要的AMF菌種群。無(wú)梗囊霉屬(Acaulospora)3種，占23.83%，盾巨孢囊霉屬(Scutellspora)1種，占7.94%，鑒定到種的有8種，分別是Glomus caledonium、Glomus clarum、Glomus constrictum、Glomus geosporum、Glomus mosseae、Glomus sinuosum、Acaulospora scobiculata、Acaulospora lacunosa。其中有5份孢子只鑒定到屬而未鑒定到種，這些孢子或因缺乏明顯的分類特征，或未見(jiàn)有相關(guān)描述而難于做種的鑒定。叢枝菌根孢子形態(tài)見(jiàn)圖2。

圖2 叢枝菌根孢子形態(tài)

4 討論

丹參能被叢枝菌根真菌侵染，形成典型的菌根結(jié)構(gòu)，故丹參也是一類菌根營(yíng)養(yǎng)型植物;已分離鑒定出丹參AMF13種，隸屬3個(gè)屬，包括球囊霉屬、無(wú)梗囊霉屬和盾巨孢囊屬。其中，球囊霉屬9種，是丹參AM真菌中最大的種群。

本試驗(yàn)采用丹參人工栽培區(qū)樣品。由于其獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境易誘發(fā)各種病蟲(chóng)害，如根腐病、葉斑病、根結(jié)線蟲(chóng)病、斜紋夜蛾、蠐螬、地老虎等，所以在栽培過(guò)程中使用了大量農(nóng)藥，造成有害物質(zhì)在土壤中大量殘留［8］。這對(duì)AMF的侵染、種類組成等有很大的影響。所以試驗(yàn)結(jié)果未能完整反映出丹參AMF的組成，仍需進(jìn)一步的研究。

［1］ 楊顯志，邵華，周成，等．叢枝菌根研究及應(yīng)用［J］．云南農(nóng)業(yè)科技，2001，4:38．

［2］ 劉潤(rùn)進(jìn)，陳應(yīng)龍．菌根學(xué)［M］．北京:科學(xué)出版社，2007．

［3］ 王賢波．叢枝菌根(AM)的研究進(jìn)展及展望［J］．杭州農(nóng)業(yè)科技，2007，2:19．

［4］ M．Brundrett，L．Melville，L．Peterson．Practical methods in mycorrhiza research［M］．Mycolo gue Publications，1994．

［5］ Gerdemann JW，Nicolson YJ．Spore of mycorrhizal Endo gone species extracted from soil by wet sieving and decantation［J］．Trasactions of British Mycolo gical Society，1963，46:235．

［6］ Morton JB，Benny GL．Revised classification of arbuscular mycorrhizal fungi(zy gomycetes):a new order，Glomales，two new suborders，Glomineae and G gasporineae and two new families，Acaulosporaceae and Gi gasporadeae，with an emendation of Glomaneae［J］．Mycotaxon，1990，37:471．

［7］ Berch SM．Endo goaceae taxonomy specificity fossile reccord phylo geny［J］．Frontiers of Applied Microbiolo gy，1987，2:161．

［8］ 張美慶，王幼珊．環(huán)境因子和AM真菌分布的關(guān)系［J］．菌物系統(tǒng)，1999，18(1):25．