胰淀素在肥胖相關(guān)性腎病進(jìn)展中的作用

劉聲茂,崔英春,田向輝,顧 華,吳 曼,劉慶鑫,張冬梅*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院腎病內(nèi)科,吉林長(zhǎng)春130041;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院腎病科)

胰淀素(amylin)是胰島β細(xì)胞分泌的一種由37個(gè)氨基酸殘基組成的神經(jīng)肽樣分子,是近年來(lái)被確認(rèn)的一種具有生理活性的胰島激素。有學(xué)者報(bào)道[1],約70%-90%的2型糖尿病患者存在胰島淀粉樣變性,其沉積物的主要成分為amylin。糖尿病腎病(DN)患者存在amylin表達(dá)、分泌異常,導(dǎo)致其外周血中amylin水平增高,并在腎臟沉積引起腎損傷[2]。其致病機(jī)制為DN患者體內(nèi)胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)所致的高胰島素血癥和高amylin血癥,可以導(dǎo)致amylin在腎小球沉積,成為腎小球結(jié)節(jié)樣病變的病因之一,此外,amylin還可以誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡加重局部組織損傷和纖維化的形成。肥胖相關(guān)性腎病(Obesity-related glomerulopathy,ORG)也伴有IR,也會(huì)出現(xiàn)高胰島素血癥和高amylin血癥,是否可以導(dǎo)致amylin在腎小球的沉積,誘發(fā)腎臟損傷,目前尚未見這方面的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用臨床觀察結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法,旨在探討amylin在ORG進(jìn)展中作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人血清Amylin-ELISA試劑盒及大鼠Amylin-ELISA試劑盒(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司);兔抗人Amylin單克隆抗體、兔抗大鼠Amylin單克隆抗體、生物素化羊抗兔IgG及免疫組化試劑盒(Sigma公司);注射用大鼠Amylin(Sigma公司)。

1.2 臨床觀察對(duì)象及分組

結(jié)合臨床,經(jīng)腎穿刺活檢腎臟病理明確診斷為ORG的患者為觀察組(ORG組,14例),隨機(jī)選取腎穿刺活檢病理明確診斷為系膜增生性腎小球腎炎的患者為對(duì)照組(NC組,14例)。所有患者24小時(shí)尿蛋白定量＜2.0 g,血肌酐＜200 μ mol/L,均無(wú)心 、肝 、腎等疾病史及糖尿病家族史,無(wú)急慢性感染及其他自身免疫性疾病,空腹及餐后2小時(shí)血糖正常。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谱骷胺纸M

成年雄性Wistar大鼠30只,體重為(200±20)g,適應(yīng)性喂養(yǎng)3天,隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組(NC組,n=10)、肥胖相關(guān)性腎病組(ORG組,n=10)和amylin皮下注射組(Amylin組,n=10)。根據(jù)文獻(xiàn)建立ORG大鼠模型[3],ORG組和Amylin組大鼠給予高脂飼料(脂肪49%,蛋白21%,碳水化合物30%,鹽2%;其中普通飼料59%,熟豬油20%,雞蛋黃10%,蔗糖9.5%和食鹽1.5%,熱卡21 kJ/g),NC組給予普通飼料,自由攝食,自由飲水。ORG組和Amylin組大鼠在飼養(yǎng)2個(gè)月后用尿蛋白試紙檢測(cè)尿蛋白,出現(xiàn)尿蛋白即為ORG模型成功。ORG模型成功后,Amylin組大鼠給予大鼠amylin皮下注射(100 μ g/kg)[4],隔日1次,持續(xù)2個(gè)月。NC組和ORG 組大鼠給予同等劑量的生理鹽水皮下注射。

1.4 標(biāo)本采集

1.4.1 臨床標(biāo)本采集 全部研究對(duì)象均抽取非抗凝的靜脈血4 ml,留取血清;抗凝血4 ml留取血漿;調(diào)取兩組患者腎臟病理標(biāo)本蠟塊,制成免疫組化所需標(biāo)本切片備用。

1.4.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集 6個(gè)月時(shí)各組大鼠用代謝籠留取24 h尿,檢測(cè)24 h尿蛋白定量。乙醚麻醉下稱體重,測(cè)量體長(zhǎng)即鼻至肛門的長(zhǎng)度。心臟取血,3 000 rpm離心10min,分離血清,-70℃保存。迅速開腹取出左腎,去掉被膜,經(jīng)腎門冠狀面取腎組織,置于新配制的10%中性緩沖甲醛液固定,用于光鏡觀察及免疫組化檢測(cè)。

1.5 各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)

1.5.1 患者及大鼠24 h尿蛋白定量(24 h-PRO)檢測(cè):考斯亮藍(lán)方法檢測(cè)。

1.5.2 患者及大鼠血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清amylin水平;放射免疫法檢測(cè)胰島素水平;自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血糖(SG)、血脂(TG,TC)。1.5.3 患者及大鼠胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)計(jì)算:空腹血糖×空腹胰島素含量/22.5。

1.5.4 患者及大鼠免疫組化ABC法檢測(cè) 腎組織切片3 μ m,常規(guī)脫蠟至水,加入兔抗大鼠amylin單克隆抗體/兔抗人amylin單克隆抗體(1∶100稀釋),再加入生物素化的羊抗兔IgG(1∶100稀釋),DAB顯色,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,封片觀察。

1.5.5 大鼠Lee's指數(shù)的計(jì)算 Lee's指數(shù)=[體重(g)]1/3×103/體長(zhǎng)(cm)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。兩組以上比較采用one way ANOVA檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察結(jié)果

2.1.1 兩組患者SG、TC、TG、HOMA-IR及amylin血清含量 與NC組比較,ORG組患者的SG增高,差異無(wú)顯著性,TC、TG、HOMA-IR及amylin水平均明顯增高,差異具有顯著性(P＜0.01)。見表1。

表1 兩組患者SG、TC、TG、HOMA-IR及amylin血清含量(±s)

表1 兩組患者SG、TC、TG、HOMA-IR及amylin血清含量(±s)

▲▲P＜0.01 vs NC組

n SG(mmol/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) HOMA-IR Amylin(ng/L)NC 組 14 4.96±0.41 1.03±0.30 3.92±0.61 2.63±0.69 381.27±99.14 ORG組 14 5.19±0.65 2.40±0.67▲▲ 5.58±0.94▲▲ 7.95±2.77▲▲ 498.98±105.44▲▲

2.1.2 兩組患者腎臟amylin表達(dá)情況 NC組患者腎小球內(nèi)無(wú)明顯amylin表達(dá);ORG組患者腎小球內(nèi)擴(kuò)張的系膜區(qū)可見陽(yáng)性表達(dá)。見圖1。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 各組大鼠一般狀態(tài) 第1個(gè)月內(nèi)ORG組和Amylin組大鼠進(jìn)食量減少,飲水明顯增加,行動(dòng)遲緩,活動(dòng)量減少;1個(gè)半月后ORG組和Amylin組大鼠上述情況均好轉(zhuǎn);6個(gè)月時(shí)ORG組和Amylin組大鼠飲水和尿量均明顯增多,毛發(fā)光亮度減退,活動(dòng)減少,精神出現(xiàn)不同程度的萎靡。NC組大鼠均正常。

2.2.2 大鼠Lee's指數(shù) 分組時(shí)各組大鼠Lee's指數(shù)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,6個(gè)月實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),ORG組和Amylin組Lee's指數(shù)顯著高于NC組(P＜0.01),ORG組和Amylin組兩組間無(wú)顯著差異(P＞0.05),見表2。

圖1 兩組患者腎臟amylin表達(dá),ABC法,400×,A為NC組,B為ORG組

2.2.3 各組大鼠SG 、TC 、TG 、HOMA-IR、amylin 水平及24小時(shí)尿蛋白定量的變化 與NC組比較,ORG組和Amylin組大鼠的SG、TG、TC、HOMA-IR 和24 h-PRO均增高,其中ORG組的TC和24h-PRO差異具有顯著性(P＜0.05),Amylin組除SG外,其余各指標(biāo)差異均具有顯著性(P＜0.01),但兩組SG雖升高,均在正常范圍內(nèi)且差異無(wú)顯著性;與ORG組比較,Amylin組除SG和HOMA-IR外,其余各指標(biāo)差異均具有顯著性(P＜0.01)。見表3。

表2 各組大鼠Lee's指數(shù)值

表3 各組大鼠血糖、血脂、胰島素抵抗指數(shù)、胰淀素水平及24小時(shí)尿蛋白定量的變化(±s)

表3 各組大鼠血糖、血脂、胰島素抵抗指數(shù)、胰淀素水平及24小時(shí)尿蛋白定量的變化(±s)

▲P＜0.05 vs NC組,▲▲P＜0.01 vs NC組,**P＜0.01 vs ORG組

SG(mmol/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) HOMA-IR Amylin(ng/L) 24 h-PRO(g/24 h)NC組 6.38±3.63 1.60±0.30 0.43±0.18 6.80±4.05 231.77±11.69 0.35±0.09 ORG組 7.75±1.80 1.74±0.19 1.30±0.25▲ 9.36±1.09 232.10±12.59 1.43±0.02▲Amylin組 9.57±2.64 5.83±0.32▲▲**5.37±0.19▲▲**11.93±3.70▲▲ 254.34±31.96▲▲** 1.91±0.45▲▲**

3 討論

胰淀素是胰島β細(xì)胞分泌的一種由37個(gè)氨基酸殘基組成的神經(jīng)肽樣分子,與胰島素(Ins)共同存在于胰島細(xì)胞分泌囊泡中,生理狀態(tài)下胰淀素參與體內(nèi)代謝,與胰島素拮抗來(lái)維持人體的正常功能,而人體內(nèi)胰淀素分泌異常將導(dǎo)致代謝紊亂,出現(xiàn)IR。與此同時(shí),代謝的紊亂又進(jìn)一步導(dǎo)致胰淀素的異常分泌。因此,胰淀素與IR是互為因果的。當(dāng)amylin表達(dá)、分泌異常時(shí),形成胰島淀粉樣蛋白,沉積在胰島細(xì)胞內(nèi)及其周圍,對(duì)胰島β細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用,使胰島β細(xì)胞團(tuán)及胰島素分泌減少,導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙和部分胰島β細(xì)胞的喪失,從而導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能進(jìn)行性衰退[5],并且還誘發(fā)及加重IR[6];促進(jìn)脂肪分解,增加血游離脂肪酸水平[7];活化腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)[8]和活化糖基化終末產(chǎn)物受體,刺激炎癥反應(yīng)發(fā)生[7,8],進(jìn)而參與糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生?，F(xiàn)已經(jīng)有研究證實(shí),amylin參與糖尿病及DN的發(fā)生發(fā)展,結(jié)果[9]顯示DN患者腎組織中有amylin沉積,并主要沉積在腎小球系膜區(qū)、K-W結(jié)節(jié)、增厚的球囊壁和病變的血管壁,腎組織amylin的沉積可能參與了DN患者的腎損傷。而ORG與糖尿病及DN有相似的發(fā)病機(jī)制及遺傳背景,故我們有針對(duì)性的選擇經(jīng)臨床及病理明確診斷為ORG的患者進(jìn)行觀察,免疫組化染色觀察后發(fā)現(xiàn),在ORG患者腎臟亦有表達(dá),為進(jìn)一步確定amylin在ORG發(fā)生發(fā)展中的作用是否與參與DN的機(jī)制相同,我們采用ORG模型大鼠給予皮下注射amylin,結(jié)果發(fā)現(xiàn),amylin注射后各項(xiàng)生化指標(biāo)均增加,差異顯著,且amylin在腎臟的表達(dá)亦增加,說(shuō)明amylin有促進(jìn)ORG病情惡化的作用。由此,我們可以得出以下結(jié)論,即amylin在ORG發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用,與在DN中產(chǎn)生的結(jié)果相同,其次,amylin可能有望成為ORG的治療靶點(diǎn),有效的延緩病情的進(jìn)展。

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