玉米秸稈分批補料獲得高還原糖濃度酶解液的條件優(yōu)化

宋安東，任天寶，張玲玲，王風(fēng)芹，謝慧

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002

2 河南科技學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003

玉米秸稈分批補料獲得高還原糖濃度酶解液的條件優(yōu)化

宋安東1，任天寶2，張玲玲1，王風(fēng)芹1，謝慧1

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002

2 河南科技學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003

木質(zhì)纖維素高濃度還原糖水解液的獲得是纖維乙醇產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的方向。在發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域，分批補料法是實現(xiàn)這一目標的重要研究途徑。本研究采用分批補料法對獲得高濃度玉米秸稈酶解還原糖的條件進行了優(yōu)化。以稀硫酸預(yù)處理的玉米秸稈為原料，考察了液固比、補加量與補加時間對分批補料糖化的影響。結(jié)果表明，秸稈高濃度酶解液條件的初始物料為20% (重量/體積)，木聚糖酶220 U/g (底物)，纖維素酶6 FPU/g (底物)，果膠酶50 U/g (底物)，在24 h、48 h后分批補加8%預(yù)處理后的物料，同時添加與補料量相應(yīng)的木聚糖酶20 U/g (底物)，纖維素酶2 FPU/g (底物)，72 h后，最終糖化結(jié)果與非補料法相比，還原糖濃度從48.5 g/L提高到138.5 g/L，原料的酶解率最終達到理論值的62.5%。試驗結(jié)果表明補料法可以顯著提高秸稈水解液還原糖濃度。

玉米秸稈，預(yù)處理，補料，糖化

Abstract:High-concentration sugars production from stover is an important perspective technology for the cellulosic ethanol industrialization. Fed-batch process is an effective way to achieve this goal in the fermentation industry. In this study, based on fed-batch process, high-concentration sugars were produced from pretreated corn stover by enzymatic hydrolysis. After being pretreated by the dilute sulphuric acid, the impacts of the ratio of solid raw material to liquid culture, the content of supplementary materials and the refilling time on the saccharification rate were investigated. Results showed that the initial ratio of solid raw material to liquid culture was 20% (W/V) and the initial concentrations of enzymes for xylanase, cellulose and pectinase were 220 U,6 FPU, and 50 U per gram of substrates, respectively. After 24 hours and 48 hours, 8% pretreated corn stovers were added respectively together with the additions of xylanase (20 U) and cellulose (2 FPU) per gram of substrates. After 72 hours, the final concentration of reducing sugar was increased to 138.5 g/L from 48.5 g/L of the non fed-batch process. The rate of enzyme hydrolysis of the raw material was 62.5% of the thoretical value in the fed-batch process. This study demonstrated that the fed-batchprocess could significantly improve the concentration of reducing sugar.

Keywords:corn stover, pretreatment, fed-batch process, enzymatic hydrolysis

現(xiàn)代生物質(zhì)能借助熱化學(xué)、生物化學(xué)等手段，通過一系列先進的轉(zhuǎn)換技術(shù)，生產(chǎn)出固、液、氣等高品位能源來代替化石燃料，為人類生產(chǎn)、生活提供電力、交通燃料、熱能、燃氣等終端能源[1-2]。木質(zhì)纖維素的高效水解是實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化為生物燃料和生物制品關(guān)鍵技術(shù)之一，如生物乙醇、生物丁醇、生物制氫等都是建立在木質(zhì)纖維素高濃度水解糖平臺基礎(chǔ)之上[3]。因此，開展高效的木質(zhì)纖維素糖化技術(shù)研究是實現(xiàn)高值化利用的重要途徑[4]。

在纖維乙醇研究領(lǐng)域中，纖維素原料高濃度還原糖水解液的獲得有利于提高后期乙醇高濃度發(fā)酵并降低乙醇蒸餾的能耗和經(jīng)濟成本。由于木質(zhì)纖維素原料質(zhì)地疏松、能量密度小、浸水性差等特點，致使一次性加料固形物濃度較低，水解還原糖濃度處于較低水平。Rudolf等認為分批補料法可以提高水解液糖濃度，是一種解決乙醇發(fā)酵濃度較低有效的途徑之一[5]。目前，基于木質(zhì)纖維素酶水解機理模型，圍繞木質(zhì)纖維素高濃度水解液的技術(shù)體系優(yōu)化，降低或消除水解過程中產(chǎn)物反饋抑制效應(yīng)已經(jīng)成為研究的重點之一[6]。Pristavka等研究了在非連續(xù)攪拌反應(yīng)器中，21%的秸稈固形物，纖維素添加量42 FPU/g秸稈，還原總糖濃度達到160 g/L[7]。趙晶等采用分批補料酶解工藝，使底物最終質(zhì)量濃度達到200 g/L，纖維素酶20 FPU/g (底物) 和纖維二糖酶6.5 CBU/g (底物) 酶解60 h后還原糖濃度達到116.3 g/L，酶解得率達到80.1%[8]。雖然纖維素高濃度水解技術(shù)并取得了一定進展，但仍然存在兩個較為突出的問題：一是纖維素酶用量大，酶的添加量通常為20~45 FPU/g原料；二是還原糖濃度較低，通常在100 g/L以下，且糖化時間較長，這些不利因素制約纖維乙醇產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進程。

本研究針對纖維素高濃度水解過程中酶加載量較高和糖化周期較長等問題，以稀硫酸預(yù)處理的玉米秸稈為原料，采用分批補料糖化的方法，對影響纖維素高濃度水解液的條件進行優(yōu)化，有利于構(gòu)建木質(zhì)纖維素的高濃度水解技術(shù)體系。該補料糖化方法的建立，為以后纖維液體燃料工業(yè)化生產(chǎn)中補料控制提供了有益的啟示和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

玉米秸稈：取自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)北郊科教試驗園區(qū)，粉碎100~200目，水分含量12%，經(jīng)測定原料及其預(yù)處理后的主要成分含量如表1所示。

表1 試驗用玉米秸稈的主要成分 (%，干基)Table1 Main components of corn stover (%, dry basis)

1.1.2 所用酶類

纖維素酶：購自無錫杰能科生物工程有限公司，濾紙酶活180 FPU/mL。

木聚糖酶：購自無錫杰能科生物工程有限公司，CMC酶活4.5×104U/mL。

果膠酶：購自寧夏和氏壁生物技術(shù)有限公司，酶活 5.0×105U/g。

1.2 方法

1.2.1 稀酸預(yù)處理及糖化

每次準確稱取玉米秸稈原料10 g放于300 mL三角瓶中，平行 3次，用 1%稀硫酸溶液浸潤，初始固形物含量為20% (W/V)，121 ℃處理60 min后，冷卻至室溫，在pH 4.8醋酸-醋酸鈉緩沖液進行酶解。原料酶添加量為：木聚糖酶220 U/g，纖維素酶6 FPU/g，果膠酶50 U/g，溫度45 ℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min，每隔24 h測定還原糖濃度。

1.2.2 補料糖化

補料原料：玉米秸稈原料經(jīng) 1%稀硫酸，固形物含量為20%，121 ℃處理60 min后，冷卻至室溫，抽濾，105 ℃烘干備用。

補料糖化：從一次性加料糖化實驗中得到的最佳條件作為補料糖化過程的最初含量，每隔24 h對原料進行補料，補料前測定還原糖濃度。

補酶量：每克補加原料酶添加量為木聚糖酶20 U/g，纖維素酶2 FPU/g。

1.3 分析方法

纖維素酶酶活測定：采用QB 2583-2003測定。

木聚糖酶酶活測定：采用GB 23874-2009測定。

果膠酶酶活測定：采用QB1502-92測定。

纖維素、半纖維素、木素的測定：采用范氏(Van Soest) 纖維測定法。

總還原糖濃度測定：采用DNS法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 液固比對分批補料糖化的影響

纖維素酶降解發(fā)生在固、液相界面較為復(fù)雜的過程，影響這個動態(tài)過程的因素有很多，一方面與纖維素自身的結(jié)晶區(qū)類型、聚合度、分子質(zhì)量有關(guān)；另一方面與水解液的理化性質(zhì)及酶作用表面結(jié)構(gòu)的吸附與解析等密切相關(guān)。首先考察了液固比對補料糖化的影響，從圖 1可以看出，當(dāng)液固比為 5，即固形物含量為20% (W/V) 時，間隔24 h進行分批補料，48 h和72 h時還原糖濃度分別為108.7 g/L和117.6 g/L，比對照相應(yīng)增加了20.8 g/L和23.0 g/L，表明隨著分批補料的添入，還原總糖的濃度顯著增加，但還原總糖增幅減少。

從圖2可以看出，當(dāng)液固比為6，48 h和72 h時還原糖濃度分別為89.8 g/L和106.2 g/L，比對照相應(yīng)增加了3.6 g/L和13.2 g/L。圖1和圖2結(jié)果表明通過分批補料的方法可以獲得較高濃度的還原總糖，表明分批補料可以提高促進水解液中游離態(tài)的酶吸附與底物的降解，從而提高糖化體系中酶的利用效率，降低酶的相對使用量。

圖1 液固比為5對補料糖化的影響Fig. 1 Effects of liquid to solid ratio of 5 on the release of reducing sugar.

圖2 液固比為6補料糖化的結(jié)果Fig. 2 Effects of liquid to solid ratio of 6 on the release of reducing sugar.

2.2 不同補料量對糖化的影響

在進行液固比對分批補料糖化影響的基礎(chǔ)上，研究了分批補料料量對糖化體系的影響。如圖 3所示，一次補料糖化結(jié)束后，補料 4% (W/V)、6%(W/V) 和 8% (W/V) 還原糖與對照相比分別增加了15.5 g/L、26.1 g/L和44.7 g/L；表明隨著一次分批補料量的增加，還原總糖的增幅相對增加；二次補料糖化結(jié)束時，補料 4% (W/V)、6% (W/V) 和 8%(W/V) 還原糖與對照相比分別增加了 34.6 g/L、46.7 g/L和58.0 g/L，但在這一補料糖化階段，補料6% (W/V) 與8% (W/V) 相比，增量分別為21.5 g/L和13.6 g/L，表明隨著二次分批補料量的增加，還原總糖的增幅相對減少，這與水解液體系中增加木質(zhì)素含量濃度相對增加有關(guān)，以致影響固、液相界面游離態(tài)酶的可及性，這與Zhao等和Mosier等對纖維質(zhì)高濃度糖化水解的研究結(jié)果相一致，隨著酶解糖化的持續(xù)進行，不易降解的底物如木質(zhì)素，部分結(jié)晶度較高的 (半) 纖維素可能阻礙酶的吸附和解吸效率[8-9]。

圖3 不同補料量對糖化的影響Fig. 3 Effects of feeding loading (W/V) on the release of reducing sugar.

圖4 不同補料量與補酶對糖化的影響Fig. 4 Effects of feeding loading (W/V) and enzymes on the release of reducing sugar.

2.3 分批補料與補酶對糖化的影響

基于分批補料量不同對糖化的影響，研究同時分別補料與酶的研究，通過少量的酶，以增強底物對酶的吸附與解吸附問題，從而有利于提高底物的轉(zhuǎn)化率，獲得高濃度的纖維素水解液。從圖4中可以看出，一次補料同時補酶時，產(chǎn)生的還原糖濃度比只補料產(chǎn)生的還原糖濃度分別提高 13.5 g/L、15.8 g/L和16.6 g/L。經(jīng)過二次補料補酶后，補料4% (W/V)、6% (W/V) 和8% (W/V) 時還原糖濃度分別為116.2 g/L、122.5 g/L和138.5 g/L。結(jié)果分析表明隨著補料量的增加，產(chǎn)生的還原糖濃度也在增加，在經(jīng)過一次補料補酶后，不同的補料量產(chǎn)生的還原糖濃度基本相同，還原糖濃度都增加了約25~27 g/L。從二次補料補酶的結(jié)果中可以看出，在48~72 h水解過程中，補料8% (W/V) 還原糖濃度達到138.5 g/L。試驗結(jié)果表明，糖化過程中分批補料補酶工藝可以有效提高還原糖的濃度。

3 結(jié)論

本研究以稀硫酸預(yù)處理后的玉米秸稈為原料，采用分批補料工藝方法，對影響纖維素高濃度水解液的條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明：固形物含量為 20%(W/V) 玉米秸稈經(jīng) 1%稀硫酸溶液浸潤，121 ℃處理60 min后，冷卻至室溫，在醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 4.8) 中進行，原料酶添加量為木聚糖酶220 U/g，纖維素酶6 FPU/g，果膠酶50 U/g，溫度45 ℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min開始進行糖化，糖化24 h和48 h后分別向水解液中加入 8%的物料和補料量相應(yīng)的木聚糖酶20 U/g (底物)，纖維素酶2 FPU/g (底物)，糖化72 h后水解液最終還原總糖達到138.5 g/L，原料的酶解率最終達到理論值的62.5%。

纖維素原料高濃度水解液的獲得是實現(xiàn)其高濃度發(fā)酵并降低纖維乙醇生產(chǎn)成本的必要條件。本實驗室以前對一次添加秸稈原料的酶解條件進行了研究[11-13]，結(jié)果表明原料可以達到較高的酶解效率，但水解液中還原糖濃度僅為 48.5 g/L[12]，水解糖的濃度始終處于較低的水平。采用與本研究中相同的預(yù)處理條件和酶解條件，對稻草秸稈酶解72 h后，水解液中還原糖濃度為84.22 g/L[14]。本文基于補料糖化策略，通過分批添加底物的方式獲得了較高還原糖濃度的纖維素水解液。與以前的非補料糖化72 h實驗結(jié)果相比，表明補料法可以顯著提高還原總糖濃度。該結(jié)果與趙晶等研究結(jié)果相比[8]，減少了纖維酶用量，還原糖濃度提高了 19.1%，但原料的酶解率降低了17.6%。

在木質(zhì)纖維素原料的酶法糖化工藝中，提高底物濃度有利于獲得較高的還原糖濃度，但如果初始底物濃度太高，則底物料液過于黏稠，不利于攪拌和傳熱，從而影響酶解反應(yīng)進行，分批補料法可以解決這一關(guān)鍵技術(shù)難題。綜上所述，分批補料法可以有效提高還原總糖濃度，但仍需進一步優(yōu)化和提高原料酶解率，最終實現(xiàn)纖維質(zhì)原料的高效糖化，獲得適合工業(yè)發(fā)酵水平高濃度還原總糖，從而有利于木質(zhì)纖維素液體燃料的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

REFERENCES

[1] Zhang BL, Wang JQ, Xu GZ, et al. Thinking about bio-energy utilization in China. Transac Chin Soc Agri Eng, 2009, 25(9): 226?234.

張百良, 王吉慶, 徐桂轉(zhuǎn), 等 中國生物能源利用的思考. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2009, 25(9): 226?234.

[2] Wu CZ, Zhou ZQ, Yin XL, et al. Current status of biomass energy development in China. Transac Chin Soc Agri Machin, 2009, 40(1): 91?97.

吳創(chuàng)之, 周肇秋, 陰秀麗, 等. 我國生物質(zhì)能源發(fā)展現(xiàn)狀與思考. 農(nóng)業(yè)機械學(xué)報, 2009, 40(1): 91?97.

[3] Sims REH, Mabee W, Saddler JN, et al. An overview of second generation biofuel technologies. Biores Technol,2010, 101(6): 1570?1580.

[4] Hendriks ATWM, Zeeman G. Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass. Biores Technol, 2009, 100(1): 10?18.

[5] Rudolf A, Alkasrawi M, Zacchi G, et al. A comparison between batch and fed-batch simultaneous saccharification and fermentation of steam pretreated spruce. Enzyme Microb Technol, 2005, 37(2): 195?204.

[6] Demirbas MF. Biorefineries for biofuel upgrading: a critical review. Applied Energy, 2009, 86(Suppl1):S151?S161.

[7] Pristavka A, Kodituvakky PA, Kozlov YP, et al.High-solids enzymatic hydrolysis of steam-exploded willow without prior water washing. Appl Biochem Microb, 2000, 36(2): 101?108.

[8] Zhao J, Chen M, Zhang JF, et al. Study on Enzymatic hydrolysis of corncobfor ethanol production. Chem Ind Forest Prod, 2007, 27(4): 7?10.

趙晶, 陳明, 張靖芳, 等. 酶法糖化玉米芯發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究. 林產(chǎn)科學(xué)與工業(yè), 2007, 27(4): 7?10.

[9] Mosier N, Wyman C, Dale B, et al. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass.Bioresour Technol, 2005, 96(6): 673?686.

[10] Roche CM, Dibble CJ, Knutsen JS, et al. Particle concentration and yield stress of biomass slurries during enzymatic hydrolysis at high-solids loadings. Biotechnol Bioeng, 2009, 104(2): 290?300.

[11] Song AD, Wang MD, Ren TB, et al. Study on the straw saccharification conditions with cellulase and xylanase simultaneously. J Xinyang Normal Univ: Natural Sci,2006, 19(2): 181?184.

宋安東, 王明道, 任天寶, 等. 秸稈雙酶糖化條件研究.信陽師范學(xué)院學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2006, 19(2): 181?184.

[12] Song AD, Ren TB, Xie H, et al. Effect of chemical pretreatment on enzymatic saccharification of maize straw.Chemistry & Bioengineering, 2006, 23(8): 31?33.

宋安東, 任天寶, 謝慧, 等. 化學(xué)預(yù)處理對玉米秸稈酶解糖化效果的影響. 化學(xué)與生物工程, 2006, 23(8):31?33.

[13] Zhang LL. The study on hydrolysis conditions of straw[D]. Zhengzhou: Henan Agricultural University, 2010.

張玲玲. 農(nóng)作物秸稈水解條件的研究. 鄭州: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[14] Ren TB, Zhang LL, Song AD, et al. Research on multi-enzyme hydrolysis of rice straw. Renewable Energy,2010, 28(2): 67?72.

任天寶, 張玲玲, 宋安東, 等. 稻草秸稈多酶水解條件研究. 可再生能源, 2010, 28(2): 67?72.

Optimization of corn stover hydrolysis by fed-batch process

Andong Song1, Tianbao Ren2, Lingling Zhang1, Fengqin Wang1, and Hui Xie1
1 College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
2 Henan Institute of Science and Technolgy, Xinxiang 453003, China

Received: November 25, 2010; Accepted: February 21, 2011

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 70741032), Transformation Fund for Agricultural Science and Technology Achievements (No. 2006G B2D000173).

Corresponding author: Andong Song. Tel/Fax: +86-371-63555810; E-mail: song1666@126.com

國家自然科學(xué)基金 (No. 70741032)，國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目 (No. 2006G B2D000173) 資助。