AZT對胃癌細(xì)胞SGC7901端粒酶活性的影響

于金海,劉國輝

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院1.胃腸外科;2.急診科,吉林 長春130021)

近幾年的研究顯示通過抑端粒酶活性,干預(yù)端粒酶的激活過程,阻斷腫瘤細(xì)胞的亞性轉(zhuǎn)化,在腫瘤治療上有重要意義和巨大的潛力[1]。本研究通過端粒酶抑制劑3-疊氮脫氧胸苷(3-azido-deoxythymidine,AZT)作用于人胃癌細(xì)胞SGC7901,比較AZT作用后癌細(xì)胞端粒酶活性的變化,并利用缺口末端標(biāo)記技術(shù)【terminal deoxyribonucleotidyl transferse(TdT)-mediated biotin-16dUTP nick end labeling,TUNEL】和流式細(xì)胞術(shù)檢測AZT作用后腫瘤作用后胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡情況,進而探討AZT抑制腫瘤細(xì)胞端粒酶可能的機制,為端粒酶抑制劑的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人胃癌細(xì)胞株SGC7901及其培養(yǎng)基由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院提供。

1.2 主要試劑和儀器

AZT為德國默克公司產(chǎn)品;1250胰蛋酶為羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品;新生牛血清購自武漢達邦生物科技有限公司;注射用青霉素鈉購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司;注射用硫酸鏈霉素購自大連美羅大藥廠;PBS購自武漢博士德生物公司;DMSSO購自廣州新港化工有限公司;DEPC購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;SYBR Green I熒光染料購自上海物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;端粒酶活性檢測試劑盒(TRAP-ELISA)為Sigma產(chǎn)品;細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自BoehringerMannheim公司;Annexin V-FITC試劑盒購自 Beckman Coulter公司;美國Bio-Rad公司的icycleriQ實時熒光定量PCR儀;德國Leica的DMR+Q550病理圖像分析儀;美國Becton Dickinson,FACS Calibur流式細(xì)胞儀;

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞毒性實驗(MTT法)

具體操作方法參見文獻[2]。實驗組為AZT處理的胃癌細(xì)胞SGC7901,對照組為不加任何處理因素的胃癌細(xì)胞SGC7901。MTT作用濃度分別為:2 mmol/L,4 mmol/L,8 mmol/L,16 mmol/L,32 mmol/L,作用時間分別為:12 h,24 h,36 h,48 h。通過MTT實驗確定AZT作用最佳作用濃度和時間。

1.4 實時熒光定量端粒重復(fù)序列擴增(real-time fluorescent quantitative TRAP assay,FQ-TRAP)法檢測端粒酶活性

1.4.1 端粒酶提取液的準(zhǔn)備 收集實驗組和對照組細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml,參照端粒酶TRAP-ELISA試劑盒說明書操作。

1.4.2 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系包括 反應(yīng)混合物(TRAP-ELISA 試劑盒溶液 2)12.5 μ l,模板 1 μ l,20×SYBR Green I 1.25 μ l,焦碳酸二乙酯(DEPC)水10.25 μ l。25℃引物延伸 30 min,94℃端粒酶滅活 5 min,94 ℃30 s、50℃30 s、72℃90 s,共進行 40個循球,最后72℃延伸10 min,實驗重復(fù)4次。

1.4.3 結(jié)果判定 以4次實驗平均閥限循環(huán)值(cycle threshold,CT)(±s)表示端粒酶活性。CT值大者,模板數(shù)小,表示端粒酶活性低。CT值小者,模板數(shù)大,表示端粒酶活性高。用SPSS10.0For windows軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計公析。根據(jù)實驗組CT值對照CT值,可計算AZT作用后癌細(xì)胞端粒酶活性下調(diào)率。計算公式為:端粒酶活性下調(diào)率=(實驗組平均CT值-對照組平均 CT值)/對照組平均CT值×100%。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測

1.5.1 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 收集實驗組和對照組細(xì)胞,消化制成1×105/ml的單細(xì)胞懸液。按照試劑盒說明書的要求進行操作。Leica病理圖像分析儀進行凋亡分析,以細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞。400倍光鏡下隨機計數(shù)300個細(xì)胞計算凋亡細(xì)胞的比率。

1.5.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 收集實驗組和對照組細(xì)胞,消化制成單細(xì)胞懸液。按照Annexin V-FITC試劑盒說明書進行操作。在流式細(xì)胞儀上記錄激發(fā)波長488 nm處的紅色熒光。

2 結(jié)果

2.1 AZT的作用濃度、作用時間與細(xì)胞抑制率的關(guān)系

MTT實驗結(jié)果見表1。

表1 不同濃度AZT作用于SGC7901胃癌細(xì)胞后細(xì)胞存活率

2.2 FQ-TRAP法檢測AZT作用后癌細(xì)胞端粒酶活性變化

以16 mmol/L濃度AZT作用于SGC7901胃癌細(xì)胞36 h后,FQ-TRAP檢測顯示,實驗組CT值為31.0±0.8,對照組CT值為16.5±0.6兩組有顯著性差異(P＜0.001)。這說明AZT對SGC7901胃癌細(xì)胞的端粒酶活性有明顯的抑制作用。同時計算端粒酶活性的下調(diào)率,結(jié)果顯示AZT對SGC7901胃癌細(xì)胞端粒酶活性的下調(diào)率為54.7%。

2.3 細(xì)胞凋亡的檢測

AZT作用36 h后,利用TUNEL法在光學(xué)顯微鏡下觀察到實驗組出現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,即貼壁由伸展的鋪路石樣變?yōu)闄E圓形,細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞之間的聯(lián)接變得松散,部分貼壁的細(xì)胞開始脫壁;而對照組沒有出現(xiàn)此類改變(見圖1,2)Annexin V-FITC法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡率,對照組的凋亡率為1.43%,實驗組凋亡率為14.6%(見圖3,4)。

圖1 AZT作用36 h后凋亡細(xì)胞形態(tài)變化

圖2 對照組36 h后凋亡細(xì)胞形態(tài)變化

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測AZT作用后凋亡率

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測對照組凋亡率

3 討論

端粒酶是合成端粒酶DNA的特殊逆轉(zhuǎn)錄酶,具有RNA依賴性和DNA多聚酶性質(zhì)的核糖蛋白復(fù)合體,能以自身RNA為模板,不斷合成端粒DNA序列,保持染色體端粒的完整性。研究顯示,在幾乎所有惡性腫瘤及永生細(xì)胞中都有陽性表達,而在絕大部分正常體細(xì)胞(除生殖細(xì)胞、造血干細(xì)胞及表皮基底細(xì)胞等少數(shù)細(xì)胞外)及良性腫瘤組織中則為陰性或表達率極低,它是目前已知的最廣譜的惡性腫瘤標(biāo)志物之一[3,4]。端粒酶活性與惡性腫瘤之間的高度相關(guān)性使端粒酶成為近年來腫瘤治療研究的新熱點,端粒酶活性高低與腫瘤的治療及預(yù)后有一定關(guān)系,對端粒酶活性的抑制是治療惡性腫瘤的可能新途徑之一[5,6]。

AZT屬核苷類似物,是一種逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑,可以和正常的單核苷酸競爭與RNA模板結(jié)合并抑制細(xì)胞內(nèi)部逆轉(zhuǎn)錄酶的活性,在DNA復(fù)制時亦可摻入繼而使復(fù)制過程中止,因此,AZT可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性,從而達到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。研究發(fā)現(xiàn),AZT對體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞、結(jié)直腸細(xì)胞、乳腺癌及肺癌細(xì)胞均有抑制作用。本研究觀察到AZT在體外可以明顯抑制SGC7901胃癌細(xì)胞的端粒酶活性,對其端粒酶活性下調(diào)率為54.6%,這與相關(guān)研究的結(jié)果是一致的。

[1]Yang SM,Fang DC,Luo YH,et al.Alterations of telomerase activity ang terminal restriction fragment in gastric cancer and its premalingnant lesions[J].J Gastroenterol Hepatol,2001,16(8):876.

[2]Jong HS,Park YI,KimS,et al,Up-regulation of human telomerse catalytic subunit during gastric carcinogenesis[J].Cancer,1999,86(4):559.

[3]Lechel A,MannsMP,Rudolph KL,Telomeres and telomerase:new targets for the treatment of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma[J].J Hepatol,2004,41(3):491.

[4]Xie C,Li Y,Tang W,et al,Study of dynamical process of heat denaturation in optically trapped single microorganisms by near-infrared Raman spectroscopy[J].J Appl Phys,2003,94(9):6138.

[5]Hsu YL,Kuo PL,Chiang LC,ET AL,involvement of p53,nuclearfactor kappab and Fas/Fas ligand in induction of apoptosis and cell cycle arrest by saikosaponind in human hepatoma cell lines[J].Cancer-Lett,2004,213:213.

[6]Zhang YH,Peng HY,Xia GH,et ai.Anticancer effect of two diterpenoid compounds isolated from Snnona glabra Linn[J].Acta-Pharmacol-Sin,2004,25:937.