銀杏葉提取物對(duì)糖尿病大鼠腎臟組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶表達(dá)的影響

鄒穎剛,劉 輝,蘇 青,魏海峰,于曉艷*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林長(zhǎng)春130041;2.吉林大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥理與毒理教研室;3.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)系;4.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科)

近年來(lái),有學(xué)者將銀杏葉提取物(GBE)應(yīng)用在糖尿病腎病的實(shí)驗(yàn)研究中,證明其對(duì)腎臟功能有明顯保護(hù)作用[1,2],但具體機(jī)制還不清楚。本文擬探討GBE對(duì)糖尿病大鼠腎臟組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)的影響,從細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解角度探討GBE的腎臟保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 體重200-220 g的雄性Wistar大鼠30只,鼠齡6-8 w,由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素STZ(Sigma),銀杏葉提取物(2005版)(江蘇徐州華康生物制品有限公司),TRIZOL(Invitrogen公司),逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptⅡ(北京Trans Gene公司),TaqDNA聚合酶(北京 Trans Gene公司),PCR引物(上海捷瑞生物工程有限公司),兔抗大鼠tTG多克隆抗體(Sant Cruz公司),SDS-電泳試劑(Sigma)。

1.3 糖尿病(DM)模型的制備 單次腹腔注射STZ(50 mg/kg)誘發(fā)糖尿病。

1.4 動(dòng)物分組 將糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病組(DM)10只,銀杏葉提取物組(GBE)10只,另設(shè)正常對(duì)照組(Control)10只。銀杏葉提取物組(GBE)灌胃銀杏葉提取物100 mg/kg體重/d。正常對(duì)照組和糖尿病組僅灌胃給予自來(lái)水,連續(xù)12 w。于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1天收集24 h尿液,雙縮脲法測(cè)定尿蛋白濃度。大鼠處死后部分腎臟進(jìn)行PAS染色,其余-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 Western Blot檢測(cè)各組大鼠腎臟tTG蛋白表達(dá)水平 用凝膠成像及分析系統(tǒng)分析蛋白顯色的灰度值,計(jì)算tTG/GAPDH灰度比值。

1.6 RT-PCR檢測(cè)各組大鼠腎臟tTG mRNA的表達(dá)水平

引物序列GAPDH:上游:5'-ACCACAGTCCATGC-CATCAC-3',下游:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3',擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為452 bp;tTG:上游:5'-GGCAATGACTTTGACGTGTTTG-3';下游:5'-ATACAGGGAATCAGAAAGTGGGTTC-3',擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為396 bp。以GAPDH校正作相對(duì)量分析,應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)算tTG/GAPDH灰度比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組血糖、尿白蛋白比較 與正常對(duì)照組比較,DM 組血糖(22.19±2.50 mmol/L)、24 h尿白蛋白排泄量(355.78±20.34 μ g/24 h)明顯升高 ,說(shuō)明動(dòng)物已出現(xiàn)明顯腎臟功能改變。與DM組比較,GBE組大鼠24 h尿蛋白排泄量(301.58±28.63 μ g/24 h)明顯減少(P＜0.05),血糖(20.02±4.96 mmol/L)無(wú)明顯變化。

2.2 PAS染色光鏡觀察 對(duì)照組腎小球、腎小管形態(tài)正常,DM組腎小球系膜細(xì)胞增生,PAS陽(yáng)性物質(zhì)明顯增多,GBE組系膜細(xì)胞增生較糖尿病組減輕,系膜區(qū)PAS陽(yáng)性物質(zhì)明顯減少(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組大鼠腎臟PAS染色

2.3 Western Blot檢測(cè)各組大鼠腎臟tTG蛋白表達(dá)水平

圖2 各組大鼠腎臟tTG蛋白表達(dá)

由圖2分析腎臟皮質(zhì)Western Blot的檢測(cè)結(jié)果,tTG在正常組織中表達(dá)較少(0.21±0.12),在糖尿病腎臟中表達(dá)明顯增加(0.47±0.18,P＜0.01),在GBE組中tTG的表達(dá)(0.29±0.07)與DM組比較明顯降低(P＜0.01)。

2.4 RT-PCR檢測(cè)各組大鼠腎臟tTG mRNA的表達(dá)水平

由圖3分析tTG mRNA在DM組大鼠腎臟中的表達(dá)(3.01±0.42)與對(duì)照組(1.35±1.02)相比顯著增加(P＜0.01),GBE組(2.21±1.14)tTG mRNA的表達(dá)與DM組相比明顯下降(P＜0.05)。

圖3 各組大鼠腎臟mRNA表達(dá)

3 討論

以往臨床研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)銀杏葉治療的DN患者尿白蛋白顯著降低,腎臟結(jié)構(gòu)特別是濾過(guò)膜病變明顯減輕,在基礎(chǔ)研究中同樣發(fā)現(xiàn)銀杏葉對(duì)糖尿病大鼠腎結(jié)構(gòu)功能具有保護(hù)作用。本試驗(yàn)中我們也得到了相同的結(jié)果,給予GBE的糖尿病大鼠尿蛋白排泄率明顯降低,PAS染色顯示ECM(PAS染色陽(yáng)性物質(zhì))較糖尿病組含量減少。

GBE可通過(guò)多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)腎臟保護(hù)作用,如抗自由基損傷、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的形成,保護(hù)細(xì)胞膜不受自由基損害,提高抗氧化能活性[3,4]等。本試驗(yàn)僅從ECM積聚角度討論。ECM積聚是糖尿病腎病最基本的病理變化。合成增加和降解減少都可導(dǎo)致ECM積聚,而降解酶系統(tǒng)(纖溶系統(tǒng)和基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng))被抑制、tTG表達(dá)和活性增加均可引起降解減少。侯淑芬等人的研究表明GBE可調(diào)節(jié)腎臟內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)中MMP-9、TIMP-1、織纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)以及Ⅳ型膠原mRNA的表達(dá)從而減輕腎小球ECM積聚[1.2]。而GBE對(duì)糖尿病腎臟tTG的影響此前尚無(wú)報(bào)導(dǎo)。在我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)無(wú)論是蛋白水平,還是mRNA水平,GBE均能降低糖尿病大鼠tTG的表達(dá),并且與ECM量(PAS陽(yáng)性物質(zhì))趨勢(shì)相同,表明GBE可通過(guò)降低tTG的表達(dá)緩解ECM積聚。結(jié)合其他研究學(xué)者的研究結(jié)果,可以推斷GBE對(duì)ECM積聚多種途徑(ECM合成、降解酶系及調(diào)節(jié)ECM抵抗蛋白降解酶的水解作用)均有影響。

總之,我們此次研究結(jié)果表明糖尿病狀態(tài)下,tTG活性下降是GBE腎臟保護(hù)作用的機(jī)制之一。

[1]侯淑芬,張海松,劉占全,等.銀杏黃酮苷對(duì)糖尿病大鼠腎組織病理變化的影響[J].中國(guó)誤診學(xué)雜志,2005,5(6):1012.

[2]陳三妹,李 紅,王 芳,等.銀杏葉提取物對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能的影響[J].中國(guó)病理生理雜志,2006,22(8):1654.

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