皺皮木瓜多糖的提取及其抗氧化活性研究

劉 捷,王 文,盧 奎,馬 麗,張?bào)w祥

(河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,河南鄭州 450001)

皺皮木瓜多糖的提取及其抗氧化活性研究

劉 捷,王 文,盧 奎,馬 麗,張?bào)w祥

(河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,河南鄭州 450001)

以皺皮木瓜為原料,采用水煮醇沉法研究了提取溫度、提取時(shí)間、料液比、醇液比對(duì)水溶性木瓜多糖得率的影響,考察了木瓜多糖的抗氧化能力.通過正交試驗(yàn)確定了皺皮木瓜多糖的最佳提取工藝條件:溫度 96℃、提取時(shí)間 3 h、醇液比 3︰1、料液比 1︰40,其中提取溫度是影響提取工藝的顯著因素,在最佳工藝條件下多糖得率達(dá)到 5.0%,多糖含量為 63.29%.皺皮木瓜多糖對(duì)具有顯著的清除能力.

皺皮木瓜;多糖;提取工藝;正交試驗(yàn);抗氧化活性

0 前言

皺皮木瓜 (Chaenom eles Speciosa(Sweet.)Nakai)為薔薇科植物貼梗海棠,又稱貼梗木瓜、貼梗海棠.木瓜的種類很多,皺皮木瓜為正品木瓜,主要分布于華中、華東和西南地區(qū).木瓜味甜、肉滑、多汁,既可生吃,又可作佳肴,是一種藥食同源的植物.作為一種常用中藥,皺皮木瓜性溫味酸,具有平肝舒筋、和胃化濕之功效[1],可用于預(yù)防和治療風(fēng)濕病、霍亂、腸炎、痢疾、腳氣水腫等病癥[2].木瓜含有多種對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)成分和藥用成分,如多種有機(jī)酸、糖類、黃酮、皂苷、氨基酸、蛋白酶類、維生素、礦物質(zhì)等[3],具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值.

木瓜集藥用、食用、觀賞價(jià)值于一身,資源豐富,應(yīng)用前景非常廣闊.國(guó)內(nèi)對(duì)皺皮木瓜的開發(fā)正不斷升溫[4].多糖是皺皮木瓜果實(shí)中重要的生物活性物質(zhì),而目前對(duì)皺皮木瓜中多糖的研究還鮮有報(bào)道.作者研究了皺皮木瓜多糖的提取工藝及抗氧化活性,以期為皺皮木瓜多糖的開發(fā)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皺皮木瓜:采摘于鄭州郊區(qū),洗凈、曬干、經(jīng)粉碎后保存于冰箱中備用.

石油醚、95%乙醇、葡萄糖、硫酸、苯酚、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀、鄰苯三酚、磷酸氫二鈉、0.1%茚三酮、碘 -碘化鉀、10%α-萘酚等均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

RE—52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SZ—93自動(dòng)雙重純水蒸餾器:上海亞榮生化儀器廠;BL—3205電子天平 (精度 ≥0.01 g)、AY—120電子天平 (精度≥0.000 1 g):日本島津公司;TU—1800PC紫外可見分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;微型高速萬能試樣粉碎機(jī):北京市永光明醫(yī)療儀器廠;HH—6數(shù)顯恒溫水浴鍋:江蘇常州國(guó)華電器有限公司.

1.3 方法

1.3.1 提取工藝

皺皮木瓜干品→粉碎→石油醚脫脂→熱水浸提→減壓抽濾→殘?jiān)貜?fù)浸提 1次→合并濾液→減壓濃縮→乙醇沉淀→過濾→洗滌→真空干燥→皺皮木瓜粗多糖.

樣品處理:將新鮮的皺皮木瓜去籽,烘干,在粉碎機(jī)中粉碎,過 40目篩,樣品保存于干燥試劑瓶中.

脫脂:稱取 30 g皺皮木瓜粉末,加入 100 mL乙醚回流 4 h.抽濾,風(fēng)干.

熱水浸提:稱取 10 g脫脂后的皺皮木瓜粉末,加入一定量水,在一定溫度、一定時(shí)間內(nèi)浸提多次.

減壓濃縮:過濾后的多糖溶液減壓濃縮至100 mL.

醇沉:在濃縮后的多糖溶液中加入一定量95%乙醇,抽濾,分別用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌多次,真空干燥,得到皺皮木瓜粗多糖.

1.3.2 粗多糖的純化——Sevag法[5-6]

在一定量粗多糖溶液中加入氯仿 -正丁醇(V/V=5︰1)混合溶劑 ,攪拌 20 min,在離心機(jī)中以 4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心 20 min,去除多糖溶液層與有機(jī)溶液層交界處的變性蛋白質(zhì),重復(fù)數(shù)次直至中間無混濁沉淀為止.

1.3.3 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚 -硫酸法[7].標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:精確稱取 105℃干燥至恒重的無水葡萄糖 60 mg,置于 100 mL容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得﹙每 1 mL中含無水葡萄糖 0.6 mg﹚對(duì)照品溶液.精確量取對(duì)照品溶液 0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL,分別置于 50 mL容量瓶中 ,加水至刻度,搖勻,精確量取上述各溶液 2 mL,置具塞試管中,分別加 4%苯酚溶液 1 mL,混勻,迅速加入濃硫酸 7.0 mL,搖勻,于 40℃水浴中保溫 30 min,取出,置冰水浴中 5 min,取出,以第 1份為空白,在 490 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖 1所示.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖 1得到線性回歸方程為:y=0.011 4x+0.002 2,R2=0.997 0.

樣品多糖含量的測(cè)定:準(zhǔn)確吸取樣品溶液2.0 mL,置 10 mL具塞試管中,分別加入 4%苯酚溶液 1.0 mL,搖勻,迅速加入濃硫酸 7.0 mL,搖勻,于 40℃水浴中保溫 30 min,取出,置冰水浴中 5 min,取出,以第 1份為空白對(duì)照液,在 490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各樣品吸光度,由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中的多糖含量.

1.3.4 粗多糖得率的計(jì)算

1.3.5 理化性質(zhì)

1.3.5.1 碘 -碘化鉀反應(yīng)

將精制木瓜多糖樣品制成 1 mg/mL溶液,取1 mL多糖溶液加入碘 -碘化鉀溶液,觀察顏色變化.

1.3.5.2 茚三酮反應(yīng)

取 1 mL 1 mg/mL的精制木瓜多糖溶液,加入0.5 mL 0.1%茚三酮乙醇溶液,混勻,煮沸 1～2 min,冷卻,觀察顏色變化.

1.3.5.3 Molish反應(yīng)

取 1 mL濃度為 1 mg/mL的精制木瓜多糖溶液,加入 2滴Molish試劑即 10%α-萘酚的乙醇溶液,混合均勻后將試管傾斜 45°,沿試管壁慢慢加入 1 mL濃硫酸 (勿搖動(dòng)),豎立試管,觀察濃硫酸和糖交界面顏色的變化.

1.3.6 抗氧化活性的測(cè)定

超氧自由基清除能力測(cè)定[8]:于比色管中加入 2.25 mL pH 8.34磷酸鹽緩沖液 (PBS)、2 mL水和 0.25 mL 10 mmol/L鄰苯三酚,稀釋至 4.5 mL.混勻后 25℃保溫,在第 4分鐘時(shí)加入 1滴 10 mol/L HCl中止反應(yīng).以 PBS作為參比溶液,在325 nm處測(cè)定反應(yīng)后溶液的吸光度值 (A空).

測(cè)定樣品的清除能力時(shí),方法如上,只是將樣品溶液代替蒸餾水.終止反應(yīng)后,以相同濃度的樣品溶液作為參比溶液,在 325 nm處測(cè)定反應(yīng)后溶液的吸光度值 (A樣).

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對(duì)多糖得率的影響

在料液比 1︰10、時(shí)間 1 h、提取次數(shù) 2次、醇液比 2︰1的條件下,不同提取溫度對(duì)多糖得率的影響如圖 2所示.

由圖 2可以看出,隨著提取溫度的升高,多糖得率逐漸增加,而且變化幅度比較大,說明溫度對(duì)多糖得率影響較大.因?yàn)闇囟壬?溶劑的滲透能力和溶解能力增強(qiáng),有利于多糖的滲出.但是溫度過高會(huì)破壞多糖的生物活性,改變其高級(jí)結(jié)構(gòu),顏色加深,黏度增大,不利于多糖的純化分離.溫度過高也不利于節(jié)省能源.從圖 2可以看到,當(dāng)溫度達(dá)到 90℃以上時(shí),多糖的得率變化不大,因此,溫度選擇 90℃較好.

圖2 提取溫度對(duì)多糖得率的影響

2.1.2 料液比對(duì)多糖得率的影響

在提取溫度 96℃(100℃時(shí)溶液劇烈沸騰,溶劑蒸發(fā)很快,96℃時(shí)多糖的得率也比較高,因此選擇這個(gè)溫度)、時(shí)間 1 h、提取次數(shù) 2次、醇液比 2︰1的條件下 ,不同料液比 1︰10、1︰20、1︰30、1︰40、1︰50對(duì)多糖得率的影響如圖 3所示.

圖3 料液比對(duì)多糖得率的影響

由圖 3可以看出,隨著料液比的增加,多糖得率逐漸上升,但是變化的幅度比較小,說明料液比對(duì)多糖得率影響較小.浸提用蒸餾水增加,消耗能量增加,后續(xù)濃縮工作量加大,浸提用蒸餾水越多,多糖損失的可能也越大,消耗的能量也越多.因此,料液比以 1︰30為宜.

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)皺皮木瓜多糖得率的影響

在 96 ℃、料液比 1︰10、醇液比 2︰1的條件下 ,不同提取時(shí)間 (2、3、4、5、6 h)對(duì)多糖得率的影響如圖 4所示.

從圖 4可看出,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),多糖得率先增加,隨后又下降.當(dāng)提取時(shí)間為 3 h時(shí),多糖得率達(dá)到最大.但是提取時(shí)間延長(zhǎng),多糖得率變化不大,在提取過程中多糖的損失也大.因此,提取時(shí)間 3 h較好.

圖4 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

2.1.4 醇液比對(duì)多糖得率的影響

在 96℃、料液比 1︰10、提取時(shí)間為 1 h條件下 ,不同醇液比 (2︰1、3︰1、4︰1、5︰1、6︰1)對(duì)多糖得率的影響見圖 5.

圖5 醇液比對(duì)多糖得率的影響

從圖 5可以看出,隨著醇液比的增加,多糖得率隨之增大,當(dāng)醇液比為 3︰1時(shí),多糖得率最大,再增加乙醇量,多糖得率反而開始下降.這可能是因?yàn)橐掖紳舛茸兇髸r(shí)多糖醇溶量增大.因此,選擇醇液比 3︰1.

2.2 正交試驗(yàn)

由單因素試驗(yàn)得出的條件,綜合各方面因素考慮,以提取溫度、提取時(shí)間、料液比和醇液比 4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn),結(jié)果見表1～表3.

表_1正交試驗(yàn)水平因素

從表2可以看出,極差順序:A＞C＞B＞D,即試驗(yàn)因素中對(duì)多糖得率影響的順序?yàn)?溫度 ＞料液比 ＞提取時(shí)間 ＞醇液比.溫度對(duì)多糖得率影響顯著,料液比的影響次之,提取時(shí)間和醇液比對(duì)多糖得率的影響較小.優(yōu)化后的提取工藝為A3B2C3D2,即溫度 96℃,提取時(shí)間 3 h,醇液比3︰1,料液比 1︰40.

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取 3 g皺皮木瓜粉,脫脂,在溫度 96℃、提取時(shí)間 3 h、醇液比 3︰1、料液比 1︰40的最佳工藝條件下提取多糖,試驗(yàn)結(jié)果得到多糖得率為5.0%,此時(shí)的多糖含量為 63.29%.與正交試驗(yàn)結(jié)果一致.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

2.4 粗多糖的純化——去蛋白

木瓜粗多糖經(jīng) Sevag法脫蛋白后,顏色由棕色變?yōu)榛野咨勰?多糖含量達(dá)到 80%.

2.5 多糖的理化性質(zhì)與光譜分析

2.5.1 多糖的理化性質(zhì)

純化后的木瓜多糖難溶于冷水,能溶于熱水,不溶于乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑.

木瓜多糖溶液遇碘變藍(lán)色.木瓜多糖溶液與茚三酮混合加熱,未出現(xiàn)藍(lán)色,說明木瓜多糖不含蛋白質(zhì).木瓜多糖與 Molish試劑反應(yīng)顯紫色.糖類物質(zhì)與 Molish試劑即α-萘酚試劑反應(yīng)都能顯色.

2.5.2 紫外 -可見光譜分析

皺皮木瓜多糖在 260 nm和 280 nm處無吸收,說明它不含蛋白質(zhì)、多肽和核酸.

2.5.3 紅外光譜分析

純化后的皺皮木瓜多糖的紅外光譜見圖 6.

木瓜多糖的紅外光譜的特征吸收峰及歸屬如下:在 3 401 cm-1附近的強(qiáng)吸收峰為 O—H的伸縮振動(dòng)峰;2 928 cm-1處的峰是 C—H的伸縮振動(dòng);1 100～1 010 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰,為葡萄糖的特征吸收[9],1 639 cm-1處的峰為的非對(duì)稱伸縮振動(dòng).840 cm-1是α-多糖的特征吸收,890 cm-1處無吸收峰,可以確定不含有β-多糖.770 cm-1附近的吸收峰為 D-吡喃葡萄糖的吸收[10].可見木瓜多糖結(jié)構(gòu)中存在α-吡喃糖苷鍵.

圖6 木瓜多糖的紅外光譜

2.6 超氧自由基清除能力的分析

木瓜多糖對(duì)超氧自由基的清除結(jié)果如圖 7所示.

圖7 木瓜多糖對(duì)超氧自由基的清除能力

從圖 7可看出,木瓜多糖對(duì)超氧自由基清除能力顯著,且隨著多糖濃度的增大,清除能力逐漸增大.表明木瓜多糖對(duì)超氧自由基的清除率與多糖用量存在量效關(guān)系.當(dāng)木瓜多糖濃度達(dá)到 3 mg/mL時(shí),清除率達(dá)到 81%.

3 結(jié)論

采用水提醇沉法從皺皮木瓜中提取水溶性多糖,考察了提取溫度、提取時(shí)間、料液比和醇液比對(duì)木瓜多糖得率的影響,根據(jù)正交試驗(yàn)確定了提取溫度是顯著影響因素,優(yōu)化后的提取工藝條件為:溫度 96℃,提取時(shí)間 3 h,醇液比 3︰1,料液比1︰40.在該工藝條件下,木瓜多糖得率達(dá)到5.0%,多糖含量為 63.29%.經(jīng) Sevag法純化,木瓜多糖含量達(dá)到 80%.

紅外光譜表明皺皮木瓜多糖是含α-吡喃糖苷鍵的化合物.

木瓜多糖對(duì)超氧自由基具有明顯的清除能力.當(dāng)多糖濃度達(dá)到 3 mg/mL時(shí),清除率達(dá)到80%以上.

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EXTRACTI ON AND ANTI OXIDATI ON ACTI V ITY OF POLYSACCHAR IDES FROMCHAENOM ELES SPECIOSA(S WEET.)NAKA I

L IU Jie,WANGWen,LU Kui,MA Li,ZHANG Ti-xiang
(School of Chem istry and Chem ical Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou450001,China)

The paper studied the influences of extraction temperature,extraction time,material-to-liquid ratio and ethanol-to-liquid rate on the yield of water soluble polysaccharides extracted fromChaenom eles Speciosa(Sweet.)Nakai by hotwater extraction and precipitation with ethanol,and investigated the antioxidation activity of the polysaccharides.Through the orthogonal experiments,the paper determined the optimal extraction conditions of the polysaccharides fromChaenom eles Speciosa(Sweet.)Nakai:extraction temperature 96℃,extraction time 3 hours,material-to-liquid ratio 1︰40 and ethanol-to-liquid ratio 3︰1.The extraction temperature was the notable factor influencing the extraction technology.Under the optimal conditions,the yield of polysaccharides reached 5.0%,and the contentofpolysaccharides reached 63.29%.The test showed that the polysaccharides extracted fromChaenom eles Speciosa(Sweet.)Nakai had remarkable ability in scavenging·

Chaenom eles Speciosa(Sweet.)Nakai;polysaccharides;extraction technology;orthogonal experiment;antioxidation activity

TS201.2

B

1673-2383(2011)01-0048-05

2010-09-03

河南工業(yè)大學(xué)博士科研基金項(xiàng)目(150049)

劉捷 (1970-),女,河南鄭州人,博士,副教授,研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué).