妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤患者外周血腫瘤細胞檢測方法的研究

蘭 晶

(安陽市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南安陽455000)

本文通過熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(FQRT-PCR),檢測β-hCG-mRNA,建立在外周血中檢出滋養(yǎng)細胞方法,推測妊娠腫瘤患者外周血中滋養(yǎng)細胞的含量,為腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移做預(yù)防。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

11例患者中,絨毛膜癌6例,臨床分期:Ⅰ期2例,Ⅱ期3例,Ⅲ期 1例;葡萄胎5例,臨床分期:Ⅰ期1例,Ⅱ a期2例,Ⅲb期1例;Ⅳ期1例,各例均于治療前采集外周血10 ml。非妊娠期婦女血液來自遼寧省血液中心。均為健康新鮮血液。

1.2 試劑與儀器

JAR細胞株購自中科院上海細胞庫;新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);IV膠原酶(美國Sigma公司);TRIZOL RNA提取液(美國Gibeo BRL公司);瓊脂糖(美國Promega公司);RPNI 1640培養(yǎng)液(北京萬域美瀾科技);電泳儀及電泳槽(美國Bio伯樂公司);CO2培養(yǎng)箱(美國Forma公司);紫外分光光度儀(北京凱慕公司);2720 FQ-PCR儀(美國ABI公司);低溫高速離心機(德國Eppendorf公司);Ficoll(上海試劑二廠);焦碳酸二乙酯;(美國BIO伯樂公司);DNase I(上海浩然生物技術(shù)公司);M-MLV逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(美國1NB公司);PCR反應(yīng)體系(上海生物工程有限公司);100 bp PCR 1VIarker(英國INB公司);熒光探針由美國PE公司合成;引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 JAR細胞加入外周血中實驗?zāi)Ｐ偷慕AR細胞接種于培養(yǎng)瓶中,24 h后取上清液,用PBS洗后用膠原酶消化2-3 min,加10%FCS吹打成細胞懸液,對細胞進行染色調(diào)整細胞濃度至1×10/ml,至1×107/ml。取非妊娠期婦女外周血與JAR細胞混合,每管10 ml。臺盼藍染色。

1.3.2 總RNA提取 TRIZOL試劑盒提取RNA,提取的經(jīng)DNaseI處理以去除總RNA基因組DNA。紫外分光光度儀測定其量及純度。

1.3.3 引物與探針 上游引物:5-TGC CAC CCT GGC TGT GGA-3;下游引物 :5-GCG GTA GTI”GCA CAC CAC CTG-3。熒光探針序列:5-TCA CCG TCA ACA CCA CCA TCT GTG C-3。

1.3.4 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶(FQ-RT-PCR) 逆轉(zhuǎn)錄合成CDNA第一鏈,總反應(yīng)體系補充無RNase水至20 ml。37℃水浴40min,95%5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶后,立即零下20℃保存待測。FQ-PCR:總反應(yīng)后補無RNase水至50 ml。在93、93.5、55℃分別反應(yīng) 2 min,45 s,120 s,于PE5700 DNA擴增儀上40次循環(huán),計算機隨時分析記錄,擴增結(jié)束時得出定量結(jié)果。

1.3.5 妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤病人外周血中β-hCG-mRNA的檢測 11例患者外周血10 ml,測定β-hCG-mRNA,使用上述引物與探針,進行FQ-RT-PCR,同時與1.3.1中測得的13-hCG-mRNA值作比較,腫瘤細胞的含量以外標準推算。

2 結(jié)果

2.1 FQ-RT-PCR檢測JAR細胞β-hCG-mRNA表達水平

JAR與探針熒光循環(huán)數(shù)呈負相關(guān)。當JAR細胞的數(shù)量遞減相當于 mRNA 量的 10 、102、103、104、105、106個檢測到探針熒光釋放所需的循環(huán)數(shù)遞增至16 、19 、21 、25 、26 、29 。Y=2.4X+27.3,r=-0.99,P≤0 001.

2.2 外周血加入JAR細胞后β-hCG-mRNA檢測

當細胞數(shù) ≥10/ml時,可以檢測到 β-hCG-mRNA且細胞數(shù)目與未滲入血時相近。當細胞數(shù)＜10/ml時無法檢測到細胞數(shù)。外周血加入JAR的檢測效率較低。

2.3 妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤患者外周血中β-hCG-mRNA檢測

11例妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤患者中有6例檢測到JAR細胞。5例沒有檢測到。檢測到的患者滋養(yǎng)細胞量經(jīng)推算為104-106。檢測到的5例患者細胞量小于104,或者是陰性。見表1。

表1 妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤患者外周血中滋養(yǎng)細胞的個數(shù)(例)

3 討論

惡性腫瘤對人類健康造成嚴重威脅,腫瘤死亡率高的的主要原因是部分腫瘤細胞獲得侵襲能力并造成遠處轉(zhuǎn)移[1]。妊娠滋養(yǎng)細胞疾病是一種與妊娠密切相關(guān)的疾病,包括絨癌、葡萄胎、侵蝕性葡萄胎和胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤,其本質(zhì)是胎盤絨毛細胞變性或過度增生[2-4]。雖然目前腫瘤治療有許多先進技術(shù)做為支撐,但是臨床反饋腫瘤的患者的總體治愈率、生存率仍然非常低,患者的生活質(zhì)量得不到提高,診斷的遲滯、腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍舊是造成患者死亡的主要原因。本研究以外周血為研究對象,外周血容易獲得取材方便,其檢測手段容易操控,對惡性腫瘤的早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)、早期處理轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有很大的意義,為惡性腫瘤的診治提供了必要的依據(jù)。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)在臨床上廣泛應(yīng)用于檢測突變基因的mRNA和腫瘤的表達。細胞死亡伴隨著RNA在血液中迅速降解,而非細胞碎片或是游離RNA。因此在RT-PCR過程中,腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展情況完全可以通過檢測RNA來實現(xiàn)。大量研究表明RT-PCR與免疫細胞化學相比較的的敏感性要高很多[3-6]。RT-PCR的優(yōu)勢在于能夠避免PCR產(chǎn)物的污染,操作簡便可控性能高,線性范圍寬及精密度好。RNA提取效率高,精密度測試結(jié)果表明本此方法具有良好的重復(fù)性[7]。本研究線性相關(guān)性好,對于加入外周血的樣品,在一定的濃度其測量值影響不大。然而,由于樣品的污染是不可避免的,游離RNA和基因組DNA的存在使正常細胞表達具有一定的干擾性,RT-PCR的結(jié)果容易受假陽性的影響,不過可以通過添加脫氧核糖核酸酶和增加密度梯度來消除上述影響。核酸的檢測方法敏感性較高但是特異性對結(jié)果不是很靈敏。定量RT-PCR能夠使腫瘤細胞mRNA和正常細胞表達鑒別更加準確,但是由于組織特異性標志物的不足仍是目前研究中的最大難題。本研究將絨癌細胞株(JAR細胞)摻入滋養(yǎng)細胞外周血液中,來檢測β-hCG-mRNA,以此檢測值推算血液中的細胞量,并以此推算患者外周血中腫瘤細胞的量。本研究結(jié)果顯示,盡管FQ-PCR法在JAR細胞表達的mRNA量檢測在檢測結(jié)果比較精密,但是當JAR細胞與外周血在一起后分離,只有在每10 ml血中超過103時方能檢測到,而且隨著JAR細胞數(shù)量的增加,FQ-PCR所要求的循環(huán)數(shù)相應(yīng)的呈減少的態(tài)勢,呈現(xiàn)比較理想的負性線性關(guān)系。

選用適當?shù)哪[瘤標志物是對腫瘤外周血液中腫瘤細胞進行檢測成功與否的關(guān)鍵因素,本研究選用絨癌細胞株(JAR細胞)為標志物,在臨床上具有一定的可行性,與以往的文獻報道一致[8]。認為此種檢測方法在臨床上有一定的應(yīng)用價值,可以考慮進行進一步的研究,以利于腫瘤工作的預(yù)防性檢測工作。

[1]Wittekind C,Neid M.Cancer invasion and metastasis[J].0cology,2005,69(Suppl 1):14.

[2]郭君紅,鄒 麗.RECK基因與基質(zhì)金屬蛋白酶-2相關(guān)性在早孕滋養(yǎng)細胞侵襲調(diào)控中的作用[J].實用醫(yī)學雜志,2007,23(5):639.

[3]唐 薇.王自能,金海燕.米非司酮對人早孕期絨毛中滋養(yǎng)細胞血管內(nèi)皮生長因子表達的影響[J].實用醫(yī)學雜志,2006,22(6):645.

[4]Pachmann K,Clement JH,Sehneider CP,et al.Standardizedquantification of circulating peripheral tunlor cells from lung and breast cancer[J].Clin Ctmm Lab Med,2005,43(6)617.

[5]朱晴暉,陸青等.熒光定量-逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)測定IL2-mRNA和IL-4 mRNA方法的建立及其應(yīng)用[J].中華微生物學和免疫學雜志,2006,26(2):185.

[6]Niesters HG.Quntitation of viral load using real2time amplification techniques[J].Method,2001,25:419.

[7]蔣蔚峰.外周血循環(huán)腫瘤細胞檢測的研究進展[J].臨床腫瘤學雜志,2010,15(10):944.

[8]呂時銘,石一復(fù).外周血腫瘤標志物檢測進展[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2004,27(11):769.