膽囊腺癌pAKT、VEGF、微血管和微淋巴生成的檢測(cè)及其臨床意義

王甘露,姜漢國,黃 婷,賀 德,侍立志,陳 暉

(1.深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院 外一科,廣東深圳518101;2.廣東醫(yī)學(xué)院病理教研室,廣東湛江524023)

近二十多年分子生物學(xué)的研究表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的跨膜信息傳遞機(jī)制密切相關(guān)。目前,許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT(磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸激酶)信號(hào)傳導(dǎo)通路異常改變與人類一些惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-5]。膽囊腺癌是較少見的一類惡性腫瘤,多見于60歲以上的女性,早期診斷困難;一旦臨床確診,絕大多數(shù)已發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移,預(yù)后差。有關(guān)膽囊腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前尚不清楚,為探索PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路異常是否與其發(fā)生發(fā)展相關(guān),本研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)臨床46例膽囊腺癌組織中pAKT、VEGF的表達(dá)及其微血管密度(MVD)和微淋巴管密度(MLD),旨在探討它們對(duì)膽囊腺癌發(fā)生發(fā)展的影響。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院和廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2003年1月至2008年12月資料完整的46例膽囊腺癌根治術(shù)標(biāo)本,患者術(shù)前均未經(jīng)過任何抗腫瘤治療。46例中男11例,女35例,中位年齡62歲;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例。另選取膽囊腺瘤和慢性膽囊炎各10例作為對(duì)照組。全部標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛液固定,石蠟包埋,5 μ m厚連續(xù)切片待測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 常規(guī)HE染色,膽囊腺癌分別按WHO分型及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行分組。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 免疫組化按SP試劑盒說明書步驟操作。由試劑公司提供的乳腺癌pAKT和VEGF陽性切片為陽性對(duì)照,PBS代替1抗作為空白對(duì)照?？笴D34、CD31和D2-40單克隆抗體及免疫組織化學(xué)試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,pAKT(S473)和VEGF多克隆抗體購自Cell Signaling公司。分別應(yīng)用抗血管內(nèi)皮CD31和CD34單克隆抗體雙標(biāo)和D2-40單克隆抗體來檢測(cè)膽囊腺癌組織中的MVD和MLD。

1.3 結(jié)果判斷 pAKT、VEGF、CD34、CD31 和 D2-40定位于細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。陽性細(xì)胞＞10%為陽性表達(dá)。MVD和MLD按文獻(xiàn)[6,7]計(jì)數(shù),即在低倍鏡下選擇癌灶周圍間質(zhì)血管密集區(qū),用400×高倍視野內(nèi)計(jì)數(shù)4個(gè)不同區(qū)域的微血管和微淋巴管,取其平均值為微血管和微淋巴管密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0。根據(jù)資料類型和統(tǒng)計(jì)目的不同分別做四格表 χ2檢驗(yàn),Spearman相關(guān)分析,獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pAKT和VEGF在膽囊炎、膽囊腺瘤和膽囊腺癌組織中的表達(dá) 在10例膽囊炎和膽囊腺瘤組織中,pAKT和VEGF陽性表達(dá)率分別為20.0%(2/10)、40.0%(4/10)和40.0%(4/10)、60.0%(6/10)。在慢性膽囊炎,pAKT陽性細(xì)胞主要呈灶性分布于膽囊黏膜腺體,腺體之間的間質(zhì)散在的陽性;VEGF陽性細(xì)胞除膽囊黏膜腺體外,腺體之間的間質(zhì)和血管也可見散在的陽性(圖1)。在膽囊腺瘤,pAKT和VEGF陽性細(xì)胞表達(dá)范圍和強(qiáng)度明顯增加(圖2)。46例膽囊腺癌pAKT和VEGF的陽性表達(dá)率分別為87.0%(40/46)和91.3%(42/46)。膽囊腺癌pAKT和VEGF陽性細(xì)胞彌漫并多聚集成團(tuán)(圖3,4)。從整體看,膽囊炎和膽囊腺瘤組織中pAKT和VEGF陽性反應(yīng)強(qiáng)度和范圍較癌組織明顯減弱。膽囊炎、膽囊腺瘤和膽囊腺癌中pAKT和VEGF的陽性表達(dá)率有非常顯著性差異(P＜0.01),見表1。

2.2 pAKT、VEGF表達(dá)與膽囊腺癌臨床病理參數(shù)及微血管和微淋巴管密度關(guān)系 pAKT的陽性表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P＜0.05)。MVD與腫瘤生長(zhǎng)方式和臨床分期顯著相關(guān)(P＜0.05;P＜0.01);MLD與腫瘤生長(zhǎng)方式和淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移有非常顯著差異(P＜0.01)見表2。腫瘤組織中的微血管在腫瘤中央?yún)^(qū)及周邊區(qū)均均勻分布,并呈不同程度的擴(kuò)張狀態(tài),尤其在浸潤癌組織周圍微血管較多(圖5)。腫瘤組織中淋巴管主要分布在腫瘤邊緣區(qū),該區(qū)淋巴管分布較為密集呈不同程度的擴(kuò)張狀態(tài),甚至可見淋巴管內(nèi)的瘤栓,而腫瘤中心區(qū)淋巴管分布較稀疏,多呈條索狀,甚至是殘缺狀態(tài)或未見有淋巴管分布(圖6)。

表1 pAKT和VEGF在膽囊腺癌旁組織及膽囊腺癌中的表達(dá)(例,%)

表2 pAKT、VEGF表達(dá)與膽囊腺癌臨床病理參數(shù)及微血管、微淋巴管的關(guān)系

2.3 膽囊腺癌組織pAKT、VEGF陽性表達(dá)與MVD和MLD的相關(guān)性 40例pAKT陽性組的MVD為29.6±5.4,陰性組MVD為 23.5±4.2,陽性組的MVD明顯高于陰性組;42例VEGF陽性組的MVD為29.5±5.2,4例陰性組MVD為22.3±3.6,兩組的MVD之間有顯著性差異,Spearman相關(guān)分析表明膽囊腺癌的pAKT和VEGF表達(dá)與MVD呈正相關(guān)。pAKT陽性組的MLD為8.0±2.4陰性組MLD為4.6±1.9,陽性組的MVD明顯高于陰性組;42例VEGF陽性組的MLD為7.9±2.5,4例陰性組MVD為7.8±2.9,兩組的MLD之間無顯著性差異,Spearman相關(guān)分析表明膽囊腺癌的pAKT表達(dá)與MLD呈正相關(guān),見表 3。

表3 pAKT、VEGF表達(dá)與膽囊腺癌微血管及微淋巴管的相關(guān)分析(Spearman相關(guān)分析)

圖1 慢性膽囊腺炎組織pAKT陽性表達(dá),SP×100

圖2 慢性膽囊腺炎組織pAKT陽性表達(dá),SP×100

圖3 膽囊腺癌組織pAKT呈陽性表達(dá),SP×200

圖4 膽囊腺癌組織VEGF呈陽性表達(dá),SP×200

圖5 膽囊腺癌組織微血管密度,SP×100

圖6 膽囊腺癌組織微淋巴管密度,SP×100

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中,免疫組化的結(jié)果表明,膽囊腺癌pAKT、VEGF陽性表達(dá)率明顯高于慢性膽囊炎和膽囊腺瘤,它們之間的陽性表達(dá)率有非常顯著性差異(P＜0.01)。pAKT的陽性表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P＜0.05)。MVD與腫瘤生長(zhǎng)方式和臨床分期顯著相關(guān);MLD與腫瘤生長(zhǎng)方式和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有非常顯著差異(P＜0.01)。pAKT和VEGF陽性組的MVD明顯高于其陰性組,Spearman相關(guān)分析表明膽囊腺癌的pAKT和VEGF表達(dá)與MVD呈正相關(guān)。pAKT陽性組的MLD的MVD明顯高于陰性組,Spearman相關(guān)分析表明膽囊腺癌的pAKT表達(dá)與MLD呈正相關(guān),而VEGF陽性組的MLD與陰性組之間無顯著性差異。這些結(jié)果揭示pAKT、VEGF和膽囊腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。到目前為止,pAKT促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制并不完全清楚,現(xiàn)在的研究提示可能是通過促進(jìn)腫瘤組織中血管和淋巴管的新生而影響[8,9]。眾所周知,腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管和淋巴管的形成,從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,pAKT主要通過VEGF影響了膽囊腺癌的微血管和微淋巴管的生成。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明,主要是在血管生成因子VEGF和PDGF的作用下,腫瘤細(xì)胞通過EGF(epidermal growth factor,表皮生長(zhǎng)因子)/PI3K/AKT/FRAP通路促進(jìn)腫瘤血管和微淋巴管形成和生長(zhǎng)。也有學(xué)者提出pAKT可通過其它途徑影響膽囊腺癌的發(fā)生、微血管和微淋巴管生成和轉(zhuǎn)移[10,11]。我們的結(jié)果提示MLD在膽囊腺癌的轉(zhuǎn)移中的作用密切相關(guān),而MVD可能與腫瘤的生長(zhǎng)關(guān)系更為密切。

綜上所述,PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路參與了膽囊腺癌的發(fā)生發(fā)展,其中pAKT可能通過調(diào)節(jié)VEGF而影響膽囊腺癌新生血管和微淋巴管的形成,從而與其轉(zhuǎn)移密切相關(guān),這提示阻斷PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路將對(duì)膽囊腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

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