EphA2和E-cadherin蛋白在腎透明細胞癌中表達及其意義

段有軍,李解方,曹友漢,劉志文

(南華大學(xué)附一院泌尿外科,湖南衡陽421001)

EphA2受體是已發(fā)現(xiàn)14種生促紅素人肝細胞(Erythropoietin-producing hepatoma cell line,Eph)受體中的一員,其基因位于被認(rèn)為是腫瘤“熱點”的染色體lp36.1[1]。EphA2基因是腫瘤相關(guān)基因,EphA2蛋白在多種人體腫瘤組織中過度表達,且過度表達與腫瘤的惡性程度及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]。上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)基因是腫瘤抑制基因,E-cad蛋白調(diào)節(jié)細胞與細胞間、細胞與細胞外基質(zhì)間黏附反應(yīng),對維持組織形態(tài)結(jié)構(gòu)起重要作用,其表達減弱可以引起多種腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移[3]。國內(nèi)關(guān)于EphA2和E-cad兩種蛋白在腎透明細胞癌方面的研究很少見報道。本實驗采用免疫組化SP法檢測EphA2與E-cad蛋白在腎透明細胞癌組織(RCCC)中的表達及二者相關(guān)性,這對于預(yù)測腎透明細胞癌轉(zhuǎn)移、評估預(yù)后以及制訂合理治療方案具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本采集與制備 收集74例來自南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院、第二附屬醫(yī)院自1999年至2008年存檔腎透明細胞癌石蠟標(biāo)本。28例正常腎組織標(biāo)本均取自腎破裂行腎切除的腎臟,病理診斷為正常腎組織。標(biāo)本均由10%福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋。蠟塊切片,做免疫組織化學(xué)染色?；仡櫡治鋈脒x病例的臨床特征:年齡29-71歲,平均年齡42.3歲;腫瘤大小1.5-10.5 cm,平均5.6 cm;根據(jù) 2002年AJCC腎癌臨床分期:Ⅰ期13例,Ⅱ期20例,Ⅲ期36例,Ⅳ期5例。經(jīng)病理證實無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例。所有石蠟標(biāo)本(包括NK、RCCC)均連續(xù)切片,片厚約4 μ m,共6張。其中1張作常規(guī)HE染色,2張作EphA2,E-cad免疫組化染色,1張以PBS液代替抗體作為陰性對照,其余2張備用。

1.2 免疫組化染色(SP法)檢測 采用SP二步法。濃縮型兔抗人EphA2多克隆抗體購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司,濃縮型兔抗人E-cad單克隆抗體、免疫組織化學(xué)染色SP試劑盒和即用型DAB試劑盒、多聚賴氨酸購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。石蠟切片經(jīng)抗原修復(fù)和血清封閉后,在切片上滴加1∶1 000抗EphA 2抗體及 1∶130抗E-cad抗體,4℃過夜,次日滴加1∶200生物素標(biāo)記的第二抗體及鏈霉菌抗生物素2過氧化物酶,DAB顯色,蘇木精對比染色,用已知EphA2蛋白陽性染色的乳腺癌石蠟切片為陽性對照,E-cad陽性染色的正常胃組織石蠟切片為陽性對照,以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷 EphA2及E-cad染色程度判斷:染色結(jié)果以染色強度結(jié)合陽性細胞數(shù)百分比綜合計分作半定量分析[3-4]。組織切片中胞質(zhì)染為淡黃色至棕褐色者為陽性細胞標(biāo)志。染色強度以多數(shù)細胞呈現(xiàn)的染色特性(染色深淺需與背景著色相對比)計分:0分為無色,1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色。陽性細胞百分比即某類細胞5個視野(每400×高倍視野計數(shù)100個此類細胞)的陽性細胞平均數(shù):0分為陰性,1分為陽性細胞≤10%,2分為11%-50%,3分為51%-75%,4分為＞75%。染色強度與陽性細胞百分比的乘積0-2分為陰性,記作“-”;3-12分為陽性,記作“+”。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 EphA2及E-cad蛋白表達與各臨床病理指標(biāo)的關(guān)系應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計學(xué)軟件,采用χ2檢驗。相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析。以P＜0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EphA 2蛋白的表達 EphA2蛋白在腎透明細胞癌組織中的表達明顯高于正常組織(P＜0.05)(圖1和表1);隨著腎透明細胞癌臨床分期的升高,EphA 2蛋白的表達逐漸增加(P＜0.05)(表2);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)(表 3)。

表1 EphA2蛋白在NK、RCCC組織中的表達

圖1 EphA2蛋白在 NK中(A)和 RCCC中(B)的表達(SP×400)

表2 EphA2蛋白在RCCC不同臨床分期中的表達

表3 EphA2蛋白在RCCC無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達

2.2 E-cad蛋白的表達 E-cad蛋白在腎透明細胞癌組織中的表達明顯低于正常組織(P＜0.05)(圖2,表4);隨著腎透明細胞癌臨床分期的升高,E-cad蛋白的表達逐漸減少(P＜0.05)(表5);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)(表6)。EphA2蛋白和E-cad蛋白的表達在腎透明細胞癌患者中呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。

圖2 E-cad蛋白在NK中(A)和RCCC中(B)的表達(SP×400)

表4 E-cad蛋白在 NK、RCCC組織中的表達

表5 E-cad蛋白在RCCC不同臨床分期系統(tǒng)中的表達

表6 E-cad蛋白在RCCC無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達

2.3 EphA2與E-cad在RCCC中表達的相關(guān)性

74例腎透明細胞癌組織中,經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析(r=-0.404,P＜0.05),說明EphA2與E-cad在腎透明細胞癌中的表達有密切關(guān)系且呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

本研究結(jié)果還顯示,EphA2蛋白和E-cad蛋白在RCCCⅢ-Ⅳ期組中的表達分別明顯高于和低于Ⅰ-Ⅱ期,在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性表達率分別明顯高于和低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,提示EphA2蛋白的過表達和E-cad蛋白的低表達與RCCC臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。EphA2的過表達不僅能導(dǎo)致正常細胞的惡性轉(zhuǎn)化,而且能增強腫瘤細胞向外侵襲的能力,這是通過消弱腫瘤細胞之間的連接,增強腫瘤細胞和ECM的黏附和增強在基質(zhì)的侵襲等幾方面實現(xiàn)的[2]。Herrem等[5]在對34例腎細胞癌(RCC)患者的腫瘤組織的研究中發(fā)現(xiàn),不管其組織病理學(xué)分級如何,EphA2蛋白高表達的RCC腫瘤其臨床分期更高更容易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。因此我們認(rèn)為EphA2蛋白參與了RCCC的臨床進展,對判定患者的預(yù)后提供一定參考。E-cad蛋白表達減少或缺失則使腫瘤細胞喪失接觸抑制而無限制增生,失去分化,細胞間連接松散,易于脫落并獲得較強的侵襲能力,極易擴散和轉(zhuǎn)移。在多種常見腫瘤中都發(fā)現(xiàn)E-cad蛋白表達水平明顯降低,且下降水平與腫瘤組織侵襲性生長和遠處轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)[10],因此認(rèn)為E-cad蛋白與腫瘤的分化程度和侵襲能力密切相關(guān)。本實驗的結(jié)果亦提示E-cad蛋白促進了RCCC的臨床進展。

研究發(fā)現(xiàn)在上皮細胞,EphA2蛋白在細胞與細胞連接區(qū)的定位需要E-cad蛋白調(diào)節(jié)[11]。在EphA2蛋白與配體結(jié)合及降解過程中,E-cad蛋白的調(diào)控起到了關(guān)鍵性的作用,因為E-cad蛋白表達的下降及功能的缺失導(dǎo)致細胞間的黏附性降低,一方面引起EphA2蛋白受體磷酸化障礙及降解減少,使EphA2蛋白受體和配體不能有效結(jié)合,使失磷酸化EphA2蛋白聚積及功能障礙,進而觸發(fā)了致癌信號級聯(lián),另一方面使得癌細胞容易脫離黏附,游離、播散,侵襲性增強。本研究結(jié)果顯示EphA2蛋白表達與E-cad蛋白表達呈負(fù)性相關(guān),推測兩者對于RCCC的發(fā)生、發(fā)展及惡性侵襲性有促進作用。

本研究結(jié)果揭示EphA2蛋白過高表達、E-cad蛋白的低下表達可能與RCCC的發(fā)生有關(guān),同時促進了臨床進展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。同時也表明E-cad蛋白與EphA2蛋白在腎透明細胞癌中存在負(fù)相關(guān),二者的檢測可作為RCCC的預(yù)后評估的一個指標(biāo)。

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