外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及制備染色體G顯帶的技術(shù)研究

韓 晶,李 洋

(1.安陽市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科,河南安陽455000;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院)

人們用物理、化學(xué)因素處理后,再用染料對染色體進(jìn)行分化染色,使每條染色體上出現(xiàn)明暗相間,或深淺不同帶紋的技術(shù)稱為顯帶技術(shù)(banding technique)。染色帶的數(shù)目、部位、寬窄和著色深淺均具有相對穩(wěn)定性,所以每一條染色體都有固定的分帶模式,即稱帶型。染色體帶型是鑒別染色體的重要依據(jù)。染色體分帶技術(shù)可分為兩大類,一類是產(chǎn)生的染色帶分布在整條染色體的長度上如:G、Q和R帶;另一類是局部性的顯帶,它只能使少數(shù)特定的區(qū)域顯帶,如C、T和N帶[1]。G帶即吉姆薩帶,是將處于分裂中期的細(xì)胞經(jīng)胰酶或堿、熱、尿素等處理后,再經(jīng)吉姆薩染料染色后所呈現(xiàn)的區(qū)帶,是目前被廣泛應(yīng)用的一種帶型。其特性是顯帶方法簡單恒定,帶型穩(wěn)定,保存時(shí)間長[2]。資料表明,外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及染色體G顯帶標(biāo)本制備技術(shù)是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)。近幾年來,有關(guān)細(xì)胞遺傳技術(shù)方法方面外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的報(bào)道較少,本文在此基礎(chǔ)上自2006年1月-2009年9月進(jìn)行680例細(xì)胞培養(yǎng),600份G顯帶制備技術(shù)處理總結(jié)實(shí)驗(yàn)方法,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

我院自2006年1月-2009年9月門診咨詢者680例,其中包括婦產(chǎn)科、新生兒等住院患者,外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后制備的染色體標(biāo)本。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與器材

1.2.1 實(shí)驗(yàn)器材 分析天平,隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱,恒溫水浴鍋,離心管,離心機(jī)(北京時(shí)代北利),載玻片,顯微鏡(OLYMPUS-CX21),標(biāo)本板,玻璃鉛筆,定時(shí)鐘,染色缸,直柄虹膜鑷,滴管。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 肝素抗凝劑(反復(fù)高壓后4℃冰箱中保存),RPMI1640、植物細(xì)胞凝集素(Phaseolus vulgaris,PHA),pH6.8 PBS,Giemsa,0.025%胰蛋白酶(取0.9%氯化鈉100 ml,加0.25%胰蛋白酶1 ml),0.75%的低滲液,0.50%秋水仙素(-10℃反復(fù)凍融保存),胰酶粉(顯帶前現(xiàn)配現(xiàn)用)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 染色體標(biāo)本培養(yǎng) 取患者外周血2毫升,5毫升注射器針頭28-32滴于RPMI1640培養(yǎng)基中,放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h;培養(yǎng)終止后,離心后將細(xì)胞提取出,所獲得的外周血淋巴細(xì)胞依次用0.75%mol/LKCL溶液低滲以及固定液固定,制成細(xì)胞懸液;后取潔凈冷濕的載玻片,吸取適量細(xì)胞懸液,滴于載玻片上(每片3-4滴),經(jīng)酒精燈外延加熱烘烤至干燥[3]。

1.3.2 G顯帶標(biāo)本制備[4]將制好的染色體標(biāo)本,置85℃烤箱中烤片2 h;放入預(yù)溫至37℃的0.025%胰酶溶液中(pH=7.2-7.4)消化1.5 min左右,每次的作用時(shí)間并不完全相同,可先試一張片子,再根據(jù)顯帶效果調(diào)整胰酶作用時(shí)間;在Giemsa染液中染色15 min,自來水沖洗干凈,晾干后,即可閱片;鏡檢:在顯微鏡高倍目鏡下檢查顯帶標(biāo)本,在染色體上若出現(xiàn)清晰的深淺相間的帶型,即為可取標(biāo)本。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)成功率

680例以各個染色體分布舒展,相對集中少重疊為準(zhǔn),于40倍光鏡下觀察到1號、7號、11號、14號及X六條帶紋特征性較強(qiáng)的染色體,培養(yǎng)成功率為96.62%(658/680)。取其中培養(yǎng)合格的600分進(jìn)行下一步的顯帶處理。

2.2 G顯帶制備合格率 G顯帶處理共計(jì)600張片。以100倍光鏡下觀察2號、4號、6號、13號、17號、20號以及22號共計(jì)7對染色體特征性帶紋區(qū)域清晰可辨認(rèn)為準(zhǔn),其顯帶合格率為91.67%(550/600),合格標(biāo)準(zhǔn)見表1。

50例失誤操作采取補(bǔ)救措施,效果分析,失誤率為8.00%(4/50),其成功率為92.00%(46/50),結(jié)果見表2。

表1 染色體G顯帶制備技術(shù)鏡下鑒定合格標(biāo)準(zhǔn)

表2 50例失誤操作補(bǔ)救措施效果觀察

3 討論

近幾年來,隨著人們對保健意識的不斷增強(qiáng),染色體檢查已經(jīng)逐漸在臨床檢查中普及,而且常用的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)是一個復(fù)雜并且繁瑣的過程,在實(shí)際的臨床工作過程中需要一周左右的時(shí)間才能正常的完成,同時(shí),實(shí)驗(yàn)過程中若有一個過程出現(xiàn)紕漏,就極有可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗[5]。接種血樣時(shí)要保持標(biāo)本的新鮮,最好是在采用24 h內(nèi)對外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),如果不能進(jìn)行培養(yǎng),可以放置于4℃的冰箱中保存,但保存時(shí)間不易過長,防止細(xì)胞活力的降低。對培養(yǎng)過程中出現(xiàn)血樣凝集的現(xiàn)象,可以將培養(yǎng)瓶輕輕震蕩,使凝塊散開,后放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)。導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的主要因素是抗生素、消炎藥以及高膽紅素等的干擾,抑制淋巴細(xì)胞從而影響細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量,對標(biāo)本的采集應(yīng)避開用藥近期或新生兒高膽紅素血癥期。

1978年有報(bào)道標(biāo)本總量(試劑+細(xì)胞)的總體積為4.0ml[6],本文研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用4.0ml低滲液,固定劑時(shí),對染色體去膜化解旋、舒展、膨脹等并無影響。離心過程中應(yīng)控制轉(zhuǎn)速為2000 r/min,防止染色體的丟失[7]。體積堆積的細(xì)胞沉淀物可以避免操作過程中因碰顫而導(dǎo)致的沉淀物的懸浮。另一方面,烤片也是不容忽視的操作環(huán)節(jié)?？酒粌H是老化過程,同時(shí)可以蒸發(fā)殘留于標(biāo)本片上的固定劑,同時(shí)將用于浸泡載玻片的乙醇酸類等物質(zhì)徹底蒸發(fā),從而利于消化液pH環(huán)境[8]。按照以上條件,本研究結(jié)果外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)合格率為96.62%(658/680)。資料報(bào)道,G顯帶技術(shù)有7種[9],其中主要以胰酶消化為主。胰蛋白酶濃度和處理時(shí)間隨氣溫高低有所不同。一般規(guī)律是標(biāo)本存放時(shí)間越長,在胰蛋白酶當(dāng)中處理時(shí)間越長。太新鮮的標(biāo)本,染色體會出現(xiàn)毛茸現(xiàn)象。片齡很長的標(biāo)本往往會導(dǎo)致斑點(diǎn)狀的染色體[10]。本實(shí)驗(yàn)通過研究,制備過程中臨時(shí)配制胰酶溶液,用玻璃毛細(xì)血管蘸取少許胰酶粉溶解于0.90%的鹽水中,配制成0.30%的胰酶溶液,消化時(shí)間6.5 h。G顯帶技術(shù)制備的合格率為91.67%(550/600)。

其中,染色對顯帶同樣也是至關(guān)重要,Gimesa是噻嗪類染料,其組成成分天青B與蛋白質(zhì)中的DNA分子中的磷酸基結(jié)合,蛋白質(zhì)在一定的環(huán)境中,同時(shí)具有嗜酸性及嗜堿性的傾向,通過調(diào)節(jié)染色液的pH值7.0-7.5,復(fù)染7 min,可以獲得較為鮮亮的顯色效果。綜上所述,通過對外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)及G顯帶各個制備環(huán)節(jié)的分析,提高了染色體制備技術(shù)的穩(wěn)定性及成功率。

[1]吳 海,高文英,李培寧,等.人類染色體G顯帶質(zhì)量與自身因素的相關(guān)分析[J].天津醫(yī)藥,2005,12(5):280.

[2]Neitrel HA.Routine method for the establishment of pernanent growing lymphoblastoid cell lines[J].Hum Genet,2000,739(4):320.

[3]金 鷹,唐 玟,李國明,等.實(shí)用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[J].激光生物學(xué)報(bào),2006,9(1):75.

[4]Wuzi Zhao,Liqing Cheng,LingminMU,etal.Modified method of chromosome G-banding in human peripheral blood[J].Jourmal of Chinical Rehatilitative Tissue Engineering Research,2007,11(11):2185.

[5]曹海濤.染色體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中的幾點(diǎn)體會[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007,16(30):4485.

[6]朱忠勇,陳之航.臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)[M].上?？萍汲霭嫔?1978:67.

[7]張國慶,焦順昌,林星石.人外周血淋巴細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)前后19種細(xì)胞表型研究[J].軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào),2008,29(5):352.

[8]李 潔,徐文瑜,楊嬌英.外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及染色體G帶標(biāo)本制備的實(shí)驗(yàn)對策[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2006,14(1):51.

[9]李 敏,王立斌,王玉炯,等.利用染色體G顯帶技術(shù)鑒定人永生細(xì)胞實(shí)驗(yàn)條件初探[J].生物技術(shù),2007,16(2):48.

[10]Hara M,Matsuzaki Y,Shimizu T,etal.Preoperative peripheral mative memory ratio and prognosis of nonsmall-cell lung cancer patients[J].Ann Thorac Cardiovase Surg,2007,13(6):384.